質量分析法を用いた単一ニューロンにおけるRNA修飾の特性評価
April 21st, 2022
RNAの転写後修飾は、最近中枢神経系の可塑性に関連している翻訳調節の未研究の層を表す。ここで、試料調製および液体クロマトグラフィータンデム質量分析アプローチは、単一のニューロンにおける多数のRNA修飾の同時特性評価のために説明される。
このプロトコルでは、単一のニューロンにおける複数のRNA修飾を同時にプロファイリングできる最初の方法を導入し、個々の細胞における転写後調節を含む新しい研究分野を開きました。最適化されたサンプル調製条件と液体クロマトグラフィータンデム質量分析を活用することで、実験ごとに1ダース以上の修飾ヌクレオシドを1つのニューロンで検出および定量できます。個々の細胞は、その機能、形態、および化学的プロファイルの点で異なる。
これらの細胞の完全な化学モザイク(RNAプロファイルを含む)を測定できることは、健康と病気の両方におけるそれらの違いを理解するのに十分な細胞のために重要です。単一ニューロン単離前の神経節調製の程度は、単離を行う個体の嗜好に依存する。より長いプロテアーゼ治療と短いプロテアーゼ治療の両方を試みて、適切な状態を特定します。
まず、麻酔をかけたAplysia californica腹側を解剖トレイに入れます。1つの鈍い先端を動物に向けて配置し、慎重に足を縦方向に切断して、外科用はさみを使用して解剖を開始します。動物の体の吻側、尾側、および側方の側面を固定して体腔内の内臓および中枢神経系神経節を露出させた後、神経節および神経節に由来するいくつかの接続性を外科的に切断することによって、動物から主要な中枢神経系神経節を単離する。
神経節をストレプトマイセス・グリセウス由来の1ミリリットルプロテアーゼXIV型溶液あたり10ミリグラムに浸し、摂氏34度で30分〜1時間インキュベートする。次に、人工海水抗生物質溶液で神経節を6回すすいでください。次いで、5ミリメートルの開口部に切断されたポリプロピレン転写ピペットを用いて、人工海水抗生物質溶液で満たされたシリコーンポリマーコーティングされた皿にすべての神経節を移す。
神経節は常に人工海水に沈めてください。次に、神経節鞘を取り外すには、神経節を固定し、マイクロハサミと細かい鉗子を使用します。十分に強力な酵素処理では、被覆解除のためにガラスまたは金属の針を使用してください。
関心のあるニューロンを視覚的に識別する。プールされたガラス毛細血管または鋭いタングステン針を使用して、同定された細胞をバルク神経節から慎重に単離する。約1マイクロリットルの人工海水をプラスチックマイクロピペットに吸い込んだ後、単離した細胞を4マイクロリットルの0.365モル酢酸アンモニウムを含むPCRサンプルチューブに移す。
ブランク測定のために、神経節を含む皿から人工海水抗生物質溶液の5マイクロリットルアリコートを収集し、消化緩衝液と混合する。単離されたニューロンを、0.365モル酢酸アンモニウム中のマイクロピペットで吸引および分配を繰り返して溶解する。一部の細胞はすぐに破裂しないことがあります。
それらを溶解するには、プールされたガラスキャピラリーでセルの直径全体に圧力をかけます。次に、3.375マイクロリットルのRNA消化バッファーをサンプルに添加する前に、熱サイクルでサンプルを加熱します。この溶液をマイクロピペットを用いて混合し、溶液を数回引き出して分配する。
PCRチューブの壁に付着した液滴は、ミニチュアベンチトップ遠心分離機を使用してスピンダウンします。次に、37°Cの熱サイクルでサンプルを3時間インキュベートし、続いて加熱された蓋をOn.Onceに設定して10°Cで保持し、サンプルが冷却されたら、直ちに7マイクロリットルの溶液をオートサンプラーチューブに気泡を形成することなく250マイクロリットルのインサートを備えたオートサンプラーバイアルに移します。正準ヌクレオシドと修飾ヌクレオシドの分離のための液体クロマトグラフィーシステムを調製するには、摂氏 36 度で 12 分間、毎分 0.2 ミリリットルの流速で 99% 移動相 A および 1% 移動相 B を使用して C18 カラムを平衡化します。
質量分析装置をポジティブモードで操作し、ダイバータバルブを分析の最初の2分間は無駄にし、残りの実行ではソースにセットします。次に、110~600のm/z範囲にわたる質量スペクトルを収集します。データベースから構築された好ましい質量リストと0.5の分離ウィンドウを使用して、3秒のサイクルタイムにわたって35〜40電子ボルトで衝突誘起解離するイオンを選択します。
アクティブ除外を使用して、3つのスペクトル後のフラグメンテーションからイオンを除外します。強度が50,000カウント以上50,000カウント未満のイオンの動的MS/MSスペクトル取得を、それぞれ4ヘルツと1ヘルツで設定します。イオン選択の最小閾値を1、990カウントとする。
質量分析による定量的単一ニューロンRNA修飾分析では、修飾ヌクレオシド標準物質について得られた抽出イオンクロマトグラムピーク面積を最低5濃度で抽出して検量線を作成し、未知の内因性分析物濃度の補間を可能にします。質量分析による単一ニューロンRNA修飾分析は、溶解消化およびLC-MS/MS分析のために、同定されたニューロンを少量のサンプルに手動で単離することを含む。質量分析による単一ニューロンRNA修飾解析は、Aplysia californicaの中枢神経系からの単一ニューロンにおける12以上のRNA修飾を日常的に検出し、単一細胞におけるこの動物の既知のエピトランスクリプトームのほぼ半分のカバレッジを表す。
その結果、単一細胞のRNA修飾プロファイルが同じ組織内のバルク細胞から発散する可能性があることが初めて明らかになりました。ユニークな修飾ヌクレオシドパターンのさらなる支持は、単一のニューロンおよびバルク組織の両方で一般的に検出された13のRNA修飾についてペアワイズ比較が行われた動物の別個のコホートから得られた。機能的に異なる細胞におけるRNA修飾は、スコアプロットにおいて固有のクラスターを形成し、相同なR2/LPl1ニューロンは共クラスター化した。
負荷プロットは、差異が主に2'O-メチルアデノシンおよびN1-メチルアデノシンを含むメチルアデノシンの位置異性体の存在量によって駆動されたことを示している。N1-メチルアデノシン、プソイドウリジン、2'O-メチルグアノシン、2'O-メチルアデノシン、およびN6-ジメチルアデノシンについて外部検量線を作成した。そして、中大脳細胞およびR2/LPl1細胞対における各修飾ヌクレオシドの量は、補間によって決定した。
最小量の人工海水が、単一の単離されたニューロンとともにPCRチューブに移されることを確認します。これにより、サンプルの希釈が最小限に抑えられ、最終的に分析物の検出に影響します。このプロトコルは、軸索や樹状突起などの細胞内構造におけるRNA修飾の分布を調査し、活性依存性局所翻訳のメカニズムの理解を深めるために使用することができる。
概要
この記事では、単一のニューロンにおける複数のRNA修飾をプロファイリングする新しい方法を提示し、中枢神経系における翻訳後調節の理解におけるその重要性を強調しています。このアプローチは、最適化されたサンプル調製と液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析を使用して、個々のニューロンの化学的プロファイルを分析します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生化学
- RNA修飾
背景
- RNAの翻訳後修飾は翻訳調節にとって重要です。
- これらの修飾は中枢神経系の可塑性と関連しています。
- 個々のニューロンのプロファイルを理解することは健康と疾患の洞察に不可欠です。
- 現在の方法では、単一のニューロンを効果的に分析する能力が不足しています。
研究目的
- 単一のニューロンにおけるRNA修飾の同時プロファイリング方法を開発する。
- 個々の細胞におけるRNAプロファイルの化学的多様性を探索する。
- 健康と疾患の状態におけるRNA修飾の違いを調査する。
使用された方法
- Aplysia californicaの神経節からの単一ニューロンの分離。
- 神経節の準備のためのプロテアーゼ処理の使用。
- 分析のための液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析。
- 修飾されたヌクレオシドを定量化するための校正曲線。
主要な結果
- 単一のニューロンで十数種類のRNA修飾が検出されました。
- 単一細胞のプロファイルが全体組織分析とは異なっていました。
- 機能的に異なる細胞において、固有の修飾ヌクレオシドパターンが特定されました。
- 結果は、個々のニューロンプロファイルを分析することの重要性を支持しています。
結論
- この方法は、単一のニューロンにおけるRNA修飾の詳細な分析を可能にします。
- 結果は神経科学におけるエピトランスクリプトーム理解に貢献します。
- このアプローチは翻訳後調節の研究における新しい道を開きます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Single-neuron RNA modification profiling by mass spectrometry enables unprecedented resolution in mapping post-transcriptional regulatory mechanisms within the central nervous system. This capability addresses a critical gap in understanding cell-specific epitranscriptomic diversity, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in neurobiological target validation. The approach positions biopharma R&D to interrogate neuronal heterogeneity relevant to learning, memory, and disease models at the single-cell level.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of post-transcriptional regulatory mechanisms in individual neurons.
- Supports functional target validation by revealing cell-specific RNA modification patterns.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing neuron subtypes based on epitranscriptomic profiles.
- Improves predictive confidence for target selection in CNS drug discovery.
Screening & Assay Development
- Establishes validated single-cell analytical workflows for downstream screening applications.
- Provides quantitative, reproducible measurement of modified nucleosides in isolated neurons.
- Enables assay standardization for rare or functionally distinct neuronal populations.
- Supports platform scalability for comparative compound evaluation in neuropharmacology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns single-cell RNA modification data with disease-relevant neuronal circuits.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by linking molecular signatures to functional phenotypes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on cell-type specific epitranscriptomic markers.
- Facilitates translational biomarker identification for CNS disorders.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-resolution mapping of RNA modifications from early target validation through translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by profiling RNA modifications in single neurons.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for assay development in neuronal systems.
- Analytics: Provides robust measurement of modified nucleosides, enabling statistical comparison across cell types and conditions.
- Translational Research: Connects single-cell molecular signatures to disease-relevant neuronal networks.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical platform for diverse CNS research and drug discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible single-cell analysis workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management in neurobiology.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell isolation and mass spectrometry-based analytics.
- Demands specialized instrumentation for LC-MS/MS and sample preparation.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- May require adaptation for different neuronal subtypes or model organisms.
- Sample dilution and analyte detection sensitivity are practical limitations to address.
