Name: 低コストカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を用いたhESCおよびNPCへのshRNAのレンチウイルス媒介送達 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 学ぶ低コストポリエチレンイミンを用いたレンチウイルス産生法。HEK293T細胞へのトランスフェクションとウルトラ遠心分離により、ヒト胚性幹細胞および神経前駆細胞へのshRNA導入効率を向上させる技術を習得できます。

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この研究は、アラブ首長国連邦大学(UAEU)からの研究助成金、助成金#31R170(ザイード健康科学センター)および#12R010(UAEU-AUA助成金)によって支援されました。ランドール・モース教授(ニューヨーク州オールバニーのワズワース・センター)が、スタイルと文法の原稿の編集を手伝ってくれたことに感謝します。
すべてのデータは要求に応じて利用可能です。

1. PEIまたはリポフェクタミン3000試薬のいずれかを使用したHEK293T細胞のトランスフェクション
<ol><li>HEK293T細胞をDMEM + 10% FBS + 1xペニシリン/ストレプトマイシン中で、5%CO2および21%O2 の雰囲気の加湿インキュベーター内で37°Cで培養し、トランスフェクションのために播種する前に90%コンフルエントになるまで培養 します。高力価ウイルス産生には比較的低い継代細胞数を使用する(理想的にはP30未満)。</li>
	<li>種子4 x106 細胞を100mm組織培養プレート中の10mLの完全な増殖培地中で、5%CO2および21%O2 の雰囲気を有する加湿組織培養インキュベーター中で一晩増殖させる。
</li>
	<li>トランスフェクションごとに、プラスミドDNA(1 mg/mLストック)を1.5 mL遠沈管内の無血清DMEM培地1 mLに希釈し、以下の比率のエントリープラスミドとパッケージングプラスミドを使用します。 エントリベクトル = 10 μg psPAX2.0 = 7.5 μg pMD2.G = 5 μg</li>
	<li>渦を10秒間、チューブを10,000 x gで回転させ、室温で30秒間回転させて収集します。</li>
	<li>チューブに70 μL(1 mg/mLのストック溶液)のPEIを加え、上記のようにボルテックスとスピンを短時間かけて回収します。使用されるPEIの体積は、全DNA(μg):P EI(μg)の1:3の比率に基づいています。</li>
	<li>リポフェクタミンベースのトランスフェクションの場合、キットに供給された45 μLの試薬Pを含む500 μLの無血清DMEM培地に上記のベクターを希釈し、室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>キットに供給された試薬Lの70 μLを500 μLの無血清DMEM培地を用いて希釈し、室温で5分間インキュベートする。</li>
	<li>両方のチューブの内容物を結合し、複合体形成を可能にするために室温で20分間チューブをインキュベートする。</li>
	<li>細胞を含むプレートにDNA/PEI1mLまたはDNA/リポフェクタミン複合体1mLを滴下し、5%CO2および21%O2 の雰囲気の加湿インキュベーター内で37°Cで6時間インキュベートする。
</li>
	<li>6時間後、新鮮な完全増殖培地(10mL)に交換し、細胞を5%CO2および21%O2 の雰囲気で加湿したインキュベーターに戻す。
</li>
</ol>2. LVS収集と超遠心分離
<ol><li>トランスフェクションの2日後、ウイルス含有培地を収集し、10mLの新鮮な完全増殖培地で細胞を再びオーバーレイする。</li>
	<li>トランスフェクションの3日後、ウイルス含有培地を収集し、2日の時点で収集されたウイルス含有培地と組み合わせる。</li>
	<li>ウイルス上清を2,000 x gで4°Cで10分間遠心分離し、細胞破片をペレット化する。</li>
	<li>0.45 μmの孔径の低いタンパク質結合フィルター(PESまたはSFCAのいずれか)を使用して上清をろ過し、超遠心分離の準備ができるまで4°Cで保存します。レンチウイルス粒子を含む濾過された上清は、ウイルス力価を有意に低下させることなく、4°Cで5日間保存することができる。</li>
	<li>カップを保持する超遠心管を70%エタノールで10分間洗浄して滅菌し、風乾、閉じ、4°Cに保ちます。</li>
	<li>レンチウイルス粒子を含む濾過培地36mLを滅菌超遠心チューブに加える。</li>
	<li>滅菌ストリペット5 mLを滅菌20%スクロース溶液(PBSで調製)4 mLで満たし、LVSを含む超遠心管(UC)の底部に直接分注します。スクロース溶液が媒体と混合されず、チューブの底に勾配を作ることが重要です。</li>
	<li>無血清DMEM培地を使用してすべての超遠心チューブのバランスを取り、冷たい超遠心チューブ保持カップに入れ、蓋を閉めます。</li>
	<li>チューブを125,000 x gで4°Cで2時間回転させます。</li>
	<li>スピン後、ペレットを乱すことなく漂白剤を入れた容器にチューブの内容物を反転させて上清を慎重に捨てる。ペレットが表示されている場合はマークを付けます。</li>
	<li>超遠心チューブを50 mL滅菌チューブに入れ、ペレットの上部に200 μLの滅菌DPBSを正確に加えます。4°Cで一晩邪魔されずに保管してください。</li>
	<li>翌日、上下40倍のピペッティングで穏やかに混ぜる。</li>
	<li>卓上遠心分離機で13,000 x gで短時間回転させ、破片をペレット化します。</li>
	<li>上清を新しいチューブに移し、ウイルス調製物を20 μLアリコートとしてアリコートします。-80°Cで保存してください。</li>
	<li>ウイルス力価測定のために5μLの調製物を脇に置いておきます。</li>
</ol>3. pLKO.1ベースのベクターのLVS力価測定
<ol><li>レンチウイルス粒子の力価は、製造元の推奨に従ってqPCRを使用して決定します。</li>
	<li>標準曲線の場合、各ステップで5 μLのDNAを45 μLのヌクレアーゼフリーH2Oに希釈することによって、標準対照DNA(キットに付属)の5つの10倍段階希釈液を調製する。標準曲線を生成するには、1:100 ~ 1:100,000 の希釈を使用します。</li>
	<li>氷上での反応を次のように重複して設定します。 2x qPCR マスターミックス 10 μL プライマーミックス 2 μL サンプルまたは標準 DNA 2 μL ヌクレアーゼフリーH2O6μL</li>
	<li>キットのマニュアルに記載されているサイクリング条件を使用して、合計 35 サイクルで qPCR を実行します。</li>
	<li>サイクルしきい値 (Ct) 値を Y 軸にプロットし、ウイルス力価を X 軸にプロットします。</li>
	<li>4 つの標準対照 DNA 希釈液 (1:100 ~ 1:100,000) を使用して対数回帰を生成し、トレンドライン方程式を使用して未知のウイルスサンプル力価を決定します。</li>
</ol>4. pll3.7ベースのベクターのLVS力価測定
<ol><li>感染の24時間前に、P12ウェルプレートの各ウェル中の種子1 x105 個のHEK293T細胞を1mLの完全な増殖培地に入れた。</li>
	<li>培地に8 μg/mLのポリブレンを加え、滅菌した各1.5 mLチューブに1 mLを加えます。</li>
	<li>4 μL、2 μL、1 μL、0.5 μL、および 0.1 μL の濃縮レンチウイルス粒子をそれぞれ 1 mL のポリブレン含有培地中で使用して、ウイルス粒子を希釈します。</li>
	<li>HEK293T細胞由来の培地を、8μg/mLのポリブレンとともに指示量のレンチウイルス粒子を含む培地と交換し、5%CO2および21%O2の雰囲気の加湿インキュベーター内で37°Cで24時間インキュベートする。</li>
	<li>翌日、新鮮な培地に変更し、5%CO2および21%O2の雰囲気を有する加湿インキュベーター内で37°Cで72時間培養を続けた。</li>
	<li>72時間後、細胞をPBSで洗浄し、製造業者のプロトコールに従って37°Cでトリプシン処理し、1mLのPBSに再懸濁した。</li>
	<li>メーカーの推奨に従って、セルソーターを使用してFACSセルソーティングを実行します。非感染HEK293T細胞を用いてゲートを0%GFP陽性細胞に設定し、各サンプルについて50,000イベントをカウントして、各ウイルス希釈に対する陽性細胞の割合を決定する。</li>
	<li>レンチウイルス粒子の力価を計算するには、%GFP陽性細胞を2%〜20%の範囲で与えるレンチウイルス粒子の体積のみを使用します。</li>
</ol>5. hESCの感染と安定した選択
<ol><li>6ウェル細胞培養マルチウェルプレートの各ウェルで増殖する2mLのPBSで細胞を洗浄する。</li>
	<li>1mLの1x細胞解離試薬を用いて細胞培養プレートから細胞を剥離し、37°Cで5分間インキュベートした。</li>
	<li>DMEM/F12培地で細胞を回収し、室温で1,500 x gで5分間遠心分離して細胞ペレットを回収します。</li>
	<li>吸引し、細胞を1mLに再懸濁し、血球計数器を用いて計数した。</li>
	<li>10 ng/mL 塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)、ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)、および 10 μM ROCK 阻害剤 (RI) を添加した mTeSR1 を含む 2 x105 cells/mL の完全な増殖培地で細胞懸濁液を作ります。</li>
	<li>種子1 x 105個の細胞を50x 完全基底膜マトリックスコーティングP24ウェルプレート上で500μLの完全増殖培地で希釈し、5%CO2および21%O2 の雰囲気の加湿インキュベーター中で37°Cで細胞を培養した。
</li>
	<li>翌日、hESCを感染多重度(MOI)10で8μg/mLのポリブレンで感染させ、37°Cで8時間インキュベートする。</li>
	<li>8時間後、ウイルス含有培地を新鮮な増殖培地(-RI)と交換し、細胞が90%コンフルエントになるまで培養を続けます。</li>
	<li>ピューロマイシンの選択(0.8 μg/mL)は、細胞が90%のコンフルエント(通常、感染後48〜72時間)に達したときに開始します。</li>
	<li>選択が完了したら(通常4〜6日)、安定細胞を分割し(1:4)、凍結保存およびさらなる分析のために細胞を拡張する。</li>
</ol>6. H9由来神経前駆細胞(NPC)の形質導入
注:NPCは、前述のように、デュアルSmad阻害プロトコルを使用してH9細胞から誘導された19。
<ol><li>簡単に説明すると、H9細胞を37°Cで5分間細胞解離試薬で処理して単一細胞を生成し、10ng/mL塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、および10μM ROCK阻害剤(RI)を添加したmTeSR1を含む完全な増殖培地に再懸濁します。60,000細胞/cm2 の密度で1:50希釈したマトリゲルコーティング6ウェル細胞培養皿上の種子(0日目)。</li>
	<li>LDN193189(200 nM)およびSB431542(10 μM)を含む100%KSR培地に変更することにより、細胞が95%-100%コンフルエントに達したときに分化を開始します(day1)。</li>
	<li>2日目に、LDN193189(200 nM)、SB431542(10 μM)、およびXAV939(5 μM)を添加した100%KSRでメディアを再度交換します。</li>
	<li>分化の4日目に、LDN193189(200nM)、SB431542(10μM)、およびXAV939(5μM)を有するKSR培地(75%)およびN2培地(25%)の混合物に切り替える。</li>
	<li>6日目から12日目まで、N2培地を毎日25%増やし、2日ごとに培地を交換することにより、LDN193189(200nM)、SB431542(10μM)、およびXAV939(5μM)を添加した100%N2に培地を徐々に切り替えます。</li>
	<li>培養12日目のNPCは、20ng/mL bFGFを添加したN2:B27培地中で行った。</li>
	<li>2 mLのNPCs培養培地で1:50希釈した完全基底膜マトリックスコーティングP6プレートの各ウェルに2 x 105個の細胞 をシードし、細胞が付着できるようにインキュベートする。</li>
	<li>翌日、8μg/mLポリブレンの存在下でMOI 6でレンチウイルス粒子で細胞を感染させる。</li>
	<li>8時間後、ウイルス含有培地を新鮮なNPC増殖培地と交換する。</li>
	<li>翌日、感染を繰り返し、8時間で培地を交換します。</li>
	<li>さらなる分析のために回収する前に、細胞を72時間培養に保持する。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、利益相反は存在しないと宣言しています。

研究または臨床目的のために幹細胞を遺伝子改変する能力は、技術およびhESCの生物学の基本的な理解の両方によって制限される。リポフェクションやエレクトロポレーションなど、マウスESCにおいて大きな可能性を示している技術は、従来の方法では遺伝子送達が困難であることで悪名高いhESCにとって非常に効率的ではない20。この概念は、既存の技術の最適化だけでなく、hESCにおけるトランスフェクション効率を高めるための新しい方法の開発にもつながっています。これらの新しい開発の焦点は、hESCsの成長、多能性、および分化可能性への影響を長期間にわたって最小限に抑えながら、hESCへの効率的で安定した遺伝子送達であった。これらの厳格な基準を満たす様々な新しい開発の中には、hESCへのレンチウイルス媒介遺伝子導入があります21,22。特定の遺伝子を発現するレンチウイルス粒子を製造するために、所望の遺伝子を転写ベクターの1つにクローニングし、パッケージングプラスミドと共にHEK293T細胞にトラ...

胚盤胞内部細胞塊に由来するヒト胚性幹細胞(hESC)は多能性であり、in vitro条件下で外的要因に応じて異なる細胞型に分化することができる1,2。hESCの可能性を最大限に引き出すためには、これらの細胞に対して迅速かつ信頼性の高い遺伝子送達方法が不可欠です。従来、使用される技術は、大きく2つのタイプに分類することができる:非ウイルスおよびウイルス遺伝子送達系3、4。より頻繁に使用される非ウイルス遺伝子送達系は、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびヌクレオフェクションである。非ウイルス送達系は、挿入変異が少なく、免疫原性の全体的な低下のために有利である5,6。しかしながら、これらの方法は、低いトランスフェクション効率および短い一過性遺伝子発現の持続時間をもたらし、これは長期分化研究のための主要な制限である7。エレクトロポレーションは、リポフェクションと比較してより良いトランスフェクション効率をもたらす。しかしながら、それは50%以上の細胞死をもたらす8、9、10。ヌクレオフェクションを使用すると、リポフェクションとエレクトロポレーションを組み合わせることで細胞の生存率とトランスフェクション効率を向上させることができますが、このアプローチには細胞固有のバッファーと特殊な機器が必要であり、したがって、スケールアップされたアプリケーションにとっては非常にコストがかかります11,12。
対照的に、ウイルスベクターは、形質導入後、改善されたトランスフェクション効率、ならびに全体的な低い細胞毒性を示している。さらに、送達された遺伝子は安定に発現しているため、この方法は長期的な研究に理想的です13。hESCへの遺伝子送達に最も一般的に使用されるウイルスベクターの中には、レンチウイルスベクター(LVS)があり、これは高力価のウイルス粒子14、15を使用して80%以上の形質導入効率を与えることができる。リポフェクションおよびCaPO4 沈殿は、HEK293T細胞またはその誘導体をパッケージングプラスミドとともに遺伝子導入ベクターで一過性にトランスフェクトしてレンチウイルス粒子を作製するために最も一般的に使用される方法の1つである16。リポフェクションは良好なトランスフェクション効率と低い細胞毒性をもたらすが、この技術はそのコストによって妨げられており、高力価のレンチウイルス粒子を得るためにスケールアップすることは非常にコストがかかるであろう。CaPO4 沈殿は、リポフェクションを用いて得られたものと比較的類似したトランスフェクション効率をもたらす。費用対効果は高いものの、CaPO4 沈殿はトランスフェクション後に著しい細胞死をもたらし、標準化を困難にし、バッチ間の変動を回避することを困難にしています17。このシナリオでは、高いトランスフェクション効率、低い細胞毒性、および費用対効果を提供する方法を開発することは、hESCに使用される高力価レンチウイルス粒子の製造にとって極めて重要である。
ポリエチレンイミン(PEI)は、細胞毒性をあまり持たずに高効率でHEK293T細胞をトランスフェクトできるカチオン性ポリマーであり、リポフェクションベースの方法と比較して無視できるコストを有する18。このような状況では、PEIは、様々な技術を用いて培養上清からのレンチウイルス粒子の濃縮を通じて、高力価LVS産生のスケールアップされた用途に使用することができる。提示された論文では、PEIを使用してHEK293T細胞をトランスフェクトし、スクロースクッションを介して超遠心分離を使用してレンチウイルスベクター濃度をトランスフェクトする方法について説明します。この方法を使用して、バッチ間の変動が少ない5 x107 IU/mLをはるかに超える力価を定期的に取得します。この方法は、hESCおよびhESC由来細胞への遺伝子送達のためのスケールアップされたアプリケーションに対して、シンプルで簡単で費用対効果が高い。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>38.5 mL、滅菌済み + 認定フリー オープントップ シンウォール ウルトラクリアチューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>C14292</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>bFGF 組換えヒト</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン FRAC V</td><td>Invitrogen</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopamine</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培地</td><td>Invitrogen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Nutrient mix F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DPBS w/o: Ca and Mg</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>胎児 bovie 血清</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb 抗体</td><td>CST</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution</td><td>GEヘルスケア</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Lグルタミン、100X&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2924190090</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH ポリクローナル抗体</td><td>Proteintech</td><td>15707-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH shRNA</td><td>Macrogen</td><td></td><td>Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1 complete media</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium 1X CTS</td><td>Invitrogen</td><td>A1371201</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 2 Supplement 100x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-11050</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 27 Supplement 50x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-07200</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin SOL</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pLKO.1 TRC ベクター</td><td>Addgene</td><td>10878</td><td></td></tr><tr><td>pLL3.7 ベクター&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>11795</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン感染試薬</td><td>Sigma</td><td>TR1003- G</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレン、分岐</td><td>Sigma</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2.0</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Tocris</td><td>4551/10</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>A1113802</tr><tr><td>ROCK阻害剤 Y-27632 二塩酸塩&nbsp;</td><td>トクリス</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>トクリス</td><td>1614/10</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン.05%EDTA&nbsp;</td><td>インビトゲン</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>トクリス</td><td>3748/10</td><td></td></tr></tbody></table>

低コストカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(pei)を用いたhescおよびnpcへのshrnaのレンチウイルス媒介送達

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI)

現在のプロトコルは、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびhESCに由来する神経前駆細胞(NPC)の両方に短いヘアピンRNA(shRNA)を高効率で送達するためのレンチウイルス粒子の使用を記載している。レンチウイルス粒子は、低コストのカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を使用してパッケージングプラスミド(pAXおよびpMD2.G)とともに、エントリーベクター(shRNAを担持)を使用してHEK293T細胞を同時トランスフェクトすることによって生成されました。ウイルス粒子を超遠心分離を用いて濃縮し、平均力価が5 x107を超える結果となった。hESCsおよびNPCsは、ピューロマイシン選択およびhESCにおける安定発現、ならびにNPCにおける一過性GFP発現によって示されるように、これらのレンチウイルス粒子を使用して高効率で感染することができる。さらに、ウェスタンブロット解析は、shRNAによって標的とされる遺伝子の発現の有意な減少を示した。さらに、細胞は、CNSの異なる系統へのその後の分化によって証明されるように、それらの多能性ならびに分化能を保持した。現在のプロトコルはshRNAの送達を扱っている。しかし、過剰発現研究のためのcDNAの異所性発現にも同じアプローチが使用できる。

遺伝子導入後、hESCの高い生存率が必然的に要求される。hESCのエレクトロポレーション後の細胞死を減らすためのプロトコルの努力と最適化にもかかわらず、これらの細胞のエレクトロポレーション後には50%以上の細胞死が依然として観察され、トランスフェクション効率は低い20。レンチウイルス媒介遺伝子導入は、遺伝子導入の高効率をもたらすだけでなく、形質導入後の高レベルの細胞生存率も示す。以下の結果は、hESC由来NPCにおけるレポーターおよび一過性発現としてGFPを使用するアプローチと、長期分化実験のためのhESCの安定選択のためにピューロマイシンを使用するアプローチの2つのアプローチを提示する。
第1の実験セットでは、pll3.7ベクターをレポーターとしてGFPを保有するshRNAを、第2世代のレンチウイルスパッケージングプラスミドpsPAX2.0およびpMD2.Gとともに同時トランスフェクトすることによって、レンチウイルス粒子を作製した。レンチウイルス粒子をトランスフェクション後48時間および72時間後に回収し、超遠心分離を用いて濃縮した...

低コストのカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を用いて、H9ヒト胚性幹細胞(hESC)およびH9由来神経前駆細胞(NPC)においてshRNAを安定的に発現させるレンチウイルス粒子を高効率で製造しました。

低コストカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を用いたhESCおよびNPCへのshRNAのレンチウイルス媒介送達

The current protocol describes the use of lentiviral particles for the delivery of short hairpin RNAs (shRNAs) to both human embryonic stem cells (hESCs) ...

HEK293T細胞のトランスフェクションは、90%コンフルエントで行わなければならない。また、レンチウイルスベクターろ過用の0.45ミクロンの低タンパク質結合フィルターの使用および超遠心分離用のスクロースクッションの使用も不可欠です。HEK293T細胞を、10%FBSおよび1Xペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM培地中で、5%二酸化炭素および21%酸素の雰囲気の加湿インキュベーター内で、トランスフェクションのために播種する前に細胞が90%コンフルエンシーに達するまで摂氏37度で培養することから始めます。100ミリメートルの組織培養プレート中の10ミリリットルの完全な増殖培地中の6つの細胞を4回10回シードし、5%二酸化炭素および21%酸素の雰囲気を有する加湿組織培養インキュベーター内で一晩増殖させる。トランスフェクションごとに、テキスト原稿に記載されているエントリープラスミドとパッケージングプラスミドの比率に従って、1.5ミリリットル遠心チューブ内の無血清DMEM培地1ミリリットル中のプラスミドDNAストック1ミリリットルあたり1ミリグラムを希釈します。チューブを10秒間ボルテックスし、室温で30秒間Gを10,000回で回転させて集めた。次に、ポリマーポリエチレンイミン(PEI)の原液1ミリリットルあたり1ミリグラムの70マイクロリットルをチューブに加える。再び、渦を巻き、チューブを短時間回転させる。リポフェクタミンベースのトランセクションの場合、ベクターを、キットに供給される45マイクロリットルの試薬Pを含む500マイクロリットルの無血清DMEM培地で希釈する。次いで、500マイクロリットルの同じ培地を用いて70マイクロリットルの試薬Lを希釈する。両方のチューブを室温で5分間インキュベートする。次いで、両方のチューブの内容物を結合し、室温で20分間インキュベートして複合体形成を可能にする。次に、細胞を含むプレートにDNA PEIまたはDNAリポフェクタミン複合体を1ミリリットル滴下し、5%二酸化炭素および21%酸素の雰囲気下で摂氏37度で6時間インキュベートする。インキュベーション後、培地を10ミリリットルの新鮮な完全成長培地と交換し、プレートをインキュベーターに戻します。トランスフェクションの2日後、ウイルス含有培地を収集し、10ミリリットルの新鮮な完全増殖培地で細胞を重ね合わせます。ここでも、トランスフェクションの3日後、ウイルス含有培地を収集し、2日間の時点で収集された培地と組み合わせる。ウイルス上清を2, 000倍Gで4°Cで10分間遠心分離し、細胞破片をペレット化する。0.45ミクロンの孔径の低いタンパク質結合フィルターを使用して上清をろ過し、超遠心分離の準備ができるまで摂氏4度で保存します。超遠心チューブの保持カップを70%エタノールで1

lentiviral-mediated-delivery-shrnas-to-hescs-npcs-using-low-cost

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

記事の詳細は微小電極アレイ（MEA）を使用して付着した哺乳動物細胞培養におけるsiRNAのスクランブル配列の部位特異的なトランスフェクションするためのプロトコル。...

微小電極アレイを用いたsiRNAの付着細胞への高効率、サイト固有のトランス体（MEA）

出典: Tagliafierro, L., et al.エピゲノム編集ツールをヒト人工多能性幹細胞由来疾患モデルに効率的に送達するためのレンチウイルスベクタープラットフォーム。J. Vis.

α-シヌクレイン発現のエピジェネティックな調節のための神経前駆細胞のレンチウイルス形質導入

このビデオでは、shRNAレンチウイルスベクターの形質導入を行い、不死化造血幹細胞および前駆細胞(iHSPC)で安定したノックダウン細胞株を得る方法を示します。...

Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in iHSPCs In Vitro:特定の遺伝子発現のノックダウンのためのレンチウイルスベースのshRNA発現システムのiHSPCへのデリバリー

ナノ粒子トラッキング解析（NTA）とポリマー遺伝子送達ナノ粒子を評価するためのハイスループットフローサイトメトリーのためのプロトコルが記載されている。国税庁は、ナノ粒子の粒度分布およびプラスミド当たり粒子分布を特徴付けるために利用される。ハイスループットフローサイトメトリーは、遺伝子送達バイオマテリアルのライブラリの定量的なトランスフェクション効率の評価を可能にします。...

ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

配信は、低分子干渉RNA（siRNA）の治療的実施のための主要な課題である。このプロトコルは、アルギニン及びポリエチレンイミングラフト化多孔質シリコン微粒子からなる多機能性および生体適合性siRNA送達プラットフォームの使用を含む。...

siRNAの治療を送達するための多孔質シリコンマイクロ粒子

このプロトコルの目標は、神経標的ペプチドを持つカチオン性/アニオン性リポソームをCNS送達システムとして使用し、siRNAがBBBを通過することを可能にすることです。 siRNAのような治療のための送達システムの最適化は、プリオンや他の神経変性疾患に対するより多くの治療選択肢を可能にするでしょう。...

カチオン性およびアニオン性リポソームを用いてCNSへの治療用のsiRNAの送達

この原稿は、PEI / MNPベクター及びその磁化により内皮細胞へのmiRの効率的な、非ウイルス送達を記載しています。このように、遺伝的改変に加えて、このアプローチは、磁気細胞ガイダンスやMRIの検出能が可能になります。技術は、治療用細胞製品の特性を改善するために使用することができます。...

準備と<em&gt;インビトロ</em磁化のmiR修飾内皮細胞の&gt;キャラクタリゼーション

ここでカチオン性 nanoliposomes、ドライ フィルム法に基づいており、安全のため使用することができますの生成のためのプロトコルについて述べるし、体外の効率的な配信は、メッセンジャー RNA...

体外の効率的な配信のカチオン性 Nanoliposomes の生成は、メッセンジャー RNA を転写

ポリエチレンイミン (PEI) を使用しての方法を述べる-siRNA 株マクロファージの超常磁性酸化鉄ナノ粒子をコーティングします。これらのナノ粒子は効率的に大食細胞の体外および体内と沈黙のターゲット遺伝子の発現を siRNA...

小さい干渉の RNA のマクロファージへの配信のための車両としてポリエチレンイミン被覆された酸化鉄ナノ粒子の in VitroとIn Vivo

編集を表す DNA エピゲノム強力な治療アプローチを対象としました。このプロトコルは、生産、精製、ひと誘導多能性幹細胞 (こと) のエピゲノム編集アプリケーションに CRISPR dCas9 DNMT3A 遺伝子をかくまっているオール ・ イン ・ ワン...

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

短いヘアピンRNA(shRNA)を運ぶレンチウイルスによってトランスネクションされた分散ヒトイストレット細胞から遺伝子改変ヒト擬似を作成するプロトコルが提示される。このプロトコルは、容易に入手可能な酵素および培養容器を利用し、容易に行うことができ、機能的および形態学的研究に適した遺伝子改変ヒト擬似性を産生する。...

低アタッチメントプレートで調製されたヒト擬似スイスレットにおけるレンチウイルス媒介遺伝子サイレンシング

学ぶ低コストポリエチレンイミンを用いたレンチウイルス産生法。HEK293T細胞へのトランスフェクションとウルトラ遠心分離により、ヒト胚性幹細胞および神経前駆細胞へのshRNA導入効率を向上させる技術を習得できます。

低コストカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を用いたhESCおよびNPCへのshRNAのレンチウイルス媒介送達

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