Name: 微小管タクトイドの自己組織化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学ぶ微小管タクトイドの自己組織化法。植物由来のMAP65架橋剤とPEGを用いて、紡錘体様構造を再現する最小システムを構築します。蛍光顕微鏡で観察可能で、細胞生物学と液晶研究に応用できます。

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著者らは、2021年夏のロスラボのメンバー、特にK. Alice Lindsayの助けに感謝したいと思います。この研究は、S. Sahu、N. Goodbee、H.B. Lee、J.L. Rossを支援するNSF BIO-2134215からの助成金によって支援されました。KECK Foundation(Rae Anderson, USD, lead PI)からの助成金は、R. BranchとP. Chauhanを部分的に支援した。

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここで説明する方法は、微小管タクトイド(図2)22、28を作成するためにいくつかの論文で使用されている。これらの実験は、ほとんどの細胞型において有糸分裂または減数分裂紡錘体の形状および安定性を制御する組織原理を明らかにするのに役立つ生物学的に関連する。さらに、微小管は、液晶が等方性相からネマチック相を核形成および成長させる方法の詳細を学ぶのに役立つモデル液晶メソゲンである。
ここで概説する手順は、微小管の自己組織化を探索するためのいくつかの利点を有する。第一に、それは再現性が高く、研究室で始める前に、高校生を含む多くの学生によって、予知や訓練がほとんどなく、実験室で行われています。タクトイドは複屈折性22であり、蛍光顕微鏡に加えて透過光で見ることができ、この方法は多くの研究室でアクセス可能であり、この実験手順はハイエンドの研究に加えて教育目的に適応可能である。最後に、このプロセスは、取り除かれた還元主義的なアプローチで生物学的システムを理解し、プローブし続けるための道を開き、各追加の状態、タンパク質、または添加剤がタクトイドの自己組織化をどのように変えるか、そしておそらく最終的にはスピンドルを理解することができます。より良いバイオミミクリーのためのターゲットには、活性、流動性、およびフィラメント極性ソーティングが含まれる。
実験に影響を与えるいくつかの要因が予期しない結果をもたらす可能性があります。例えば、タクトイドが形成されない(図2)が、ファン様のパターンが観察される場合、MAP65は、微小管22、28に存在しないか、または結合していない可能性が高い。これは、GFP-MAP65が微小管に結合しないため、MAP65蛍光チャネルでも明らかであるはずです。
タクトイドが形成されず、背景がガラス上に斑点として表示される場合、これは表面コーティングが原因である可能性があります。一度実行されると、シラナイゼーションはカバースリップでわずか1ヶ月間持続します。それが磨耗すると、チューブリンは露出した表面に非特異的に結合することができる。このバインドは、奇妙なパターンで発生します。
タクトイドが形成されず、チューブリンが様々な形状およびサイズの凝集体で観察される場合、これは質の悪いチューブリンが原因である可能性がある。チューブリンを遠心分離して、微小管重合の代わりにこのオフパスウェイ凝集を駆動できる初期凝集体を除去することができる。表面がチューブリンに結合している場合、溶液中のチューブリンを枯渇させることもできる。低濃度のチューブリンは、微小管を重合するための臨界濃度を下回り、凝集体を生じ得る。
FRAP実験において、MAP65チャネルが何の回復も示さない場合(図5)、フォトブリーチングが微小管を光損傷した可能性がある。光損傷は、フィラメントの局所的な破壊を引き起こす。これは、送信チャネルでの検査によって確認することができます。微小管タクトイドは、周囲の水との不一致の高い屈折率を介して透過チャネルに見える。光誘発性光損傷は、フォトブリーチングを受けたROIの位置における透過光イメージングにおいて、バーンマークまたはコントラストの損失として現れるであろう。これが発生した場合、タンパク質の光損傷を阻害するためにレーザーまたは光パワーを低下させなければならない。
この手順とアプローチでは、いくつかの課題に直面しました。1つの問題は、長さ測定が現在、画像をクリックして手作業で行われていることです。この方法は単純ですが、不確実性が高くなる可能性があります。断面とガウス分布へのフィッティングを使用する幅測定は、サイズを定量化するためのより良い方法です。長さについても同様の方法を採用することができる。2番目の問題は、タクトイドが非常に長くて薄いため、時々、タクトイドが曲がる可能性があることです。これにより、長さの定量化がより困難になります。輪郭の長さはセグメント化された線を使用して定量化できますが、セグメントが追加されるたびに不確実性が増します。
科学的な観点からは、このアプローチは、液晶またはスピンドルのモデルとして使用するために、いくつかの他の課題を有する。最初の課題は、微小管が作り出すタクトイドの長くて薄い形状でした(図3と図4)。先行刊行物22に記されているように、微小管タクトイドは均質なタクトイドであり、双極性ではない。これは、形状を構成する微小管が構造の先端を指すように向きを変えないことを意味する。代わりに、すべての微小管は長軸に平行であり、「極」は無限大に位置する。これは、分子液晶や、液晶メソゲンとしても作用するアクチンやDNAについて観察されるタクトイドとは大きく異なります。これらの他の系では、タクトイドは双極性であり、交差偏光子で見ると、ロッドの再配向の明白な兆候を示す。
このシステムにおける第2の大きな課題は、微小管がタクトイドの内部で不動であることです。これは、微小管の回収率が非常に低いため、FRAP実験および分析から明らかである。その固体状の性質により、微小管タクトイドは大規模な液晶類似体としての価値が低くなります。液晶のネマチック相は、液体(流体)と結晶(組織化)の両方の特性を有するべきである。形状はスピンドルに適しているように見えますが、不動性により、モデルは有糸分裂スピンドルとして刺激的ではありません。一方、この問題は、システムに流動性を高めるために実験をどのように変更できるかを調査する機会を提供します。
これらの科学的課題は、システムに関する新しい知識を可能にするエキサイティングな機会を提供します。微小管タクトイドをより双極性にするために、より短い微小管を使用することができる。しかし、微小管にはアクチンのように長さを制御するためのよく特徴付けられたキャッピングタンパク質があまりないため、追加の課題があります。核生成および成長の使用は、短い微小管を作るために非常に高い濃度のチューブリンおよびGMPCPPの使用を必要とする。チューブリン濃度が高いと、系内のフィラメントの数が多くなり、タクトイドを互いに分離することがより困難になります。DARPin33などの新しい微小管キャッパーの追加は、この状況に役立つ可能性があります。微小管が不動であるという第2の問題は、有糸分裂に使用されるモーターの四量体であるキネシン-534などのモータータンパク質を添加することによって緩和することができる。あるいは、二量体キネシン−1の人工二量体、15を使用することができる。
流動性を高めるもう1つの方法は、微小管が動的不安定性、微小管の成長と縮小を実行できるようにすることです。現在、安定したGMPCPPフィラメントを播種し、その後動的不安定性を受ける微小管は、スピンドルまたはタクトイドを形成するために望まれるよりもはるかに長く、ファンまたはバンドルのような非常に長い組織をもたらすであろう。したがって、微小管の動的不安定性を加えることは、タクチイド形状を維持するために慎重に行う必要がある。長さを制御できる関連タンパク質および酵素の添加は、この問題を緩和する可能性がある。例えば、キネシン-1335などの解重合キネシンや、カタニン36などの切断酵素が必要になる可能性が高い。これらの実験は複雑で困難ですが、結果が何を明らかにしようとも非常に洞察力に富んでいます。将来の実験がどの方向を向いても、微小管タクトイドを作成するためにここで開発されたプラットフォームは、微小管組織の物理的基盤に関する新しい情報を公開することができます。

有糸分裂による細胞分裂は、生命を維持するための最も重要な生物学的プロセスの1つです。チューブリン二量体で構成される微小管フィラメントは、このプロセスに不可欠な構造要素である。染色体が細胞中心に整列している中期に作られた一過性機構は、その形状から有糸分裂紡錘と呼ばれ、糸で覆われた織機の紡錘体のようなものです(図1A)。微小管が中期に使用され、凝縮した染色体を細胞の中心に押し込んだり引いたりして、それらを整列させ、分裂後期に引き離す微小管に接続することは、多くの生物にわたって十分に確立されています(図1B、C)。紡錘体は減数分裂(図1B)と有糸分裂(図1C)の両方で形成され、糸のように中心軸の周りに巻き付けられていないが界面に平行に走る多くの重なり合う微小管から形成される。これらの微小管ベースの構造を作成するには、架橋する関連タンパク質と、染色体1を押したり引いたりするのに役立つモーターとして働くことができる関連酵素が必要です。
減数分裂スピンドルの研究は、微小管が短く、動的であり、架橋アレイ2、3、4、5、6において重なり合っていることを示している(図1Di)。これらの短い微小管の物理的組織のために、減数分裂紡錘体は液晶タクトイドに似ています(図1E)。実際、スピンドルは、液晶タクトイド5から予想されるように、合体して結合することが示されている。
1960年代にさかのぼる多くの研究は、固定、連続切片、および電子顕微鏡を用いて、有糸分裂紡錘体7,8,9,10の内側に2種類の微小管があることを確認しました。最初のタイプはキネトコレ微小管と呼ばれ、スピンドルポールをキネトコレに接続します。第2のタイプは、染色体を過ぎて成長し、中間ゾーンで重なり合う極性間または極性微小管と呼ばれる(図1Dii)8、9、10。第3のタイプは、紡錘体の外側にあり、極を細胞縁に接続するアストラル微小管と呼ばれる。これらの微小管組織は、現在の議論の範囲外である。オーグミン6とガンマチューブリン環複合体の相互作用が微小管の核生成中心に影響を与え、図1Dのようなより短い微小管を有する有糸分裂紡錘体をもたらす最近の研究がある。
微小管は幅よりも長く、高いアスペクト比と高い剛性を持つため、液晶分子のスケールアップ版のようなものです。ソフトマター物理学では、原子や分子は、核生成や結晶の融解を含む相転移の物理的メカニズムを推測するために、最小限の相互作用を使用して近似されています11。同様に、微小管は、液晶分子のスケールアップされたバージョンであるメソスケールの物体であり、等方性相からのネマチック相の核生成および成長を含む、液晶ダイナミクスの物理学への洞察を与える。また、上述したように、減数分裂スピンドルは、液晶タクトイドのような性質、液晶分子3、4、5の等方性状態から核形成して成長するネマチック状態を示す。タクトイドの場合、核生成と成長は他の結晶の核生成と成長に似ています(つまり、比較的高濃度のメソゲン[液晶を形成する分子]が必要です)。タクトイドのユニークな「スピンドル」形状は、ネマチック相に整列する液晶メソゲンの局所的な配向から来ています(図1E)。分子は非常に非対称であるため、丸みを帯びた結晶を形成することはできません。微小管の性質を考えると、局所的な高濃度の微小管から作られた有糸分裂紡錘体機構も、それがタクトイドまたは紡錘と呼ばれるかどうかにかかわらず、同じ形状であることはおそらく驚くべきことではない。タクトイドは、先細りの端に極を持つ双極性(図1Ei)または均質で、極が無限大に効果的にある(図1Eii)ことができます。
紡錘体形成の重要性に鑑み、イオン種12、13、枯渇相互作用を生じるクラウディング剤14、15、および特定の微小管架橋タンパク質13、16、17、18、19を介して微小管縮合を束にすることを実証することにより、インビトロでの自己組織化紡錘体形成に向けた努力が進められており、驚くべきことに、これらの薬剤はすべて微小管の局所濃度を増加させるために働くが、それらはしばしば長い微小管束をもたらすが、タクトイドは生じない。これらの束が長い理由の1つは、それらを構成する微小管も長いことであると考えられる。より短い微小管を用いた最近の研究では、末尾15で先細りになっていないより長い束も報告された。この場合、バンドルは、バンドルの伸長を引き起こすモータータンパク質と一緒に保持され、それによって、それらをより長くする。ここで説明するように、非伸張架橋剤を備えた短い微小管は、テーパー状の紡錘形のアセンブリに必要です。
最近、我々は、核形成安定微小管22の存在下で、反平行架橋剤MAP65を用いて微小管タクトイドの作成を可能にする技術を開発した。微小管は短くする必要がありましたが、微小管の長さの既知のレギュレーターで、微小管を動的不安定性またはエンドツーエンドのアニーリングに対してキャップできるものはほとんどありません。代わりに、GMPCPPを使用して、成長後のフィラメントを核形成および安定化させた。これにより、タクトイドに自己組織化できる高密度の短い微小管を作成することができました。これらのタクトイドは、複屈折下で見ると均質であった。短い微小管に加えて、特定の反平行架橋剤MAP65がタクトイドを形成するために採用された(図2)。MAP65は、有糸分裂架橋剤23のPRC1/Ase1ファミリーにおける植物微小管関連タンパク質である。MAP65は二量体として存在し、微小管24と同様にそれ自体に結合する強い親和性を有する。アクチンフィラメント25,26,27で観察された減数分裂紡錘体およびタクトイドは双極性であり、液晶の液体様特性を有するが、微小管タクトイドは固体状であることが観察されている22,28。
ここでは、微小管タクトイドを作成し、蛍光ベースの技術を使用してアセンブリの形状と構成成分の移動性を特徴付けるためのプロトコルが提示されています。

<table><tbody><tr><td>2% ジクロロジメチルシラン</td><td>GE ヘルスケア</td><td>118945</td><td>疎水性シラン表面処理。これは最大3回まで再利用でき、室温で1年間保存できます。</td></tr><tr><td>5分間エポキシ</td><td>ボブ・スミス・インダストリー</td><td></td>ズ <td>実験チャンバーのシーリング用</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャー</td><td>32900HPLC</td><td>100%</td></tr><tr><td>BL21細胞</td><td>バイオラボ</td><td>C2527I</td><td>MAP65を発現するために使用される有能な細菌細胞</td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>シグマ</td><td>C30-500MG</td><td>酸素捕捉システムの一部。300 mg / mlのストックはddH2Oで作られ、10 &mu;l アリコート in -20&deg;Cは最長1年間。</td></tr><tr><td>カバーガラス(22 mm x 22 mmまたは22 mm x 30 mm)</td><td>Fisher</td><td>12544-AP</td><td>実験チャンバー用</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>Sigma</td><td>43815-5G</td><td>ジスルフィド結合を切断し、酸素を捕捉するために使用される小分子。1 Mストックは、ddH2Oの粉末(シグマ)から作られています。溶液を分注し、-20°Cで最大1年間保存します。アリコートは7〜8回使用され、その後廃棄されます。</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-10G</td><td>チューブバッファー ベース成分</td></tr><tr><td>エッペンドルフ 0.5 ml チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>05 402 18</td><td>実験溶液保持用</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー</td><td>111000200</td><td>200プルーフ</td></tr><tr><td>ろ紙</td><td>Whatman</td><td>1004-110</td><td>洗浄および実験チャンバーへの溶液の引き込み用</td></tr><tr><td>高NAの蛍光顕微鏡対物レンズ</td><td>Nikon</td><td>Ti-E, W2 共焦点</td><td>イメージング実験用</td></tr><tr><td>フリーザー -20&deg;C</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13986148</td><td>試薬保存用</td></tr><tr><td>冷凍庫 -80&deg;C</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>328223H01-C</td><td>タンパク質の保存用。</td></tr><tr><td>シラン化用ガラス容器</td><td>マイケルズ</td><td></td><td>実験室の準備用-カバーガラスの処理</td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td>フィッシャー</td><td>12544-4</td><td>実験室用</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td>G7528-250G</td><td>酸素捕捉システムの一部。300 mg / mlのストックはddH2Oで作られ、10 &mu;l アリコート in -20&deg;C.</td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td>Sigma</td><td>G2133-250KU</td><td>酸素捕捉システムの一部。これは4°Cで保存されます。Cは最長1年間。</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-4055</td><td>GTPのゆっくりと加水分解可能なアナログは、微小管の核形成のための動的不安定性と自発的な臨界濃度を減らすことにより、微小管を重合し安定化し、一貫した長さを得るために使用されます。Jena Biosciencesから10 mMのストックを購入し、-20°Cで保管します。Cは最長1年間。</td></tr><tr><td>顕微鏡用発熱体</td><td>Okolabステージトップインキュベーター</td><td></td><td>イメージング実験用</td></tr><tr><td>イミジゾール</td><td>シグマ</td><td>I2399</td><td>ニッケルビーズからMAP65タンパク質を溶出してMAP65を精製するために使用</td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>フィ</td><td>ッシャー34155</td><td>洗浄および実験チャンバー内の溶液の引き込み用。</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P250-500</td><td>1 M in ddH2Oは、時間の経過とともに酸性化するのを防ぐために新鮮に作られています。</td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>エアガス</td><td>NI 230LT22</td>凍結<td>アリコートをドロップします。これは、保存にも使用できます(非推奨)</td></tr><tr><td>MAP65タンパク質</td><td>Ram Dixit</td><td></td><td>分子量65 kDの微小管関連タンパク質(MAP)で、反平行微小管架橋剤です。シロイヌナズナ由来のMAP65-1の非標識およびGFP標識バージョンを精製しました。GFP-MAP65と非標識MAP65を混合し、タンパク質の10%が標識されるようにします。ワーキングストックは10.8&muです。Mソリューション。この作業溶液は4°Cで保存されます。Cと毎週新しく作り直されています。MAP65およびGFP-MAP65を精製するためのプロトコルは、以前の方法の章(26)に記載されています。</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>シグマ</td><td>MKCJ940</td><td>チューブリン緩衝成分</td></tr><tr><td>NTA-ニッケルビーズ</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>6xHis タグ付き MAP65 タンパク質の精製に必要なビーズ</td></tr><tr><td>Optomicroscan</td><td>Nikon</td><td></td><td>405 nm レーザーシステム 関心領域の任意の形状にレーザーを集束させることができます</td></tr><tr><td>PEM80</td><td></td><td></td><td>80 mM K-PIPES、pH 6.8、1 mM MgSO4、1 mM EGTAから作られた溶液用の中性チューブリン重合ベースバッファー、4°Cで保存。Cは最長1年間。</td></tr><tr><td>永久両面テープ</td><td>3M - スコッチ</td><td>34-8724-5691-7</td><td>実験室用</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>フィッシャー</td><td>FB0875713</td><td>湿潤室</td></tr><tr><td>用 パイプ</td><td>ス Σ</td><td>P7643-100G</td><td>チューブリン緩衝液 基剤</td></tr><tr><td>成分 Pluronic-F127</td><td>Σ</td><td>P2443-250G</td><td>両端に2つの親水性ポリエチレンオキシド(PEO)ブロックと、ポリフェニレンオキシド(PPO)疎水性表面コーティングの疎水性センターブロックを備えたブロック共重合体で、表面へのタンパク質の結合を防ぐために使用します。Pluronic-F127は粉末(Sigma)として購入し、ddH2O中の5%(w/v)溶液に一晩溶解します。溶解した溶液は、室温で最大1年間保存できます。</td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール</td><td>Affymetrix Inc</td><td>19966 500 GM</td><td>タクトイドを表面に持ってきて微小管を組織化するのを助けるために枯渇力を作り出すために使用されるクラウディング剤。PEM80で100kDaのPEGの5%(w / v)溶液を作成します。溶液は4°Cで保存されます。Cを最大1年間保持し、ロッカーに置いてから使用してください。粘性があるため、容積式ピペットを使用して作業することをお勧めします。</td></tr><tr><td>容積式ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>粘性液体のピペッティング用</td></tr><tr><td>カバーガラス用ラック</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72240</td><td>実験チャンバーの準備用-カバーガラスの処理</td></tr><tr><td>冷蔵庫 4&deg;C</td><td>Fisherbrand</td><td></td> 試薬<td>の保存用</td></tr><tr><td>チューブリン標識</td><td>サイトスケルトン</td><td>TL590M</td><td>凍結乾燥ロダミン標識チューブリン ブタの脳から購入し(Cytoskeleton)、-80°Cで保存します。PEM80で水和するまでCを含まず、最長1年間使用します。</td></tr><tr>ブタの脳からの<td>Tubulin蛋白</td><td>質Cytoskeleton</td><td>T240</td><td>凍結乾燥チューブリン99%の純粋な非標識は購入され(Cytoskeleton)、-80°Cで保存される;PEM80で水和するまでCを含まず、最長1年間使用します。</td></tr><tr><td>UV-Ozone</td><td>Jelight</td><td>Model 342</td><td>実験室の準備に - カバーガラスの処理</td></tr><tr><td>Stackreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td> <td>ドリフトを除去するための時系列データを登録するためのプラグイン</td></tr><tr><td>Turboreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td> <td>ドリフトを除去するための時系列データを登録するためのプラグイン</td></tr></tbody></table>

微小管タクトイドの自己組織化

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

細胞骨格は、細胞内の主要な内部組織化および再編成を担うが、すべて変更を指示するマネージャーがいない。これは、有糸分裂または減数分裂の間に特に当てはまり、微小管が細胞分裂中に紡錘体を形成する。スピンドルは、細胞分裂中に遺伝物質を分離するために使用される機械です。 in vitroで自己組織化されたスピンドルを作るために、我々は最近、微小管関連タンパク質とクラウディング剤の最小セットで微小管をスピンドル状の集合体に再構成する技術を開発しました。具体的には、植物由来の逆平行微小管架橋剤であるMAP65、酵母由来のAse1および哺乳動物由来のPRC1のホモログを用いた。この架橋剤は、微小管を長くて細い紡錘形の微小管自己組織化集合体に自己組織化する。これらのアセンブリも液晶タクトイドに似ており、微小管はメソスケールのメソゲンとして使用することができる。ここでは、これらの微小管タクトイドを作成するためのプロトコル、ならびに蛍光顕微鏡法を用いたアセンブリの形状およびフォトブリーチング後の蛍光回収を用いた構成成分の移動度を特徴付けるためのプロトコルが提示される。

少数の成分、チューブリン二量体、および微小管架橋剤のみで、微小管タクトイドを形成することができる(図2A)。このプロトコルは、インキュベーター内で微小管を核形成および成長させるためのインキュベーションを記述しているが、核生成および成長は顕微鏡下で直接観察することができる(30分以内に完了する)(図2B)。チューブリンの濃度は13.6μmで一定に保たれ、MAP65-MT結合は10%である。
図 4 は、成功したデータを表しています。タクトイドは、チューブリンチャネルの561nmレーザーとMAP65チャンネルの488nmの両方のレーザーで見えるはずです(図4A)。この系の謎の1つは、微小管の長さ、MAP65濃度、およびクラウディング剤(図4B)22,28の変更を含む、さまざまな実験的変化の下でタクトイドの幅が変化しないように見えることである。長さははるかに可変であり、微小管の長さとMAP65濃度の両方に依存する(図4B)22,28。
FRAPを実行すると、MAP65信号は回復するが、微小管信号は回復しないことが観察されている(図5)。FRAPの回復は、ラベル付けされた物体および光漂白された物体の移動性および移動性によるものである。MAP65の場合、暗くなった分子は解離して微小管から遠ざかり、新しい分子が領域に移動します(図5)。MAP65結合は平衡状態にあるため、結合と非結合の速度は等しくなります(1秒あたりの分子数で測定)。微小管については、微小管がタクトイドを離れることができないことを示唆する回復は見られなかった(図5A、Bi、C)。さらに、黒ずんだ領域の広がりは見られず、微小管は局所的に不動であり、タクチイド形状内の流体ではないことが示唆された。
<img alt="中期染色体の整列;紡錘体構造と微小管組織;顕微鏡図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:スピンドル形成のさまざまなモデル。 有糸分裂紡錘体は、微小管とそれに関連するタンパク質と酵素で作られた機械で、細胞分裂中に染色体を整列させ、2つの新しい娘細胞に分離します。(A)オランダの細い糸を持つ中世初期のドロップスピンドルレプリカの画像。この図は、Peter van der Sluijs30によるウィキメディアの画像から修正されています。(B)野生型減数分裂の異なる段階における微小管の三次元再構成II.微小管は緑色で示され、染色体は灰色で示されている。スケールバー = 1 μm。この図はLantzschら31から修正されている。(c)分裂したSf9細胞の有糸分裂紡錘体における微小管の顕微鏡観察像。紡錘体の極および微小管は、緑色蛍光タンパク質で標識されている。スケールバー = 5 μm。この図はAdvani et al.32から修正されています。(D)有糸分裂および減数分裂紡錘体微小管がどのように組織化されるかの異なるモデル。(i)アフリカツメガエルの卵抽出物から作成された減数分裂紡錘体について以前に観察された微小管(緑色)は、紡錘体全体にわたって短くて動的であると推定された。これは、液晶内部のバイポーラタクトイド組織に似ています。(ii)有糸分裂紡錘体内部の微小管組織の正準モデルには、染色体の周りの中間帯で架橋する極間または極性微小管(濃い緑色)と、染色体を押したり引いたりするために極からキネトコレに束ねられて引き伸ばされたキネトコリア微小管(薄緑色)の2種類の微小管がある。すべての画像において、染色体は透明な青色で示され、紡錘体極は濃い緑色で表される。(E)(i)バイポーラおよび(ii)均質なタクトイドに対する液晶タクトイド中のメソゲン(緑色の線)の回路図。双極性タクトイドはタクトイドの端に2つの極を持ち、メソゲンはそれらの極を指すように向きを変える。均質なタクトイドは無限大に極を持ち、メソゲンはタクトイドの長さに沿って向きを変えません。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="タクトイド形成方法の概略図と時系列。微小管、MAP65架橋、顕微鏡検査。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> (A)微小管は、イオン種、クラウディング剤によって引き起こされる枯渇力、およびMAP65などの特定の微小管架橋剤を含む様々な方法によって束ねられ、架橋され得る。(i)チューブリン二量体とMAP65タンパク質が混合され、微小管を核形成および成長させる。(ii)微小管は、チューブリンから核形成して成長し、MAP65は直ちに微小管、別のMAP65モノマー、またはその両方に結合し、バンドルを引き起こす。(iii)架橋束中の微小管が核形成して成長する。(iv)最終的な構成は、紡錘体に似た微小管タクトイドである。(b)105分にわたって核形成および成長する微小管タクトイドの時系列。スケールバー = 5 μm。図はEdozie et al.22から翻案された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="顕微鏡でのサンプルの流れ方向分析のためのシラン化カバーガラスを備えたフローチャンバー図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図3:フローチャンバアセンブリ フローチャンバは、スライドガラス、シラン処理カバーガラス、および永久両面テープを使用して作られています。黄色で強調表示された領域は、サンプルが流れて観察される流路です。フローチャンバの容積は約20μLで、エポキシを使用してチャンバの端部を密封し、数時間にわたる長期イメージング中にサンプルが蒸発するのを防ぎました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="タクトイド分析:微小管およびMAP65チャネル、マージ画像、長幅定量化、グラフ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図4:タクトイド画像と長さと幅の分析。 (a)記載されたように形成され、スピニングディスク共焦点を用いて画像化されたタクトイドの例データは、(i)561nmレーザーを用いたローダミン標識チューブリンの微小管チャネルイメージング、(ii)488nmレーザーを用いたGFPのGFP−MAP65チャネルイメージング、および(iii)微小管チャネル(マゼンタ)およびGFP−MAP65チャネル(シアン)からのマージオーバーレイ画像を示す。オーバーラップ領域は白色で表示され、微小管とMAP65が正確に共局在することを示す。スケールバー = (A)のすべての画像について10μm。(B)タクトイドの長さと幅の定量化。(i)標識なしで分析されるタクトイドの画像。スケールバー = 5 μm. (ii) (i) と同じ画像で、長さ (ラインキャップ付きの実線) と幅 (破線) の測定値を示します。(iii)幅は、(ii)で示された垂直な二等分線(破線)でタクトイドを横切る強度プロファイルをとることによって測定した。強度プロファイルは、タクトイドの振幅と幅を明らかにするためにガウス関数に適合した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="FRAP分析:微小管、MAP65時系列、強度チャート。蛍光回復動力学" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> (A)微小管タクトイドおよび(ii)GFP-MAP65の顕微鏡時系列データ、および(iii)マゼンタおよびシアン中のGFP-MAP65の微小管を有する両チャネルのオーバーレイ画像((B)時間63秒でフォトブリーチされ、さらに5分間観察された(i漂白領域(マゼンタ円)および背景(濃い灰色の円)における微小管チャネル(ii)漂白領域におけるGFP−MAP65チャネル(シアンの正方形)および背景(濃い灰色の正方形)。(C)データはバックグラウンドノイズに対して補正され、微小管チャネル(マゼンタ円)およびGFP-MAP65チャネル(シアンの四角)に対して再スケーリングされた。微小管は回復しませんが、GFP-MAP65は上昇する指数関数的減衰にフィットし(濃い灰色の線)、振幅と回復の時間スケールを見つけることができます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

この記事では、植物ベースの微小管架橋剤であるMAP65およびPEGをクラウディング剤として使用して、タクトイドの形状の微小管アセンブリを形成するためのプロトコルを提示する。

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

このプロトコルは、抗並列架橋剤MAP65を使用して微小管タクトイドの自発的な自己組織化を可能にする。このシステムは、微小管組織や有糸分裂紡錘体のような生物学的システムを理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、微小管の紡錘形のような形状を再現できる最小限のシステムであり、再現性が高く、多くのラボがアクセス可能であることです。この方法は、セルラー系に適用できるだけでなく、メソスケールの液晶研究のモデルとしても機能します。チューブリンを調製するには、まずマイナス80°Cの冷凍庫から凍結乾燥チューブリン1ミリグラムを含む標識されていないチューブリンのアリコートを取り出し、氷上に保管する。次に、200マイクロリットルの冷たいPEM-80を加える。すべての凍結乾燥剤を溶解するには、チューブを氷上に10分間保ちます。次に、マイナス80°Cの冷凍庫から凍結乾燥チューブリン粉末20マイクログラムを含むローダミン標識チューブリンのチューブを取り出し、氷上に保管する。次に、4マイクロリットルの冷たいPEM-80を加え、チューブを氷上に10分間保ち、すべての凍結乾燥物を溶解する。凍結乾燥チューブリンが溶解したら、再懸濁された非標識チューブリン溶液を100マイクロリットルのローダミン標識チューブリン溶液に加える。次いで、溶液を6〜7回非常にゆっくりと配管して混合する。残りの100マイクロリットルの標識されていないチューブリン溶液を保存するには、まずチューブを液体窒素に挿入して溶液を凍結し、次にチューブをマイナス80°Cに保ちます。次に、チューブリンミックスを7つの新しいチューブに分配し、それぞれに15マイクロリットルを加えます。前述のようにチューブを液体窒素で凍結し、将来の使用のためにマイナス80°Cで保管してください。実験を行うためのフローチャンバを組み立てるには、まずスライドガラスを二重蒸留水で洗浄し、糸くずのない実験室用ワイプで乾燥させます。次に、最初にエタノールでスライドを洗浄し、続いて二重蒸留水で洗浄します。流路を作成するには、長さ40~50mmの両面テープを切り取ります。次に、それを間に分割して2つの薄いテープストリップを作成し、2つのストリップを5〜8ミリメートル離してスライドの上に置きます。次に、シラン処理されたカバースリップを流路の上に置きます。次に、スライドとカバーを密封し、ペンの裏側でテープ領域を軽く押して両面テープストリップを滑らせます。シールがうまく作られていれば、テープは半透明から透明に変わるはずです。端の余分なテープを取り外すには、フローチャンバの入り口からわずか1ミリメートルを残して、カミソリの刃でテープを切断します。次いで、タクトイド実験を行うための適切な実験パラメータでチャンバーにラベルを付け、まず、氷上で必要な試薬をすべて解凍し、作業中に氷上に保存する。次に、PEM-80に溶解した20マイクロリットルの5%非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤でフローチャンバをコーティングし、チャンバの両端に小さな滴を塗布して、内部に気泡が形成されないようにします。その後、フローチャンバをペトリ皿製の湿気の多いチャンバに入れ、濡れた糸くずのない実験室用ワイプで少なくとも5〜7分間保管します。次に、PEM-80、GMPPCPP、プルロニックF-127、ジチオスレイトール、グルコース、ポリエチレングリコール、先に作製したチューブリンミックス、及びMAP65とGFP MAP65をピペッティングして滅菌チューブ内で可視化のために5~6回混合し、チューブを氷上に保った。次いで、グルコースオキシダーゼとカタラーゼの予備混合溶液をチューブリン-MAP混合物のチューブに1マイクロリットル加え、配管を7〜8回ずつ再度混合する。溶液の全体積を2つの部分に分割して、別々のチャンバーで使用します。一方、フローチャンバに以前に添加された液体は、チューブリン-MAPミックスをフローチャンバに添加するとともに、チャンバのもう一方の端にある糸くずのない実験室ワイプを使用して、毛細管現象によって除去されなければならない。サンプルがチャンバー内に完全に入ったら、5分間のエポキシを使用してチャンバーの両端を密閉し、37°Cで約30分間保持して微小管タクトイドを核形成および成長させます。蛍光顕微鏡によるタクトイドのイメージングには、蛍光で十分な光を集めるために、60倍以上の倍率で1.2以上の開口数を持つ対物レンズを使用してください。無料の金属酸化物半導体または電荷結合デバイスカメラで画像を記録します。サンプルを維持するには、摂氏 37 度に設定した環境チャンバーに保管してください。あるいは、熱風ステージヒーターおよび循環温水を有する客観的温度制御カラーを含む他のステージヒーターをこの目的のために使用することができる。ローダミンチューブリンの正しい蛍光を得るためには適切な励起源が不可欠であるため、サンプルに少なくとも1ミリワットの電力を持つ561ナノメートルレーザーを使用して、高品質の画像を提供します。ただし、GFP MAP65 の場合は、励起源を 488 ナノメートルのレーザーに変更します。広視野落射蛍光顕微鏡を使用する場合は、励起が540 12.5ナノメートル、ダイクロイックが545ナノメートル、カットオフが52.5ナノメートル、およびロングパスが575ナノメートルの発光を持つローダミンフィルターキューブを使用します。GFP MAPの場合は、励起が480 15ナノメートル、ダイクロイックが505ナノメートル、15ナノメートルがカットオフされ、発光が515ナノメートルのロングパスのGFPフィルターキューブを使用します。照明パワーと露光時間がカメラの強度スケールが飽和しないようにした後、異なる領域の少なくとも10枚の画像を撮影して、赤と緑の両方のチャンネルで100タクトイド以上を画像化し、分析のために16ビットTIFF画像として保存します。このプロトコルを使用して、形成が30分以内に完了する微小管タクトイドを顕微鏡下で直接可視化することができる。タクトイドは、チューブリンチャネルの561ナノメートルレーザーとMAP65チャンネルの488ナノメートルレーザーの両方で見えます。画像も互いに完全に重なり合っています。この方法では、タクトイドの長さと幅も測定することができた。タクトイドの強度プロファイルは、その幅によって変化することが判明した。さらに、微小管タクトイドの不動性は、フォトブリーチング後の蛍光回収またはFRAP実験によって実証されたが、フォトブリーチング後の蛍光の回収は示されなかった。一方、FRAP実験はMAP65の可動性を明らかにし、そのために光退色後に徐々に回復し、蛍光を観察することができた。MAP65によるこの蛍光回収は、回復の振幅および時間スケールを見つけるために、上昇する指数関数的減衰に適合させることができる。タクトイド実験の部分は、チューブリンが氷上ですぐに悪くなる可能性があり、タクトイドの核生成に有害である可能性があるため、10〜12分以内に完了する必要があります。異なる微小管架橋タンパク質と架橋モータータンパク質(微小管を動かすことができる酵素)との将来の研究は、有糸分裂紡錘体の自己組織化に関する新しい情報を明らかにし続けるでしょう。

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Biochemistry

生物化学

このビデオでは、アクチンと微小管の重合ダイナミクスを視覚化するための全反射顕微鏡ベースの手法であるTIRFについて説明しています。この手法により、細胞のクロストークを理解するために不可欠な、アクチンと微小管の結合ダイナミクスをリアルタイムで高解像度でイメージングできます。...

アクチンと微小管の結合ダイナミクスを可視化するTIRF顕微鏡法

微小管は本質的に不安定なポリマーであり、成長との間の短縮その切り替えは、確率および制御することは困難である。ここでは、photoablatable安定キャップでセグメント化された微小管を使用してプロトコルを記述します。セグメント化された微小管の脱重合することにより、分解、微小管末端を有する運動の分析を支援する、高い時間および空間分解能でトリガすることができる。...

逆アセンブル微小管端部によって駆動される運動を研究するセグメント化微小管の調製

ここでは、TIRF顕微鏡ベースの インビトロ...

TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

ここでは、微小管束を in vitroで...

再構成された活性微小管束内の力を直接測定

このプロトコルは、 in vitro 全内部蛍光(TIRF)顕微鏡アッセイを使用して動的アクチンおよび微小管を視覚化するためのガイドです。...

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのイン ビトロでの 可視化

ここで紹介するのは、微小管およびキネシンモーターから活性ネマティクスを調製する方法であり、タンパク質の調製および構築、ならびに活性ネマチック閉じ込めのためのウェルの使用を含む。...

微小管ベースのアクティブネマティクスの形成、閉じ込め、観察

本稿では、測定、微小管と薬物治療に続く細胞内のタウのローカリゼーションのタウ結合タウ タウを測定するための標準プロトコルについて説明します。これらのプロトコルは、薬やタウ...

リン酸化と大腸癌細胞におけるタウ蛋白の局在と微小管結合の試金

本稿で、ショウジョウバエのグリセリン thoraxes...

ショウジョウバエのティッシュの最小限の量を使用してのグリセリンの繊維でミトコンドリアの酸素消費量の測定

ここでマウスの体内でビオチンと腎糸球体細胞表面タンパク質のラベリングのためのプロトコルを提案する.このプロトコルは、マウス腎臓の灌流、腎糸球体に分離および興味の蛋白質の内因性の免疫沈降を実行する方法について説明します。...

腎糸球体と腎糸球体細胞表面タンパク質の標識体内の分離

X線結晶学によるNEMOのIKK結合ドメインの構造決定のためのプロトコルについて説明する。この方法には、タンパク質発現、精製および特性評価、ならびに結晶最適化を成功させるための戦略および非結合形態のタンパク質の構造決定が含まれる。...

NEMOのIKK結合ドメインの生産・結晶化・構造決定

学ぶ微小管タクトイドの自己組織化法。植物由来のMAP65架橋剤とPEGを用いて、紡錘体様構造を再現する最小システムを構築します。蛍光顕微鏡で観察可能で、細胞生物学と液晶研究に応用できます。

微小管タクトイドの自己組織化

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