Name: ラット内側腓腹筋における神経筋接合部の形態学的特徴の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学ぶラット内側腓腹筋における神経筋接合部の形態学的特徴の可視化手法。蛍光免疫組織化学を用いて、前シナプス終末、後シナプス受容体、周シナプスシュワン細胞の空間的相関を評価する方法です。

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この研究は、CACMSイノベーションファンド(No.CI2021A03407)、中国国家自然科学財団(第82004299号)、中央福祉研究所の基礎研究費(第1号。ZZ13-YQ-068;ZZ14-YQ-032;ZZ14-YQ-034;ZZ201914001;ZZ202017006;ZZ202017015)。

本研究は、中国中国医学科学院鍼灸研究所倫理委員会により承認されました(承認番号2021-04-15-1)。すべての手順は、実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイド(National Academy Press、ワシントンD.C.、1996)に従って実施されました。3匹の成体雄ラット(Sprague-Dawley、体重230±15g)を使用した。ラットは、温度と湿度を制御し、食物と水に自由にアクセスできる12時間の明暗サイクルで飼育されました。この研究のための機器と材料を 図1に示します。
1. 灌流
<ol><li>250mg/kgのトリブロモエタノール溶液を腹腔内に注入し、ラットの安楽死を誘導する。</li>
	<li>呼吸が止まったら、胸腔を開き、はさみと鉗子を使って心臓にアクセスします。左心室から大動脈に向かって静脈内カテーテルを挿入し、右耳介を切断する。</li>
	<li>フード内の実験ラットを灌流する。右耳介から出る血液が透明になるまで100mLの0.9%正常生理食塩水で灌流することから始め、次に尾が曲がりにくくなるまで約10分間、0.1Mリン酸緩衝液(PB、pH7.4)中の4%パラホルムアルデヒド250〜300mLを灌流し続けます。</li>
</ol>2. 地域解剖学
<ol><li>灌流後、手術刃を用いて両側後肢の皮膚を除去し(図2A)、両側坐骨神経および内側腓腹筋(図2B)を露出させる。</li>
	<li>刃を用いて両側内側腓腹筋を後肢から注意深く解剖し(図2C)、筋肉全体を10mLの4%パラホルムアルデヒド中0.1M PBに2時間固定する。</li>
	<li>溶液から筋肉を取り出し、筋肉が溶液に完全に浸漬されるまで、0.1M PB中の25%スクロース10mL中の筋肉を4°Cで1日間凍結保護する。</li>
</ol>3.筋肉の凍結切除
<ol><li>筋肉組織が溶液に浸漬されたら、凍結切片培地を用いてスライドミクロトームシステムの凍結段階に固定する。筋肉を80μmの厚さで筋肉の長軸に沿って水平にスライスする。</li>
	<li>ブラシを使用して、10 mL の 0.1 M PB (pH 7.4) を含む 6 ウェルの培養プレートに、ウェルあたり 7 つのクライオ切片を整然と配置します。 注:セクションは、異なるウェル内のセクションが隣接するように順番に配置されているため、異なる汚れに使用されるセクションの一貫性が向上します。</li>
</ol>4. NF200、VAChT、α-BTX、およびPhaによる多重蛍光染色
注:NF200、VAChT、α-BTX、およびPhaによる複数の蛍光染色を適用して、それぞれ神経線維、シナプス前終末、シナプス後ニコチン性アセチルコリン受容体、および筋肉線維を明らかにした。
<ol><li>1ウェルあたり4つの切片を、75 μLの10%Triton X-100(0.5%)および45 μLの正常ロバ血清(3%)を含む0.1 M PBの1.5 mLを、20 rpmのオービタルシェーカー上で30分間インキュベートします。</li>
	<li>切片をウサギ抗NF200(1:1,000)、ヤギ抗VAChT(1:500)を0.1M PB(pH 7.4)に1%正常ロバ血清、および0.5%Triton X-100を含む一次抗体の混合溶液1.5mLに移し、4°Cで一晩インキュベートする。 翌日、切片を20rpmのオービタルシェーカー上で0.1M PB(pH 7.4)でそれぞれ5分間3倍洗浄する。</li>
	<li>ロバ抗ウサギAF488(1:500)およびロバ抗ヤギAF546(1:500)ならびにα-BTX、AF647(1:500)、およびファロイジン350(1:500)のバイオマーカーを含む二次抗体の混合溶液1.5mLに、1%の正常ロバ血清および0.5%Triton X-100を含む0.1M PB(pH 7.4)中の1.5mLの混合溶液中で切片を室温で1時間インキュベートする。光から守る。</li>
	<li>0.1 M PB(pH 7.4)でそれぞれ3倍5分間洗浄した後、切片を顕微鏡スライドにマウントします。観察のために蒸留水中の50%グリセリンを使用して切片にカバーガラスを塗布する。</li>
</ol>5. NF200、S100、α-BTX、およびDAPIによる多重蛍光染色
メモ: 手順は手順 4 の手順と似ています。主な違いは、一次抗体とそれに対応する二次抗体との間のものである。
<ol><li>以下の一次抗体を使用する:ステップ4.2のニワトリ抗NF200(1:6,000)、ウサギ抗S100(1:2,500)、およびそれらに対応する二次抗体:ロバ抗ニワトリAF488(1:500)およびロバ抗ウサギAF546(1:500)、ならびにステップ4.3のα-BTX AF647(1:500)およびDAPI(1:50000)のバイオマーカー。</li>
</ol>6. 観察と分析
<ol><li>試料を観察し、対物レンズ(NA0.75の20倍レンズ、NA0.95の40倍レンズ)を備えた共焦点イメージングシステムを用いて画像を撮影する。</li>
	<li>多重蛍光染色に対応する励起および発光波長は、350 nm(Pha)、488 nm(NF200)、546 nm(VAChTおよびS100)、647 nm(α-BTX)、またはDAPIを使用します。画像キャプチャの解像度を 640 x 640 ピクセルに設定します。 注: 640 x 640 ピクセルの解像度が選択されるのは、画像が Z スタックでキャプチャされたためです。1024 x 1024ピクセルの解像度では、Zスタックのイメージングとフォトブリーチングが遅くなります。</li>
	<li>開始焦点面と終了焦点面を設定します。ステップサイズを 1 μm または 2 μm に設定します。深度パターン、画像キャプチャ、および Z シリーズを選択します。</li>
	<li>20倍で撮影した低倍率の画像については、105μmのピンホールを使用して、厚さ80μmの各断面から2μmのステップサイズで40枚の画像(Zスタック)をキャプチャします。Z軸上の投影/地形モードと強度投影を選択して、すべての画像を単一の焦点に統合します。</li>
	<li>40倍で撮影した高倍率の画像の場合は、ズームを2に設定し、ピンホールを105μmに設定して、厚さ80μmの各断面から1μmステップサイズで80枚の画像(Zスタック)をキャプチャします。すべての画像を1つのピントに統合します。</li>
	<li>27で先に説明したような画像処理システムを用いて3次元パターンの画像を再構成する。</li>
</ol>

<ol><li>Kawabuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatiotemporal+relationship+among+Schwann+cells%2C+axons+and+postsynaptic+acetylcholine+receptor+regions+during+muscle+reinnervation+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22TheAnatomical+Record%22%5BJournal%5D)">The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats.</a> TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).</li>
<li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurologic+Clinics%22%5BJournal%5D)">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li>
<li>Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+extracellular+complexity+of+neuromuscular+junction+organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156(2020).</li>
<li>Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuromuscular+junction+in+health+and+disease%3A+molecular+mechanisms+governing+synaptic+formation+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964(2020).</li>
<li>Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+structural+distribution+of+acetylcholine+receptors+at+developing+mouse+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscienc+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions.</a> The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).</li>
<li>Desaki, J., Uehara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+maturation+of+subneural+apparatuses+at+neuromuscular+junctions+in+postnatal+rats%3A+a+scanning+and+transmission+electron+microscopical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study.</a> Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).</li>
<li>Marques, M., Santo Neto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuromuscular+junctions+by+confocal+fluorescence+microscopy%3A+individual+endplates+seen+in+whole+muscles+with+vital+intracellular+staining+of+the+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals.</a> Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).</li>
<li>Magill, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury%3A+a+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+distribution+of+motor+endplates+and+its+adaptive+change+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle.</a> Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Chen, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+injection+of+-bungarotoxin+to+improve+the+efficiency+of+motor+endplate+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling.</a> Brain and Behavior. 6 (6), 00468(2016).</li>
<li>Sugiura, Y., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-glia+interactions%3A+the+roles+of+Schwann+cells+in+neuromuscular+synapse+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function.</a> Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).</li>
<li>Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perisynaptic+schwann+cells+-+The+multitasking+cells+at+the+developing+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Perisynaptic schwann cells - The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).</li>
<li>Walker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+perisynaptic+Schwann+cell+and+neuromuscular+junction+research%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research.</a> Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).</li>
<li>Michaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+defects+and+breathing+disorders+in+a+new+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+endoplasmic+reticulum+stress+in+soleus+and+gastrocnemius+muscles+and+differential+response+to+UPR+pathway+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats.</a> Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).</li>
<li>Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+the+rat+medial+gastrocnemius+muscle+based+on+inputs+to+motoneurons+and+on+an+algorithm+for+prediction+of+the+motor+unit+force%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).</li>
<li>Marinello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neuromuscular+junctions+in+mice+by+combined+confocal+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032(2021).</li>
<li>Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+multiple+aspects+of+neurofilament+functions%2C+and+their+possible+contribution+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration.</a> Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).</li>
<li>Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilaments+and+neurofilament+proteins+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309(2017).</li>
<li>Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinesterases+in+tripartite+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220(2021).</li>
<li>Karlin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).</li>
<li>Rudolf, R., Straka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+acetylcholine+receptor+at+vertebrate+motor+endplates%3A+Endocytosis%2C+recycling%2C+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation.</a> Neuroscience Letters. 711, 134434(2019).</li>
<li>Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+in+neuromuscular+junction+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).</li>
<li>Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+guidance+of+nerve+growth+between+synaptic+sites+explains+changes+in+the+pattern+of+muscle+innervation+and+remodeling+of+synaptic+sites+following+peripheral+nerve+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries.</a> Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Histology%22%5BJournal%5D)">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li>
<li>Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).</li>
<li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li>
</ol>

著者は利益相反がないと宣言しています。

我々は、筋肉スライスの多重染色を成功させるために必要な技術的詳細と、ラット内側腓腹筋の厚い部分におけるNMJの形態学的特徴を明らかにするための蛍光免疫組織化学の使用について説明した。このアプローチを用いることにより、PSCおよびシナプス前後部要素の微細な詳細および空間的相関を共焦点顕微鏡下で分析および評価し、さらに3次元パターンで再構成することができる。ここでは、NMJの形態学的特徴を明らかにするために様々な種類のバイオマーカーを用い、その中で、NF200は有髄軸索20,21上に高発現し、VAChTはシナプス前末端22に蓄積され、α-BTXはシナプス後部AchRs23,24に、S100はPSCs25,26に示されている。.我々の結果と以前の研...

神経筋接合部(NMJ)1,2,3,4の3つの必須構造成分として、シナプス前運動軸索末端の形態学的側面、ニコチン性アセチルコリン受容体(AchRs)、およびシナプス周囲シュワン細胞(PSC)を含むシナプス後膜が広範囲に研究されている。骨格筋の薄切片および全マウント標本は、電子顕微鏡5,6、共焦点顕微鏡7,8、および光シート顕微鏡9,10などの異なる組織学的技術を用いて検査されてきた。NMJの形態学的特徴は、異なる側面からこれらの技術によって実証されているが、比較として、共焦点顕微鏡はNMJの詳細な形態のイメージングのための理想的な選択肢である。
近年、NMJの構造成分を示すための多くの新しい技術が開発されている。例えば、thy1−YFPトランスジェニック蛍光マウスは、インビボおよびインビトロで運動軸索および運動エンドプレートを観察するために直接使用されている10、11。さらに、蛍光α-BTXの静脈内注射は、光シート顕微鏡による検査に組織光学クリアリング処理を使用することにより、野生型およびトランスジェニック蛍光マウスの全マウント骨格筋におけるモーターエンドプレートの空間分布を明らかにするために適用されている9,12。しかし、これらの高度な方法で見ることができるシナプス前部とシナプス後部の要素に加えて、PSCを同時に実証することはできません。
蓄積された証拠は、末梢グリア細胞としてのPSCが、NMJの発達および安定性、生理学的条件下でのNMJのシナプス活性の調節、および神経損傷後のNMJの再生に寄与するシナプス前末端と密接に関連していることを示している13、14、15.NMJの細胞構造を考慮すると、このプロトコルは、シナプス前部およびシナプス後部の要素であるPSCを同時に標識するための適切な候補であり、正常および病理学的条件下でのNMJの完全性および可塑性を評価するために潜在的に使用される。例えば、NMJの強度、シナプス後運動エンドプレートの形態および体積、NMJの神経支配および脱神経、ならびに生理学的および病理学的状態の筋肉におけるPSCの数を比較する。
腓腹筋はふくらはぎの膨らみを形成する最大の筋肉で、手足から皮膚や大腿二頭筋を取り除くことで簡単に解剖されます。筋肉は、しばしば、筋萎縮、神経筋変性、筋肉性能、および運動単位力をエキソビボまたはインビボで評価するために選択される16、17、18。しかし、この技術は、様々な骨格筋からNMJの形態学的特徴を明らかにするのにも適している。同時に、太い筋肉切片は、細い切片7、8およびからかわれた筋線維19と比較して、NMJのより完全な形態および量を明らかにすることができる。
これらの研究に沿って、ラット内側腓腹筋を本研究の標的組織として選択し、NMJの構造成分に従って様々な種類のバイオマーカーによる多重蛍光染色のために厚さ80μmでスライスした。ここで、ニューロフィラメント200(NF200)20、21、小胞性アセチルコリントランスポーター(VAChT)22、α−バンガロトキシン(α−BTX)23、24、およびS100 25,26を用いて、神経線維、シナプス前終末、シナプス後部AchRs、およびPSCをそれぞれ標識した。さらに、筋肉組織および細胞核の背景を、ファロイジンおよびDAPIでさらに対比染色した。
本研究では、NMJの細胞構造とそれに対応するバイオマーカーを、より厚い固定標本上で同時に染色するための洗練されたプロトコールを開発することが期待されており、これは共焦点顕微鏡での使用がより便利であり、PSCの詳細な構造、シナプス前部およびシナプス後部の要素、ならびにそれらの相互の空間的相関に関するより多くの情報を得るのに役立つ。方法論の観点から、このプロトコールは、正常および病理学的条件下でのNMJの形態学的特徴を評価するのに有益であり得る。

<table><tbody><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩</td><td>サーモフィッシャー</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>ロバ反チキン AF488</td><td>ジャクソン</td><td>149973 (703-545-155)</td><td></td></tr><tr><td>ロバ反ヤギ AF546</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A11056</td><td></td></tr><tr><td>ロバ反ウサギ AF488</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>ロバ反ウサギ AF546</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A10040</td><td></td></tr><tr><td>凍結切片 中</td><td>サーモフィッシャー</td><td>Neg-50</td><td>無色</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス</td><td>シトテスト</td><td>10212450C</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトー</td><td>ム ヤマト</td><td>REM-710</td><td></td></tr><tr><td>ニューロフィラメント 200</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>N4142</td><td>ウサギ</td></tr><tr><td>ニューロフィラメント 200</td><td>Abcam</td><td>ab4680</td><td>チキン</td></tr><tr><td>ノーマル ロバ 血清</td><td>ジャクソン イムノリサーチ ラボラトリーズ</td><td>017-000-12</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>山東 Hualu 製薬 Co.Ltd</td><td>H37022750</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>マックリン</td><td>P804536</td><td>500g</td></tr><tr><td>ファロイジン AF350</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A22281</td><td></td></tr><tr><td>精密蠕動ポンプ</td><td>Longer</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>S100-&beta;</td><td>Abcam</td><td>ab52642</td><td></td></tr>ウサギリン酸<tr><td>ナトリウムd塩基性十二水和物</td><td>マックリン</td><td>S818118</td><td>500g</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性二水和物</td>マッ<td>クリン</td><td>S817463</td><td>500g</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>マックリン</td><td>S818046</td><td>500g</td></tr><tr><td>スーパーフロストプラス顕微鏡スライド</td><td>サーモフィッシャー4951PLUS-001E</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>ソーラーバイオ生命科学</td><td>9002-93-1</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>小胞性アセチルコリン トランスポーター</td><td>Milipore</td><td>ANB100</td><td>ヤギ</td></tr><tr><td>&-ブンガロトキシン AF647 抱合型</td><td>ThermoFisher</td><td>B35450</td><td></td></tr></tbody></table>

ラット内側腓腹筋における神経筋接合部の形態学的特徴の可視化

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

神経筋接合部(NMJ)は、運動ニューロンから骨格筋への信号伝達に役立つ複雑な構造であり、シナプス前運動軸索末端、シナプス後ニコチン性アセチルコリン受容体(AchRs)、およびシナプス周囲シュワン細胞(PSC)の3つの重要な組織学的構成要素からなる。NMJの形態学的特徴を実証するために、ラット内側腓腹筋を標的組織として選択し、運動神経線維およびそのシナプス前末端のためのニューロフィラメント200(NF200)および小胞アセチルコリントランスポーター(VAChT)、シナプス後ニコチン性AchRsのためのα−バンガロトキシン(α−BTX)を含む様々な種類のバイオマーカーによる多重蛍光染色を用いて調べ、 PSC の場合は S100 です。本試験では、第1群ではNF200、VAChT、およびα-BTXで染色し、第2群ではNF200、α-BTX、S100で染色した。両方のプロトコルがNMJの詳細な構造を効果的に実証できることが示された。共焦点顕微鏡を用いて、シナプス前末端、シナプス後受容体、PSCの形態学的特徴が見られ、それらのZスタック画像を3次元パターンで再構成し、異なる標識間の空間的相関をさらに解析した。方法論の観点から、これらのプロトコールは、生理学的条件下でのNMJの形態学的特徴を調査するための貴重な基準を提供し、末梢神経損傷および再生などのNMJの病理学的変化を評価するのにも適している可能性がある。

複数回の蛍光染色後、NF200陽性神経線維、VAChT陽性シナプス前終末、α-BTX陽性シナプス後部AchR、S100陽性PSC、ファロイディン陽性筋線維、およびDAPI標識細胞核を有するラット内側腓腹筋の厚さ80μm切片について、対応する標識が規則正しく実証された(図3 および 図4)。
NF200陽性神経線維が束ねて走り、VAChT陽性シナプス前終末に枝分かれし、α-BTX陽性シナプス後部AchRと鏡のような関係を形成していることが示された(図3)。さらに、シナプス前終末に近いNF200陽性神経線維の周囲にS100陽性PSCが検出された(図4)。
画像再構成を利用することで、神経線維、シナプス前終末、PSC、シナプス後部AchRsの空間的相関が、異なる視点からのNMJの詳細な形態学的特徴...

このプロトコールは、異なるバイオマーカー、すなわち、ニューロフィラメント200、小胞アセチルコリントランスポーター、α-バンガロトキシン、およびS100を有する蛍光免疫組織化学を用いて、ラット内側腓腹筋におけるシナプス前末端、シナプス後部受容体、およびシナプス周囲シュワン細胞間の空間的相関を調べる方法を示す。

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...

このプロトコルは、正常および病理学的条件下での神経筋接合部の完全性および可塑性を評価するために使用することができる。この技術は、単一の筋肉切片上のシュワン細胞および前後の実験動物を同時に標識することである。成体雄ラットを安楽死させた後、ラットをフードに入れ、胸腔を開き、はさみおよび鉗子を使用して心臓にアクセスする。左心室から大動脈に向かって静脈内カテーテルを挿入し、右オラクルを切断する。次に、右オラクルから出る血液が透明になるまで、100ミリリットルの0.9%の通常の生理食塩水で灌流を開始します。次いで、0.1モルリン酸緩衝液またはPB pH 7.4中の250〜300ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドを10分間灌流し続ける。灌流後、手術刃を用いて両側後肢の皮膚を除去し、両側坐骨神経と内側腓腹筋を露出させる。刃を用いて両側内側腓腹筋を後肢から注意深く解剖し、筋肉全体を10ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドで後置する。2時間後、溶液から筋肉を取り出し、摂氏4度で1日間、0.1モルPB中の25%スクロースを10ミリリットルで凍結保護する。筋肉組織がスクロース溶液に浸漬されたら、凍結切片培地を用いてスライドミクロトームシステムの凍結段階で固定する。筋肉の長軸に沿って80ミクロンの厚さで筋肉を水平にスライスします。ブラシを使用して、10ミリリットルの0.1モルPBを有する6ウェル培養プレートに、ウェル当たり7つのクライオ切片を整然と配置する。蛍光染色のために、1ウェルあたり4つの切片を、75マイクロリットルの10%Triton X 100および45マイクロリットルの正常なロバ血清を含む1.5ミリリットルの0.1モルPBと共に、20rpmのオービタルシェーカー上でインキュベートする。30分後、切片をウサギ抗神経フィラメント200、ヤギ抗小胞性アセチルコリントランスポーターを0.1モルPB中、1%正常ロバ血清中、および0.5%Triton X 100中の一次抗体の混合溶液の1.5ミリリットルに移し、摂氏4度で一晩インキュベートする。翌日、切片を20rpmのオービタルシェーカー中で0.1モルPB上でそれぞれ5分間3回洗浄する。最後の洗浄後、ロバ抗ウサギAF 488およびロバ抗ヤギAF 546、ならびにアルファバンガロ毒素のバイオマーカーを含む2次抗体の混合溶液中で切片を1%正常ロバ血清および0.5トリトンx 100を含む0.1M PB中に含有するAF 647およびファロイジン350の混合溶液中で1時間インキュベートし、 彼らを光から守る。インキュベーション後、切片をPBで洗浄し、顕微鏡スライドにマウントします。蒸留水中に50%グリセリンを使用してカバーガラスをセクションに塗布します。開口数0.75の20倍の主観レンズと0.95の開口数40倍のレンズを備えたコンフォーカルイメージングシステムを用いて標本を観察し、画像化する。多重蛍光イメージングの場合、テキスト原稿に記載されているように、各バイオマーカーの励起波長と発光波長を設定します。画像キャプチャの解像度を 640 x 640 ピクセルに設定します。次に、開始焦点面と終了焦点面を設定します。ステップサイズを1ミクロンまたは2ミクロンに設定します。次に、深度パターン、画像キャプチャ、および Z シリーズを選択します。20 X の低倍率の画像の場合は、105 ミクロンのピンホールを使用して、2 ミクロンのステップ サイズで 40 Z のスタック画像をキャプチャします。投影またはトポグラフィモードとZ軸上の強度投影を選択して、すべての画像を1つのフォーカスに統合します。40 X の高倍率画像の場合は、ズームを 2 に設定し、105 ミクロンのピンホールで 80 Z スタック画像を 1 ミクロン ステップ サイズでキャプチャします。すべての画像を1つのフォーカスに統合します。画像処理システムで3次元パターンの画像を再構成する。内側腓腹筋と神経フィラメント200陽性神経線維、小胞性アセチルコリントランスポーター陽性シナプス前末端、αバンガロ毒素陽性シナプス後アセチルコリン受容体、S100陽性シナプス周囲シュワン細胞、ファロイジン陽性筋線維、およびDAPI標識細胞核との代表的な空間相関がここで実証される。ニューロフィラメント200の陽性神経線維が束ねて走った。これらの神経線維は、小胞性アセチルコリントランスポーター陽性シナプス前末端に分岐を与え、これはアルファバンガロ毒素陽性シナプス後アセチルコリン受容体との鏡面関係を形成した。さらに、S100陽性シナプス周囲シュワン細胞を、シナプス前終末に近い200個の陽性神経線維のニューロフィラメントの周囲に検出した。空間的相関は、異なる観点から神経筋接合部の詳細な形態学的特徴を示す3次元パターンでさらに示された。筋肉切片でより多くのイメージングを観察するためには、筋肉を80ミクロンの厚さで長軸に沿って水平にスライスすることが重要です。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)からインビトロNJを生成するプロトコルを提供します。この方法は、成熟した形態と機能を有するMJを1ヶ月で単一のウェルで誘導することができる。結果として生じるNmJは、関連する疾患のモデル化、病理学的メカニズムの研究、または治療のための薬物化合物のスクリーニングに使用される可能性がある。...

ヒト人工多能性幹細胞から誘導されるインビトロ神経筋接合

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共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部のキャラクタリゼーション

ここでは、神経筋接合部と筋細胞の微小管ネットワークを可視化するための詳細なプロトコルを紹介します。ショウ...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

学ぶラット内側腓腹筋における神経筋接合部の形態学的特徴の可視化手法。蛍光免疫組織化学を用いて、前シナプス終末、後シナプス受容体、周シナプスシュワン細胞の空間的相関を評価する方法です。

ラット内側腓腹筋における神経筋接合部の形態学的特徴の可視化

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