Name: ショウ ジョウバエのメラノガスター モデルの開発による心機能のイメージングと光遺伝学的制御 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学ぼう、Drosophila melanogasterを用いた光干渉断層法イメージングと光遺伝学的ペーシングによる心機能の非侵襲的制御法。この手法は不整脈治療への応用可能性を示し、心疾患研究に新たなアプローチを提供する。

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著者らは、Andrey Komarov、Yuxuan Wang、Jiantao Zhuのデータ分析への協力に感謝し、Zhou研究室のメンバーの貴重な議論に感謝している。周博士の研究室での研究は、セントルイスのワシントン大学のスタートアップ基金、国立衛生研究所(NIH)の助成金R01-EB025209とR01-HL156265、クレイコ財団の革新的研究賞によって支援されました。

本研究では、eNpHR2.0トランスジェニック株 w[*];P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, ReaChR トランスジェニック ライン w[*];P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO、および ハンド 遺伝子調節フラグメントw [1118]を含む心臓特異的GAL4ドライバー;P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (このドライバ ストックは Hand-GAL4 として表示されます) が使用されました。 y[*] w[*];P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 が GFP レポーター回線として使用されました。言及されたショウジョウバエストックは、ブルーミントン ショウジョウバエ ストックセンター(BDSC、 材料表を参照)から入手し、標準的なコーンミール培地上で室温または18°Cで維持した。本研究で開発された ショウジョウバエ モデルは、共同研究の要請に応じて入手可能である。
1 .ショウジョウバエの 遺伝的交配と培地調製
<ol><li>第3染色体バラン サーTM3 Sb[1]をTM6 Sb Tbに変更し、w[1118]を作成する。P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). 交差方式については 、補足図 1 を参照してください。通常のコーンミール培地でバイアルにクロスを設定します。 注: Tb マーカーの存在により、ユーザーはオプシン導入遺伝子およびGAL4ドライバーを含む幼虫および蛹を、オプシンを含むがドライバー25を含まない動物と区別することができる。</li>
	<li>遺伝子交配を、特別に調合された全トランス網膜I(ATR)含有培地( 材料表を参照)上の25°C、湿度70%のインキュベーターに暗所で、幼虫収集の場合は5日間、蛹収集の場合は6日間保管します。</li>
	<li>バイアルあたり、5人の ハンドGAL4 / TM6 Sb Tb 処女女性とUASオプシン株(eNpHR2.0、またはReaChR)の2〜3人の男性を組み合わせる。eNpHR2.0 および ReaChR オプシンのクロス図を、それぞれ 図 2A および 図 2B を参照してください。</li>
	<li>翌日、ATR含有培地バイアルを準備する。<ol><li>BDSC26の指示に従って半定義食品を準備します。スクロースとグルコースの代わりに、スクロース(5.14 g / 100 mL)のみを追加します。一定の攪拌で〜60°Cに冷却する。</li>
		<li>ナローフライバイアルを調製し、各バイアルに50μLの100mM ATR-エタノール溶液を加える。</li>
		<li>血清学的ピペットを用いて、フライフードを狭いフライバイアル、バイアルあたり5mLに処分する。10秒間の最高速度での渦。</li>
		<li>バイアルを差し込み、暗い布で包んで光から保護します。バイアルを少なくとも12時間(一晩)乾燥させます。</li>
	</ol></li>
	<li>翌日、ステップ1.3から着実に卵を産むハエを移します。ATR含有食品を含むバイアルに(ステップ1.4.4。バイアルでラックを光から保護します。</li>
	<li>24〜48時間後(産まれた卵の数によって異なります)、バイアルの過剰人口を防ぐために両親を捨てます。</li>
	<li>非Tb 子孫を収集し、心臓イメージングのためにそれらを使用します。 注:幼虫期と蛹期における表現型の違いを 図2Cに示します。試料作製手順の概要とおおよそのタイムラインを 図3に示します。</li>
</ol>2.ショウジョウバエの心臓の光遺伝学的制御 
<ol><li>バイアルから UAS-opsin/Hand-GAL4幼虫/ 蛹を摘み取り(ステップ1.7)、ティッシュを貼り、ペイントブラシを使用して体表面から媒体を優しく拭き取ります。</li>
	<li>顕微鏡スライドを準備し、中央に小さな両面テープを置きます。</li>
	<li>ブラシまたは細かいピンセットを使用して、幼虫/蛹をテープ表面にそっと置き、背側を上にしてスライドの長辺に垂直にします。幼虫/蛹をテープ表面に付着させるために穏やかな圧力をかける。</li>
	<li>スライドをイメージングステージの上に置き、幼虫/蛹を下に向けて置きます。</li>
	<li>レーザー制御ソフトウェアでOCT光源をオンにします( 材料表を参照)。カスタムメイドのSD-OCTコントロールソフトウェアを開き、[ プレビュー] ウィンドウをクリックします。</li>
	<li>SD-OCTソフトウェアでスキャンパラメータを設定します。 注:目標は、鼓動する心臓の最適なイメージングのためにサンプルを整列させることであり、X範囲とY範囲を選択すると、心臓の領域がカバーされます。このステップでは、A スキャンと B スキャンの両方の回数は 400 です。x方向とy方向の範囲は〜490μmと〜537μmで、それぞれ心臓の2つの直交断面(xzとyz)を示しています。</li>
	<li>マイクロマニピュレータを使用してサンプルステージを制御し、フライハートに焦点を合わせます。焦点位置を調整して、フライキューティクル表面からの光の反射を最小限に抑えます。反射を最小限に抑えるために、幼虫/蛹の表面に鉱物油を塗布することを検討してください。 注:オイルは、テープの粘着特性を損なうことにより、動物の動きのリスクを高める可能性があります。</li>
	<li>フライハートが歪み、組織によって遮断されることなく、そして無視できない影や反射なしに画像ウィンドウで完全に見えるようにしてください。それ以外の場合は、ステップ 2.7 に戻ります。</li>
	<li>MモードOCT画像取得のスキャンパラメータを設定します。 メモ: A スキャンの数は、ステップ 2.7 と比較して減少します。より速いフレームレートは、フライハート(数Hz)の鼓動ダイナミクスをキャプチャするために。Bスキャンの数は、Mモードイメージングの繰り返しフレーム数を示し、記録時間と使用可能なシステムメモリに基づいて調整できます。この実験では、128回のAスキャンで約125フレーム/秒の速度が得られ、4,000回の繰り返しBスキャンが記録され、約32秒の連続記録が得られます。</li>
	<li>赤色光刺激パルスなしで5組の制御データを取得し、安静時心拍数(RHR)を計算します。</li>
	<li>カスタムOCT制御ソフトウェアでペーシング刺激用の光パルスを設計します。「設定」で、異なる刺激プロトコルに従ってパルス周波数、パルス幅、刺激持続時間、および待ち時間を制御するために、設計された光パルスシーケンスを追加します。 注:RHRは、光照明なしで対照実験から測定され、タキペーシングおよびブレイディペーシング実験22のために光がパルス化されるべき周波数を計算するために使用される。</li>
	<li>ライトコントローラソフトウェア( 材料表を参照)を開き、赤色光パルスを生成します。「モード選択」で パルスモード を選択します。「パルスプロファイル」設定の図をダブルクリックし、 フォロワーモードを選択します。OFF強度を0のままにし、実際の電力密度を計算する際にON強度の割合を設定します。 メモ: 刺激光パルスは、ステップ 2.12 の設定に従って、OCT 制御ソフトウェアからの信号によってトリガされます。</li>
	<li>OCT制御ソフトウェアの[取得]をクリックして、光刺激でショウ ジョウバエ の心臓を鼓動させるMモードビデオ を取得します 。測定を5倍繰り返します。</li>
</ol>3. 画像解析
<ol><li>カスタム開発のフライハートセグメンテーションソフトウェアを開きます。</li>
	<li>[ファイル の選択 ]をクリックし、表示されるGUIで分析するファイルを選択します。</li>
	<li>上部のテキストボックスに、心臓領域の垂直方向と水平方向の両方の境界をピクセル単位で入力します。[ サイズ変更]をクリックします。下部のスライダーを使用して、心臓領域全体が表示され、コレクション全体のボックス全体がいっぱいになっていることを確認します。そうでない場合は、このプロセスを繰り返して境界を調整します。</li>
	<li>[予測]をクリックして、心臓領域を予測します。プログラムはコレクション内のすべてのスライスを通過し、約3分かかる心臓領域を選択します。</li>
	<li>予測が完了したら、 HRプロット をクリックします。これにより、時間の経過とともに心臓領域のプロットを表示する新しいウィンドウが開きます。正しいピークまたはバレー領域が選択されていることを確認します。 パルス を選択してから HR を選択して最終的な図を生成し、機能パラメータは.csvファイルに同時に保存されます。</li>
</ol>

<ol><li>Nature Methods. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+the+Year+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Method of the Year 2010.</a> Nature Methods. 8, 1(2011).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics%3A+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li>
<li>Tsai, H. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phasic+firing+in+dopaminergic+neurons+is+sufficient+for+behavioral+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning.</a> Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).</li>
<li>Wykes, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+and+potassium+channel+gene+therapy+in+a+rodent+model+of+focal+neocortical+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optogenetic and potassium channel gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy.</a> Science Translational Medicine. 4 (161), (2012).</li>
<li>Entcheva, E., Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+optogenetics%3A+a+decade+of+enlightenment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac optogenetics: a decade of enlightenment.</a> Nature Reviews Cardiology. 18 (5), 349-367 (2021).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li>
<li>Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y. R., Baier, H., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of cardiac function.</a> Science. 330 (6006), 971-974 (2010).</li>
<li>Nussinovitch, U., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+for+in+vivo+cardiac+pacing+and+resynchronization+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies.</a> Nature Biotechnology. 33 (7), 750-754 (2015).</li>
<li>Nyns, E. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+hybrid+bioelectronic+system+for+autogenous+restoration+of+sinus+rhythm+in+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">An automated hybrid bioelectronic system for autogenous restoration of sinus rhythm in atrial fibrillation.</a> Science Translational Medicine. 11 (481), (2019).</li>
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<li>Yu, L., Lee, T., Lin, N., Wolf, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affecting+rhomboid-3+function+causes+a+dilated+heart+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Affecting rhomboid-3 function causes a dilated heart in adult Drosophila.</a> PLOS Genetics. 6 (5), 1000969(2010).</li>
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<li>Zhu, Y. C., Yocom, E., Sifers, J., Uradu, H., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulatory+effects+on+Drosophila+larva+hearts%3A+Room+temperature%2C+acute+and+chronic+cold+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+B%2C+Biochemical%2C+Systemic%2C+and+Environmental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulatory effects on Drosophila larva hearts: Room temperature, acute and chronic cold stress.</a> Journal of Comparative Physiology. B, Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 186 (7), 829-841 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. C., Uradu, H., Majeed, Z. R., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+Drosophila+heart+rate+at+different+temperatures+and+Ca2%2B+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of Drosophila heart rate at different temperatures and Ca2+ concentrations.</a> Physiological Reports. 4 (3), 12695(2016).</li>
<li>Malloy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+optogenetics+to+assess+neuroendocrine+modulation+of+heart+rate+in+Drosophila+melanogaster+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Using optogenetics to assess neuroendocrine modulation of heart rate in Drosophila melanogaster larvae.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 203 (10), 791-806 (2017).</li>
<li>Men, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+preparation+and+longitudinal+imaging+of+heart+function+in+vivo+using+optical+coherence+microscopy+%28OCM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Drosophila preparation and longitudinal imaging of heart function in vivo using optical coherence microscopy (OCM).</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e55002(2016).</li>
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<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+Drosophila+ortholog+of+SOX5+in+heart+leads+to+cardiac+dysfunction+as+detected+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3798-3806 (2013).</li>
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</ol>

著者らには開示するものは何もありません。

オプシンの発現が心臓だけでなく周囲の筋肉組織でも駆動された以前の報告と比較して、本研究は心臓特異的ドライバー であるHand-GAL4を用いて報告している。この新しい Hand> オプシン遺伝子構成は、光遺伝学的心臓調節に使用され、以前に報告された結果をさらに確認し、より良い ショウジョウバエ の心臓血管研究モデルを確立する。
メディアの準備は、実験の成功に不可欠です。オプシンタンパク質は、リガンドである全トランスレチナール(ATR)を機能させるために28を必要とする。ハエは十分なATRを生成しないので、ATRはフライメディアに補足されなければならない。この研究では、以前に報告されたインスタント食品を半定義培地29に置き換えた。ATR含有媒体の新しいレシピは、ATRの均一な分布を確保するために導入されました。ATRは水に溶けません。エタノールベースの100mM ATRストックを水系媒体に添加すると、温かいセミディフィニション培地を含むバイアルをボルテックス処理することによって分散させる。また、以前に報告されたATR濃度は、eNpHR2.0の10 mMおよびReaChR22 の3 mMから、両方の最終濃度の1 mMに減少した。この濃度は、適切なeNpHR2.0およびReaChR機能を保証するのに十分である。
実験の成功に不可欠な要素は、FlyNet 2.027によるデータ処理の改善です。ラボは、自動化されたフライハートセグメンテーションアルゴリズムの計算効率と精度の両方を向上させるために、このソフトウェアの開発を続けています。このソフトウェアによって生成された断面マスクは、フラクショナルショートニングや心壁速度などの ショウジョウバエ の生理学的データを導出するために使用されます。このアプローチにより、最小限の人間の監督で効率的なデータ分析が可能になり、大型のハエ心臓イメージングデータセットの心臓機能をより迅速かつ確実に特徴付けることができます。
心筋梗塞は依然として主要な死因であり、心筋虚血は心不全の全症例の3分の2に寄与しており、これは米国における死亡率および罹患率の主要な原因の中で急速に出現している30。新しい治療薬や医療機器の開発には、生理学的および生化学的レベルでの心臓疾患のメカニズムに関する深い知識が必要です。これらの目標は、モデル生物の助けを借りて達成することができます。D.メラノガスターは、最も信頼性が高く効率的なモデル31,32,33,34,35の1つとしての地位を確立しています。この研究は、非侵襲的な光遺伝学的アプローチによって誘導されたシミュレートされたショウジョウバエ心臓障害モデルを生成した。非侵襲的光学式心臓ペーシング技術の開発は、従来の電気心臓ペーシング装置に代わるものを開発するための基礎を提供する。OCTを使用して心機能をリアルタイムで観察することで、ショウジョウバエモデルにおける関連する心臓生理学を正確に特徴付け、医薬品候補スクリーニングを含む高度な調査を行うことができます。OCTイメージングは、約1mmの浸透深さを有し、ショウジョウバエの心臓研究には適しているが、より大きな動物モデルにおける心機能を特徴付けるためにその使用を制限している。さらに、ショウジョウバエの研究を哺乳類のモデルに直接翻訳することは課題です。心臓血管研究のために、オプシンの感度を向上させ、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、ヒト心臓オルガノイドなどのさまざまなモデルシステムに変換するための新しい光遺伝学的ツールを開発する必要があります。

2010年末、Nature Methods誌は、オプトジェネティクスをMethod of the Year1に選出しました。光によって調節される遺伝的ツール(トランスジェニックオプシン)を使用して、前例のない精度とスピードで目的の生物学的組織を制御することは、新しいアプリケーションのための洪水の扉を開きました。今日まで、業績の大部分は神経科学に属しています。この技術は、単一ニューロン2 の精密制御の新しい方法として導入され、生体認知機能3の領域における発見に発展しました。最初から、神経科学者は生物全体の行動を調節する能力を実証しました。マウスにおけるChR2オプシンの発現および光活性化は、ドーパミン作動性ニューロンの活性化を引き起こし、行動条件付けを駆動するのに十分であった4。げっ歯類脳のてんかん焦点に送達されたハロロドプシンNpHR2.0を含むニューロンのサブセットの光遺伝学的阻害は、脳波発作の減弱をもたらした5。
心臓病学における光遺伝学的応用は、着実なペースで発展している6.ChR2は、心筋細胞培養物およびマウスにおいて首尾よく発現された。心臓のペーシングは、青色光の点滅によって実施された(生きた動物に移植された繊維を用いて実施された)7。ゼブラフィッシュでは、ChR2が発現し、ペースメイキング心臓領域を同定するために使用された。NpHR活性化は心停止を誘発した8.光遺伝学的心臓ペーシングは、新しいペーシングおよび再同期療法を開発するためのユニークな可能性を秘めています9。自家性不整脈終結系を確立する試みも最近報告されている10.
広範な研究と新しい治療法の開発には、細胞培養から哺乳類まで、さまざまなモデルシステムの適用が必要です。脊椎動物の心臓は非常に複雑な器官です。心筋細胞(CM)は、すべての心臓細胞の3分の1を構成する。他の細胞には、ニューロン、血管平滑筋細胞、および非興奮性細胞(すなわち、内皮細胞、線維芽細胞、および免疫細胞)が含まれる。CM細胞培養の研究は、得られた結果の翻訳をヒトの医療用途に限定する。哺乳類モデル生物の遺伝子操作は限られており、時間がかかる。より小さな無脊椎動物モデルには多くの利点があります。彼らの心血管系は、すべての重要な組織学的要素を運びます。ショウジョウバエメラノガスター(ショウジョウバエ)は、心疾患を含むヒト疾患に関連する遺伝子の役割を調査するための単純で強力な遺伝子モデルシステムである11、12、13。短命の動物として、ショウジョウバエは、生涯を通じて追跡できる年齢または疾患依存性の心機能変化をモデル化する絶好の機会を表しています14,15,16,17。フルーツフライの心臓管は、キューティクル表面から200μm以内の体の背側に位置し、可視光から近赤外光が心臓管に到達することを可能にする。この解剖学的特徴は、既存の光遺伝学的ツールを使用してショウジョウバエの心臓の非侵襲的な光学ペーシングを可能にする。
ショウジョウバエの心臓を監視するために、赤色光LED励起モジュールを内蔵したカスタムスペクトルドメイン光コヒーレンス断層撮影(SD-OCT)イメージングシステムが開発されました18。比較的単純なショウジョウバエ心臓の形態学的およびリズミカルな変化は、この非侵襲的な生物医学的画像化技術12、19、20、21を用いて容易に分析することができる。強化された光学的切断性能とミクロンスケールの空間分解能により、OCTは、第3齢幼虫および初期蛹18を含むさまざまな発生段階におけるショウジョウバエ心臓の構造を調査し、機能を監視するために首尾よく使用されてきた18。このシステムはまた、無傷の動物におけるショウジョウバエの心臓状態の同時モニタリングおよび刺激を可能にする。OCTシステムの概略図を図1に示す。SD-OCTシステムは、光源としてスーパールミネッセンスダイオード(SLD)を使用しています(中心波長:850nm±10nm、FWHM:165nm、材料表参照)。10倍の対物レンズを使用して、OCTイメージングシステムは、空気中で約4.4μm、組織で約3.3μmの軸方向分解能および約2.8μmの横方向分解能を達成することができ、フライハート構造の細かい詳細を解決するのに十分である18,22。リファレンスアームとサンプルアームからの反射光の干渉信号は、2048ピクセルのラインスキャンカメラを備えた分光器を使用して検出されます(最大ラインレート:80kHz、材料表を参照)。測定されたシステム感度は約95.1dBです。各BモードOCTスキャンは、xz画像平面に断面画像を生成する。繰り返しBモード画像が同じ位置で取得され、〜30秒以上にわたって鼓動する心臓をキャプチャするMモード画像18、22、23が作成されます。Mモードイメージングのフレームレートは約125フレーム/秒で、ショウジョウバエの心臓の鼓動ダイナミクスを捉えるのに十分です。
ショウジョウバエの心機能の光遺伝学的調節のために、617nmのLED光源を備えた照明モジュールがSD-OCTシステムのサンプルアームと統合されています。刺激光は、試料表面上の直径約2.2mmのスポットに、撮像フォーカススポットと同じ位置に集光される。照明モード(光強度、パルス幅、およびデューティサイクル)を制御し、光パルス刺激周波数を調整し、LEDモジュール照明とMモードOCT画像化取得22を同期させるために、カスタム記述されたソフトウェアが利用される。
最近の出版物は、UAS/GAL4遺伝子系を用いて時空間的に調節されたChR2、ReaChR、およびeNpHR2.0オプシンからなるショウジョウバエトランスジェニック系を記載した。得られた結果は、eNpHR2.0の赤色光活性化によって引き起こされる心停止および徐脈を開始する能力、およびChR2の青色光活性化によって引き起こされるより高い周波数の心臓ペーシングを実証した。 同様のペーシング実験は、赤色光照明によって誘導可能な別のチャネルロドプシンReaChRを用いて実施された22、23、24。記載されたすべての実験におけるオプシン発現は、24B-GAL4によって駆動され、そこでは、心筋細胞および周囲の筋肉細胞を含む広範囲の組織においてオプシン発現が観察された。現在の研究では、心臓特異的eNpHR2.0およびReaChRオプシン発現を達成するために、24B-GAL4をHand-GAL4ドライバに置き換えた。
全体として、提示された実験結果は、回復可能な心停止および誘導性徐脈および頻脈心臓状態を示す。トランスジェニック ショウジョウバエ モデルを作成し、生きた動物におけるOCTイメージングと光遺伝学的ペーシング実験を同時に実施するためのステップバイステップの手順を含む詳細なプロトコルが提供されています。

<table><tbody><tr><td>オールトランスレチナール</td><td>ケイマンケミカルズ</td><td>18449</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>Gibco</td><td>02-10-2025</td><td></td></tr><tr><td>BioLED光源制御モジュール、4チャンネル</td><td>Migtexシステム</td><td>BLS-SA04-US</td><td>光遺伝学的刺激モジュールの一部</td></tr><tr><td>広帯域光源モジュール</td><td>Superlum</td><td>cBLMD-T-850-HP</td><td>SD-OCTイメージングシステム</td></tr><tr><td>Cobra-Sの一部800 OCT分光計</td><td>&nbsp;ワサッチフォトニクス</td><td>CS800-840/180-80-OC2K-U3</td><td>SD-OCTイメージングシステムの一部</td></tr><tr><td>デリケートタスクワイパー</td><td>キンバリー・クラーク プロフェッショナル</td><td>34155</td><td>組織</td></tr><tr><td>ショウジョウバエ寒天</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>ショウジョウバエ培養ボトル</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>32-131</td><td></td></tr><tr><td>FlyNet 2.0 ソフトウェア</td><td>Z-Lab</td><td></td><td>周研究室で開発されたハエの心臓セグメンテーションと心機能分析のためのカスタムソフトウェア</td></tr><tr><td>ハイパワーLEDコリメーター ソース</td><td>Migtex Systems</td><td>BLS-LCS-0617-03-22</td><td>光遺伝学的刺激モジュールの一部</td></tr><tr><td>不活性ドライイースト</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>62-106</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>アムスコープ</td><td>BS-72P</td><td></td></tr><tr><td>ショウジョウバエ培養用ナロープラグ</td><td>ジェネゼーScientific</td><td>59-200</td><td></td></tr><tr><td>ショウジョウバエ培養用ナローバイアル</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116SB</td><td></td></tr><tr><td>永久両面テープ</td><td></td> ショウジョウバエボトル用スコッチ<td></td><td></td></tr><tr><td>プラグ</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-194</td><td></td></tr><tr><td>プロピオン酸</td><td>シグマ</td><td>P1386-1L</td><td></td></tr><tr><td>SD-OCT 制御ソフトウェア</td><td>Z-Lab</td><td></td><td>周研究室で開発された画像取得およびペーシング制御用のカスタムソフトウェア</td></tr><tr><td>SD-OCTイメージングおよび光遺伝学的ペーシングシステム</td><td>Z-Lab</td><td></td>は<td>周研究室で開発されたイメージングおよび光遺伝学的ペーシングシステム (~$50k BOM)</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>カロライナ</td><td>89-2871</td><td></td></tr><tr><td>w[*];P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td><td>stock # 41752</td><td>eNpHR2.0 トランスジェニックライン</td></tr><tr><td>w[*];P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td><td>stock # 53748</td><td>ReaChR transgenic line</td></tr><tr><td>w[1118];P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1]</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td><td>stock # 48396</td><td>Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment</td></tr><tr><td>y[*] w[*];P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3</td><td>ブルーミントン ショウジョウバエ ストック センター (BDSC)</td><td>在庫 #6658</td><td>GFP レポーター ライン</td></tr><tr><td>酵母抽出</td><td>ラボ サイエンティフィック bioKEMIX</td><td>978-907-4243</td><td></td></tr></tbody></table>

ショウ ジョウバエのメラノガスター モデルの開発による心機能のイメージングと光遺伝学的制御

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

ショウジョウバエの メラノガステr(ショウジョウバエ)をモデル生物として使用することで、細胞組織やゲノム調査から行動研究まで、生物科学の多くの分野で大きな進歩が見られました。蓄積された科学的知識のために、近年、 ショウジョウバエ は心臓病を含むヒトの疾患をモデル化する分野に持ち込まれました。提示された研究は、赤色光(617nm)を使用し、侵襲的な手順なしで、生きている生物全体の文脈で心機能を監視および操作するための実験システムを記述する。心臓の制御は、光遺伝学的ツールを使用して達成された。光遺伝学は、光感受性トランスジェニックオプシンの発現およびそれらの光学的活性化を組み合わせて、目的の生物学的組織を調節する。この研究では、カスタム統合光コヒーレンス断層撮影(OCT)イメージングおよび光遺伝学的刺激システムを使用して、第3齢幼虫および初期の蛹発生段階で機能している D.メラノガスター 心臓を視覚化および調節した。UAS/GAL4二重遺伝子系は、ハロロドプシン(eNpHR2.0)および赤方シフトチャネルロドプシン(ReaChR)を、特にハエ心臓において発現させるために使用された。ライブOCTイメージングおよび光遺伝学的ペーシングのための D.メラノガスター の準備に関する詳細が提供される。ラボで開発された統合ソフトウェアがイメージングデータを処理して、 ショウジョウバエ の心機能の視覚的なプレゼンテーションと定量的特性を作成しました。この結果は、eNpHR2.0活性化によって引き起こされる心停止および徐脈を開始し、ReaChR活性化時に心臓ペーシングを行うことの実現可能性を実証する。

D.メラノガスター動物は、心臓管内で赤色光感受性オプシンeNpHR2.0またはReaChRを発現し、各UAS−オプシントランスジェニック系統とHand−GAL4ドライバーとの間の交配から子孫を得ることによって生成した。GAL4ドライバーの組織特異性は、GFP発現をイメージングすることによって検証した(図4)。ショウジョウバエの3齢幼虫および発生期初期の蛹を用いて、赤色光によるeNpHR2.0およびReaChR活性化の効果を実証した。LEDによって送達される〜617nmの赤色光パルスを設計し、幼虫/蛹を照らし、心臓のeNpHR2.0およびReaChRを活性化した。報告されたNpHRの最大応答波長は約580nmであり、ReaChRの応答波長は約600nmであるが、617nmの光照明は、オプシン発現心臓組織22への光エネルギー送達を増強してより深く浸透することができる。
倒立顕微鏡セットアップで背側を下にして顕微鏡スライドに取り付け、幼虫/蛹はA7ボディセグメントに向けられたLED光ビームによって照らされました。身体断面画像の例を図5A及び図6Aに示す。心臓は、4,000フレームからなるビデオ録画では、収縮し、拡張する円形として現れる(補足ビデオ1-6)。異なる心臓の状態を模倣するために、4種類の光パルスが設計されました。図5Bに示すように、5秒の待ち時間の後10秒持続する単一のパルスは、eNpHR2.0によって誘発される回復可能な心停止を生じた。eNpHR2.0によって媒介される安静時心拍数(RHR)よりも遅い周波数での心臓ペーシングについて、RHR/2およびRHR/4に等しいペーシング周波数が8秒間持続し、その間の待ち時間が6sの2つの光パルスシーケンスが使用された(図5C)。各光パルスシーケンスのデューティサイクルは90%であった。この光刺激レジメンは、徐脈を連想させる心臓病を引き起こした。ReaChRの活性化により心拍数を増加させる刺激パターンは、それぞれRHR + 0.5Hz、RHR + 1Hz、およびRHR + 1.5Hzの周波数で、パルス幅が20msの3つの一連の光パルスで構成されていました(図5D)。このパルスレジメンは、頻脈性心臓病を引き起こすことを目的としていた。光出力密度は、すべての実験中に7.49mW/mm2であった。対照実験では、光照明は設定しなかった。
各実験変異体を5回記録した。フライハートのMモードビデオは、FlyNet 2.027を使用して2Dマスクに処理された。このソフトウェアは、心臓領域を自動的にセグメント化して心機能データセットを生成します。プログラムは、心拍数(HR)、拡張末期次元(EDD)、および収縮終期次元(ESD)、フラクショナル短縮(FR)、拡張末期領域(EDA)、収縮終期領域(ESA)など、鼓動する心臓の機能パラメータの正確な定量化を生成するために、必要に応じて手動でさらに補正することができる各フレーム内の心臓のマスクを提供する。心拍数は、時間の経過とともに心臓領域を分析することによって測定されます。光パルスのないコントロールビデオは、各動物のベースライン心拍数(例えば、RHR)を確立するために使用される。
図5Bおよび図6Bは、幼虫および蛹において、それぞれ赤色光(617nm)を用いたHand&gt;eNpHR2.0活性化によって引き起こされる10秒間の長い心停止を示す。赤いライトが点灯すると、ショウジョウバエの心臓は鼓動を停止し、ライト照明が終了するまでこの状態のままでした。心臓機能は、赤色のライトが消された後、回復した。オプシンを発現させなかった動物(「オプシンなし」対照)は、赤色光照明に応答しなかった(補足図2Aおよび補足図3A)。10秒の赤色光照明がオンにされなかったHand&gt;eNpHR2.0動物を用いた対照実験(「光なし」対照)は、正常な心臓拍動を示した(補足図4Aおよび補足図4C)。
Hand&gt;eNpHR2.0動物を用いて、RHRよりも低い周波数で赤色光パルスを印加した。心臓収縮周波数は、光信号に続いて減少した。この遅い心拍数は、心臓不整脈の1つのタイプ、徐脈を模倣する(それぞれ幼虫および蛹の図5Cおよび図6C)。遅い心臓ペーシングは、「オプシンなし」(補足図2Bおよび補足図3B)および「光なし」(補足図4Aおよび補足図4C)対照実験では観察されなかった。
心拍数の増加は、与えられた動物のRHRよりも高い周波数で赤色光パルス列で Hand&gt;ReaChR オプシンを活性化することによって達成することができる。異なる刺激周波数(例えば、RHR + 0.5Hz、RHR + 1Hz、RHR + 1.5Hz)での一連の3つの光パルス列を、 Hand&gt;ReaChR 幼虫および蛹の心臓に適用した。得られたデータは、光パルス後の心拍数の増加をはっきりと示している(幼虫および蛹についてそれぞれ図5D および 図6D )。これらの実験で実証された心臓の状態は、頻脈を模倣する。陰性対照実験は、補足図 2C、補足図3C、および 補足図4B、Dに示されている。
全体として、結果は、 D. melanogasterのトランスジェニック動物モデルにおける様々な発達段階における心臓リズムの非侵襲的および特異的な光遺伝学的制御の実現可能性を実証する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig01.jpg"> 図1:ショウジョウバエの心機能の光遺伝学的制御のための617nmのLEDモジュールと統合されたOCTイメージングシステム <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig01large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig02.jpg"> 図2:心臓にオプシンを発現するD.メラノガスター動物の生成(A)遺伝子交配図。雌ハンドGAL4/TM6 SbTbは、eNpHR2.0を保有する雄に交配した。得られたHand-GAL4/eNpHR2.0子孫(赤い星印)をOCTイメージングのために収集し、Hand-GAL4/TM6 Sb Tbを表現型の外観に基づいて廃棄した。(B)遺伝子交配図。雌ハンドGAL4/TM6 SbTbは、ReaChRを保有する雄に交配された。得られたHand-GAL4/ReaChR子孫(赤い星印)をOCTイメージングのために収集し、Hand-GAL4/TM6 Sb Tbを表現型の外観に基づいて廃棄した。(C) ハンド-GAL4/オプシン(赤い星)とハンド-GAL4/TM6 Tbの子孫の表現型の違い。TM6染色体上にTb遺伝子変異を有する動物は、正常な非Tb幼虫または蛹と比較して「タビー」体型を有する。左側のパネルは幼虫を示しています。右側のパネルは初期の蛹を示しています。画像には、1mmマークの定規も含まれています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig03v2.jpg"> 図3:イメージング準備手順の概略プレゼンテーションとタイムライン。 親の在庫はフライボトルに保管されています。処女の女性と男性は、通常の食物(黄色で示される)で満たされた狭いバイアルで交差する。積極的に産卵するハエは、ATR含有培地(茶色で示されている)バイアルに移される。発達中の子孫を持つバイアルは、このステップから暗闇の中に保管する必要があります。3齢幼虫および初期の蛹は、イメージングのためにバイアル壁から収集される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig03largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig04.jpg"> 図4:ハンド-GAL4(BDSC 48396)によって駆動されるUAS-GFP(BDSC 6658)を発現するD. melanogaster初期蛹。蛍光パターンは、Hand-GAL4ドライバーの心臓特異性を確認します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig05v2.jpg"> 図5: D.メラノガスター 幼虫における心停止、徐脈、頻脈のシミュレーション。 (A)幼虫の体断面のOCT画像。心臓は体の表面の下に円として現れます。(B)回復可能な心停止のグラフィックプレゼンテーション。上段のパネルは、赤色光照明のタイミング(X軸)(Y軸、光源電力レベルパーセンテージ)を示しています。中央のパネルは、心臓領域(Y軸、平方マイクロメートル)の経時的な変化(X軸)を示します。下のパネルは、経時的な心拍数の変化(Y軸、ヘルツ)(X軸)を示しています。(C)eNpHR2.0媒介性回復可能な徐脈のグラフィックプレゼンテーション。上のパネルは、赤光照明のパルスを示し、RHRの50%およびRHRの25%の2つの徐脈期間を誘発する。心拍領域と心拍数の変化は、それぞれ中央パネルと下部パネルに表示されます。(D)活性化ReaChRによる心臓ペーシングのグラフィックプレゼンテーション。上のパネルは、RHR + 0.5 Hz、RHR + 1 Hz、およびRHR + 1.5 Hzの周波数で発生する一連の20 msの赤色光パルスを示しています。心臓の収縮は、中央および下部のパネルに示すように、光パルス周波数に従います。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig05largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63939/63939fig06v2.jpg"> 図6: D.メラノガスター 蛹における心停止、徐脈、頻脈のシミュレーション (A)蛹体断面のOCT画像。心臓は体の表面の下に円として現れます。(B)回復可能な心停止のグラフィックプレゼンテーション。上段のパネルは、赤色光照明のタイミング(X軸)(Y軸、光源電力レベルパーセンテージ)を示しています。中央のパネルは、心臓領域(Y軸、平方マイクロメートル)の経時的な変化(X軸)を示します。下のパネルは、経時的な心拍数の変化(Y軸、ヘルツ)(X軸)を示しています。(C)eNpHR2.0媒介性回復可能な徐脈のグラフィックプレゼンテーション。上のパネルは、赤光照明のパルスを示し、RHRの50%およびRHRの25%の2つの徐脈期間を誘発する。中央パネルと下部パネルには、それぞれ心面積と心拍数の変化が表示されます。(D)活性化ReaChRによる心臓ペーシングのグラフィックプレゼンテーション。上のパネルは、RHR + 0.5 Hz、RHR + 1 Hz、およびRHR + 1.5 Hzの周波数で一連の20 msの赤色光パルスを示しています。心臓の収縮は、中央および下部のパネルに示すように、光パルスの周波数に従います。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/63939fig06largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:TM3 Sbバランサー染色体をTM6 Sb Tbで置き換えるための遺伝子交配。処女雌ハンドGAL4 w+/TM3 Sbは、nub-GAL4NP3537タブ-GAL80ts w+/TM6 Sb Tbオスと交配した。処女雌および雄を含む手-GAL4 w+/TM6 Sb Tb子孫を選択した(タビー体型と組み合わせた色素沈着した眼のスクリーニング)。選択されたハエは、安定したストックを確立するために自己交配された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryFigure1.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:対照実験では、野生型(wt)幼虫の心臓リズムは赤色光照明時に変化しない。 (a)wt幼虫において赤色光照明中に心停止は観察されなかった。上のパネルは、Mモードの心臓画像を示しています。赤い線は照明のタイミングを示します。中央と下部のパネルは、32秒のイメージング時間中の心臓領域と心拍数を示しています。(B,C)赤色光パルスは、重量幼虫の心拍数を変化させない。上のパネルは、Mモードの心臓画像を示しています。赤い線は照明のタイミングを示します。中央と下部のパネルは、32秒のイメージング時間中の心臓領域と心拍数を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryFigure2.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図3:対照実験では、野生型(wt)蛹の心臓リズムは赤色光照明時に変化しない。 (a)wt幼虫において赤色光照明中に心停止は観察されなかった。上のパネルは、Mモードの心臓画像を示しています。赤い線は照明のタイミングを示します。中央と下部のパネルは、32秒のイメージング時間中の心臓領域と心拍数を示しています。(B,C)赤色光パルスは、体重蛹の心拍数を変化させない。上のパネルは、Mモードの心臓画像を示しています。赤い線は照明のタイミングを示します。中央と下部のパネルは、32秒のイメージング時間中の心臓領域と心拍数を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryFigure3.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図4:Hand&gt;eNpHR2.0またはHand&gt;ReaChRを発現するD.メラノガスター幼虫および蛹は、赤色光照明なしでOCTイメージング中に有意なHR変化を示さない。(A)手&gt;eNpHR2.0幼虫の心拍数。(B)ハンド&gt;ReaChR幼虫の心拍数。(C) 手&gt;eNpHR2.0蛹の心拍数。(D) 手&gt;ReaChR蛹の心拍数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryFigure4.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ビデオ1:活性化されたeNpHR2.0は、D.メラノガスター幼虫に心停止を引き起こす。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo1.zip" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ビデオ2:活性化されたeNpHR2.0は、D.メラノガスター蛹に心停止を引き起こす。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo2.zip" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ビデオ3:D.メラノガスター幼虫におけるeNpHR2.0媒介性回復可能な徐脈。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo3.zip" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ビデオ4:D.メラノガスター蛹におけるeNpHR2.0媒介性回復可能な徐脈。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo4.zip" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ビデオ5:D.メラノガスター幼虫における活性化ReaChRによる心臓ペーシング。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo5.zip" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ビデオ6:D.メラノガスター蛹における活性化ReaChRによる心臓ペーシング。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63939/SupplementaryVideo6.zip" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

本プロトコールは、OCT画像化および光遺伝学的心臓ペーシングのために、心臓においてeNpHR2.0またはReaChRオプシンを発現するショウジョウバエメラノガスターの生成を記載する。ショウジョウバエOCTイメージングおよび心拍調節のための詳細な指示は、異なる発達段階における生きた動物における回復可能な心停止、徐脈、および頻脈のシミュレーションを含む、報告されている。

Using Drosophila melanogaster (fruit fly) as a model organism has ensured significant progress in many areas of biological science, from cellular ...

プロトコルは、心臓機能を光を使用して特徴付けおよび制御できるショウジョウバエモデルを提示します。これにより、研究者は無傷の動物を使用してショウジョウバエのヒト心臓病を研究することができます。この方法は、ショウジョウバエの心機能の非侵襲的なOCTイメージングと光遺伝学的制御を確実に達成することができます。高効率と高品質です。光遺伝学的ペーシングは、不整脈疾患を治療するための治療法として、電気的ペーシングの代替となる可能性があります。OCTイメージングと光遺伝学的ペーシングは、心臓オルガノイド、ゼブラフィッシュ、胚性の喉や心臓などの他のモデルシステムに拡張できます。まず、バイアルごとにTM6ダブルタビーバージンメスとUAS Opsおよびストックからの2〜3匹のオスのハエの上に5つの手のGAL4を組み合わせます。翌日、ブルーミントンショウジョウバエストックセンターの指示に従って、ホットプレートの容器に100ミリリットルのショ糖あたり5.14グラムを加えて、半定義の食品を準備します。次に、絶えず攪拌しながら摂氏60度に冷却します。次に、各バイアルに50マイクロリットルの100ミリモルのオールトランスレチナールエタノール溶液を加えて、ナローフライバイアルを調製します。血清学的ピペットを使用して、狭いフライバイルあたり5ミリリットルのフライフードを処分します。最高速度で10秒間ボルテックスした後、これらのバイアルを差し込み、暗い布で包み、光から保護します。翌日、着実に産卵しているハエを、全トランス網膜エタノール含有食物を含むバイアルに移します。バイアルでラックを光から保護します。24〜48時間後、産卵数に応じて、バイアルの過密を防ぐために両親を捨てます。次に、心臓イメージングのためにタビー以外の子孫を収集します。バイアルからUASオプションの手GAL4幼虫または蛹を選び、ティッシュの上に置き、ペイントブラシを使用して体表面からメディアをそっと拭き取ります。中央に両面テープの小片を付けて顕微鏡スライドを準備します。次に、ブラシまたは細かいピンセットを使用して、背側を上にしてスライドの長辺に垂直になるように、幼虫または蛹をテープ表面にそっと置きます。穏やかな圧力を加えて、幼虫または蛹をテープの表面に取り付けます。次に、幼虫または蛹を下に向けてイメージングステージにスライドをセットアップし、レーザー制御ソフトウェアによって光干渉断層撮影またはOCT光源をオンにします。カスタム記述スペクトルドメインOCT制御ソフトウェアを開きます。次に、プレビューウィンドウをクリックします。次に、スペクトルドメインOCTソフトウェアでスキャンパラメータを設定します。マイクロマニピュレーターを使用してサンプルステージを制御し、フライハートに焦点を合わせます。焦点位置を調整して、フライキューティクル表面からの光の反射を最小限に抑えます。また、反射を最小限に抑えるために、幼虫または蛹の表面に鉱油を塗布することを検討してください。次に、MモードOCT画像取得のスキャンパラメータを設定し、赤色光刺激パルスなしで5セットの制御データを取得して、安静時心拍数を計算します。カスタムOCT制御ソフトウェアでペーシング刺激の光パルスを設計します。このためには、設定タブをクリックし、設計された光パルスシーケンスを追加して、さまざまな刺激プロトコルに従ってパルス周波数、パルス幅、刺激時間、および待機時間を制御します。次に、ライトコントローラーソフトウェアを開いて、赤色光パルスを生成します。モード選択でパルスモードを選択します。パルスプロファイル設定の図をダブルクリックし、フォロワーモードを選択します。オフ強度をゼロに保ち、実際の電力密度を計算するときにオン強度のパーセンテージを設定します。OCT制御ソフトウェアの[取得]をクリックして、光刺激で鼓動するショウジョウバエの心臓のMモードビデオを取得します。画像取得中にハエの心臓に赤い光が点滅するのを記録します。赤方偏移チャネルロドプシンおよびNPHRフライモデルでハエの心臓機能を制御するには、異なるペーシング設定が必要であることに注意してください。カスタム開発されたハエの心臓セグメンテーションソフトウェアを開き、ファイルの選択をクリックします。次に、グラフィカルユーザーインターフェイスで分析するファイルを選択します。心臓領域の垂直方向と水平方向の両方の境界を、上部のテキスト ボックスにピクセル単位で入力します。[サイズ変更]をクリックします。下部のスライダーを使用して、心臓領域全体が表示され、コレクション全体のボックス全体がいっぱいになっていることを確認します。予測タブをクリックすると、プログラムはコレクション内のすべてのスライスを調べ、約3分で心臓領域を選択します。予測が完了したら、HRプロットをクリックして、時間の経過に伴う心臓領域のプロットを新しいウィンドウに表示します。正しいピークエリアまたはバレーエリアを選択し、パルスタブを選択してからHRタブを選択して、最終的な数値を生成します。機能パラメータは同時にCSVファイルに保存されます。手のGAL4ドライバーの組織特異性を、緑色蛍光タンパク質発現のイメージングによって検証した。ここでは、幼虫と蛹の体の断面の典型的なOCT画像を示します。さまざまな心臓の状態を模倣するために、4種類の光パルスが設計されました。5秒間の待機時間の後、10秒間続く単一の脈拍は、回復可能な心停止を引き起こした。安静時心拍数よりも低い周波数での心臓ペーシングには、ペーシング周波数が安静時心拍数の半分に等しい2つの光パルスシーケンスと、安静時心拍数の4分の1が8秒間続き、その間に6秒の待機時間が使用されました。赤方偏移チャネルロドプシン活性化による心拍数を増加させる刺激パターンは、光パルスの3つのシーケンスで構成されていました。光信号に続く心臓収縮頻度の低下は、幼虫と蛹を模倣する心拍数の低下をもたらしました。異なる刺激周波数の一連の3つの光パルス列を幼虫に適用し、蛹の心臓は光パルスに続いて心拍数の増加をはっきりと示しました。正しい子孫の準備の選択、標本の取り付け、およびイメージング手順が不可欠です。私たちは、光遺伝学的ペーシング技術をより大きな動物モデルに移し、哺乳類の心臓病を研究し、不整脈を治療するための新しい治療アプローチを探求したいと考えています。

developing-drosophila-melanogaster-models-for-imaging-optogenetic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ここでは、幼虫および成体から心臓管の様々な要素の蛍光標識するための基本的なプロトコルを記述する...

の蛍光標識ショウジョウバエハートの構造

幼虫および成体での心臓の鼓動を可視化するために必要なテクニック...

の心臓の鼓動の可視化ショウジョウバエ</em

我々はの幼虫に心機能を監視するためにさまざまな方法を提示...

幼虫のモニタリングの心機能キイロショウジョウバエ生理学的研究のための

シングルショウジョウバエ個眼の解剖とイメージング

ここ半無傷でモータ出力の変化（筋収縮）を監視しながら、我々は運動神経活動のoptogenetic操作のためのプロトコルを記述...

半無傷でレーザー照射による神経活動のOptogeneticの摂動<em&gt;ショウジョウバエ</emイン·モーション&gt;幼虫

本論文では、直接蛹殻を介して画像細胞挙動への高速走査型共焦点顕微鏡を使用する方法を示します。そのまま蛹ケースを残すことによって、このメソッドを直接学ぶことは困難であるショウジョウバエの発生段階で動的な細胞プロセスの観察と測定を可能にします。...

の蛹ケースを画像化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

ここでは、さまざまな発生段階でショウジョウバエを準備し、カスタム光干渉顕微鏡(OCM)システムを使用してショウジョウバエの心拍の縦方向の光学イメージングを実行するための実験プロトコルが説明されています。心臓の形態学的および動的変化は、OCM画像から心臓の構造的および機能的パラメータを分析することにより、定量的に特徴付けることができます。...

ショウジョウバエの調製と光コヒーレンス顕微鏡を用いてin vivoで心機能の縦イメージング（OCM）

マイクロコンピュータ断層撮影を用いた開発のあらゆる段階で、無傷の ショウジョウジョウバエメラノガスター...

微小断層撮影による ショウジョウバエメラノガスター の動物全体イメージング

本研究では、トランスジェニックチャネルロドプシン-2(ChR2)マウスの無傷マウス心臓の心調律を、マイクロLEDアレイによる局所光刺激と心外膜電位の同時光学マッピングを用いて制御する方法を報告する。...

マウス心臓における光遺伝学的マルチサイト光刺激の適用による高度な心調律管理

ショウジョウバエの心臓切片作製および蛍光イメージングプロトコルは、心臓の構造と病状の研究を簡素化します。このアプローチには、従来の解剖に必要な技術的専門知識をバイパスして、簡単な切片作成、染色、およびイメージングが含まれます。これにより、アクセシビリティが向上し、ショウジョウバエは、より広範な科学コミュニティ内で心臓関連研究のモデルとしてより広く利用できるようになります。...

クライオ切片による ショウジョウバエ の心臓蛍光染色のための新規で効率的な方法

この論文では、 Drosophila melanogasterにおける光遺伝学的操作の方法を提示し、CsChrimsonとGtACR2を利用して特定のニューロンを活性化および沈黙させます。オプトジェネティクスを利用してサーモタクティックおよび味覚行動を探索するための4つの実験が説明されており、これらのプロセスを支配する根底にある神経メカニズムについての洞察が得られます。...

Drosophila melanogasterにおける神経回路の光遺伝学的操作のための行動アッセイ

学ぼう、Drosophila melanogasterを用いた光干渉断層法イメージングと光遺伝学的ペーシングによる心機能の非侵襲的制御法。この手法は不整脈治療への応用可能性を示し、心疾患研究に新たなアプローチを提供する。

ショウジョウバエのメラノガスターモデルの開発による心機能のイメージングと光遺伝学的制御

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ショウ ジョウバエのメラノガスター モデルの開発による心機能のイメージングと光遺伝学的制御

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