細胞内小胞破裂の機能を調べるための光力学的アプローチ
2023年3月17日
AlPcS2aを介した発色団支援レーザー不活性化(CALI)は、生細胞の細胞内小胞(IV)の時空間的損傷を研究するための強力なツールです。
小胞の細胞形成へのエンドサイトーシスは、細胞内小胞の形成をもたらす。小胞の透過処理は様々なシグナル経路を活性化する。発色団支援レーザー不活性化は、細胞内小胞破裂の結果を研究するために使用されます。
細胞内小胞に対する細胞内損傷の空間的および時間的制御は、静置状態および光照明を調整することによって達成することができる。まず、HeLa細胞培養を10%FBSを添加したDMEMで維持します。細胞をPBSで洗浄した後、細胞をトリプシン処理します。
次に、10%FBSを添加したDMEMで細胞を再懸濁します。300ナノグラムのGal3-GFPプラスミドを25マイクロリットルの還元血清培地で希釈する。次に、0.6マイクロリットルのP3000試薬を追加します。
そして穏やかに混合し、続いて溶液をボルテックスする。0.45マイクロリットルのリポフェクタミン3000試薬を25マイクロリットルの還元血清培地で希釈し、穏やかに混合します。室温で5分間インキュベートします。
次に、希釈したDNAと希釈したリポフェクタミン3000を混合し、室温で10分間インキュベートします。DNAリポフェクタミン混合物を混合した後、300, 000個のHeLa細胞と200マイクロリットルのDMEMを10%FBSと混合し、35ミリメートルのガラスボタン皿の中央ガラス領域に細胞を播種します。細胞を付着させるには、5%二酸化炭素を供給されたインキュベーター内で摂氏37度で細胞を少なくとも4時間インキュベートします。
10%FBSを添加したDMEMでAlPcS2aを希釈して、1マイクロモルのAlPcS2a溶液を作製します。AlPcS2a含有培地を摂氏37度のウォーターバスで予熱し、培養培地をAlPcS2a含有培地と交換します。5%二酸化炭素を供給したインキュベーター内で摂氏37度で細胞を一晩インキュベートします。
翌日、細胞をPBSで2回洗浄し、培地を新鮮な培地に交換した後、細胞外AlPcS2aを除去した。摂氏37度で4時間インキュベートし、エンドサイトーシス経路に沿った残留色素がリソソームに蓄積できるようにします。リソソームを損傷して単一細胞を操作するには、共焦点顕微鏡のステージに培養皿を置きます。
GFPとAlPcS2aを励起するには、それぞれ488ナノメートルと561ナノメートルのレーザーを使用します。損傷するように選択されたAlPcS2a標識小胞上の5×5マイクロメートル四方の関心領域を丸で囲みます。次に、0.21ミリワットの633ナノメートルレーザー、つまり70回の繰り返しで関心領域をパルス照明します。
リソソーム膜透過処理の指標としてGal3プンクタの形成を監視する。HeLa細胞におけるAlPcS2aによるリソソーム染色は市販のマーカーを用いて行い、緑色蛍光色素で陽性染色した。TagRFP-ガレクチン3発現HeLa細胞中のリソソームをAlPcS2aで染色した。
近赤外光で照明を集束させた後、結果は、AlPcS2aベースの発色団支援レーザー不活性化が、関心のある領域内の局所的なリソソーム破裂を制御し、残りのリソソームを無傷のままにすることができることを示しています。インキュベーション時間が立っているエンドソームまたはリソソームを決定するため、このステップは重要です。例えば、人々は膜不透過性色素の放出によってサイズを決定することができる。
また、FITCデキストランなどのpH感受性色素を使用して、エンドソームとリソソームを区別することもできます。この技術は、細胞内小胞膜破裂の下流効果を開始するのに有用である。そして、さまざまな状況下で下流の影響があります。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
AlPcS 2aを用いたクロモフォア支援レーザー不活性化（CALI）は、生細胞内における細胞内小胞の時空間的な損傷を調査するために利用されます。この手法により、細胞内での損傷を精密に制御することが可能となり、小胞の破裂に伴う影響についての知見を得ることができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 神経科学
- ライブセルイメージング
背景
- エンドサイトーシスにより、細胞内小胞が形成されます。
- 小胞の透過処理により、さまざまなシグナル伝達経路が活性化されます。
- CALIは、小胞の破裂による影響を研究するための手法です。
- 光照射によって、空間的および時間的な制御が行われます。
研究目的
- 細胞内小胞損傷のダイナミクスを探索すること。
- 小胞の破裂によって活性化されるシグナル伝達経路を理解すること。
- 生細胞相互作用を研究するための手法を洗練させること。
使用した手法
- 10% FBSを含むDMEMでのHeLa細胞の培養。
- 実験前のPBSによる細胞の洗浄。
- 解析のための細胞のトリプシン処理。
- 局所的損傷を誘発するためのCALIの適用。
主要な結果
- 小胞損傷の有効な制御を実証した。
- 破裂後に活性化される主要なシグナル伝達経路を特定した。
- 生細胞研究におけるCALIの使用を検証した。
- 小胞機能のメカニズムに関する知見を提供した。
結論
- CALIは細胞内ダイナミクスを研究するための有用なツールです。
- これらの知見は、小胞関連シグナリングの理解を深めるものです。
- 今後の研究では、これらの手法に基づき、より深い洞察を得ることが期待されます。
よくある質問
業界における重要性
発色団アシストレーザー不活性化（CALI）は、細胞内小胞の破裂を時空間的に精密に誘導することを可能にし、膜透過イベントを調査するための制御されたシステムを提供します。このアプローチは、生細胞におけるエンドソームおよびリソソームの完全性を選択的に操作し、モニタリングすることを可能にすることで、メカニズムの低リスク化とターゲットバリデーションを支援します。本手法は、小胞の破裂を下流のシグナル伝達および分子動員に結びつけることにより、初期探索における予測の信頼性を向上させます。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 小胞膜の完全性およびシグナリング経路におけるその役割を直接的に解析することが可能です。
- 小胞の破裂に伴うgalectin-3などの糖鎖結合タンパク質の動員に関する機能的検証をサポートします。
- 標的オルガネラの透過化による影響を単離することで、メカニズム面でのリスク低減を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 小胞の破裂および分子の集積をモニタリングするための、定量的なイメージングベースのアッセイを開発するためのプラットフォームを提供します。
- 制御された局所的な膜透過化の誘導により、アッセイの標準化をサポートします。
- エンドソームおよびリソソームの安定性に対する化合物の影響を、再現性高く評価することが可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 小胞の完全性が細胞シグナル伝達や病理に影響を与えるという、疾患に関連したモデルと一致しています。
- 小胞破裂による下流への影響研究を可能にすることで、発見から前臨床検証までの連続性をサポートします。
- 細胞応答に関するメカニズム的な知見を提供することで、リスクを調整した上での推進決定を促進します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この光力学的なアプローチは、小胞破裂イベントの仮説駆動型の操作および読み出しを可能にすることで、ディスカバリーから前臨床までの連続的なプロセスへと統合されます。
- 探索生物学：小胞の透過性がシグナリングおよびタンパク質のリクルートに果たす役割に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：アッセイ開発および化合物評価のための、定量的で再現性の高いイメージング出力を提供します。
- 分析：比較分析のために、galectin-3 punctaの形成や色素の放出などの測定可能なエンドポイントを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：メカニズム的な知見を、小胞の破裂が関与する疾患関連の細胞モデルへと結びつけます。
- 企業の再利用：多様な細胞種および条件下で膜ダイナミクスを研究するための、再利用可能なモジュール式プラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：小胞関連シグナル伝達研究における予測の信頼性を高め、メカニズムの曖昧さを低減します。
- 運用的価値：小胞破裂の誘導および測定を標準化し、再現性のある結果を実現します。
- 戦略的価値：膜透過性の機能的な影響を明確にすることで、go/no-go判断に有用な情報を提供します。
- ポートフォリオへの影響：小胞の完全性に影響されるターゲットおよびパスウェイの、リスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 生細胞イメージングおよび光力学的な操作に関する専門知識が必要です。
- 共焦点顕微鏡およびレーザー照射インフラへのアクセスが必要です。
- イメージングおよび解析プロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- 適切なコントロールを用いることで、様々な細胞株やオルガネラマーカーに適応可能です。
- 再現性を確保するため、レーザーパラメータと色素濃度の精密なキャリブレーションに依存します。
