Name: 細胞内小胞破裂の機能を調べるための光力学的アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: 学ぶCALIを用いた細胞内小胞破裂の光力学的制御法。HeLa細胞でリソソーム膜透過化を誘導し、シグナル伝達経路の動態を解析する技術です。生細胞イメージングで局所的なダメージ制御を実現します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、研究支援を提供してくれた中央研究院炎症コア施設、IBMSに感謝したいと思います。コア施設は、中央研究院コア施設および革新的機器プロジェクト(AS-CFII-111-213)によって資金提供されています。著者らは、画像取得を支援してくれた中央研究院(AS)の生物医科学研究所(IBMS)の共通機器コア施設に感謝しています。

1. AlPcS2a ストック調製
<ol><li>10 mgのAlPcS2a を400 μLの0.1 M NaOHに溶解します。溶解性を向上させるには、溶液を50°Cで加熱し、渦巻きます。</li>
	<li>溶液を4 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と混合します。次に、溶液を0.22 μmフィルターでろ過し、不溶性沈殿物を除去します。</li>
	<li>UV-Vis分光光度計で溶液の濃度を測定します。672 nmにおけるAlPcS2aの吸光係数は4 x 104 cm-1 M-1である。AlPcS2a溶液をPBSで希釈して、1 mM溶液を作ります。1 mLのアリコートを作り、-20°Cで保存します。</li>
</ol>2. トランスフェクション
注:Gal3-GFPは、リソソーム破裂の生細胞イメージングの指標として適用されます。
<ol><li> </li><li><li><li></li></ol><ol><li></li><li></li><li></li><li> </li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig02large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><ol><li><li></li><li></ol></li><li><ol><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li></ol></li></ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig03large.jpg" target="_blank"></a>

<ol><li>Cossart, P., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+viruses+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of viruses and bacteria.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (8), 016972(2014).</li>
<li>Daussy, C. F., Wodrich, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BRepair+me+if+you+can%26%2334%3B%3A+membrane+damage%2C+response%2C+and+control+from+the+viral+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">34;Repair me if you can&#34;: membrane damage, response, and control from the viral perspective.</a> Cells. 9 (9), 2042(2020).</li>
<li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111(2013).</li>
<li>Sharma, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+for+cancer+and+for+infections%3A+what+is+the+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Israel+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy for cancer and for infections: what is the difference.</a> Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 691-705 (2012).</li>
<li>Kübler, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Laser+Application%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy.</a> Medical Laser Application. 20 (1), 37-45 (2005).</li>
<li>De Rosa, F. S., Bentley, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+skin+cancers%3A+sensitizers%2C+clinical+studies+and+future+directives%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of skin cancers: sensitizers, clinical studies and future directives.</a> Pharmaceutical Research. 17 (12), 1447-1455 (2000).</li>
<li>Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+photosensitizers+for+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">New photosensitizers for photodynamic therapy.</a> Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).</li>
<li>Lavie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photodynamic+pathway+to+apoptosis+and+necrosis+induced+by+dimethyl+tetrahydroxyhelianthrone+and+hypericin+in+leukaemic+cells%3A+possible+relevance+to+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A photodynamic pathway to apoptosis and necrosis induced by dimethyl tetrahydroxyhelianthrone and hypericin in leukaemic cells: possible relevance to photodynamic therapy.</a> British Journal of Cancer. 79 (3-4), 423-432 (1999).</li>
<li>Jay, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+destruction+of+protein+function+by+chromophore-assisted+laser+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (15), 5454-5458 (1988).</li>
<li>Grate, D., Wilson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated%2C+site-specific+inactivation+of+RNA+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated, site-specific inactivation of RNA transcripts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (11), 6131-6136 (1999).</li>
<li>Lin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+inhibition+of+synaptic+release+with+chromophore-assisted+light+inactivation+%28CALI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI).</a> Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).</li>
<li>Hsieh, C. W., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+mitophagy+with+photosensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Triggering mitophagy with photosensitizers.</a> Methods in Molecular Biology. 1880, 611-619 (2019).</li>
<li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+initiation+of+Parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled initiation of Parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li>
<li>Molinari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuoles+induced+by+Helicobacter+pylori+toxin+contain+both+late+endosomal+and+lysosomal+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vacuoles induced by Helicobacter pylori toxin contain both late endosomal and lysosomal markers.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (40), 25339-25344 (1997).</li>
<li>Prince, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+a+lysosomal+pathway+regulating+neutrophil+apoptosis+by+a+major+bacterial+toxin%2C+pyocyanin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Subversion of a lysosomal pathway regulating neutrophil apoptosis by a major bacterial toxin, pyocyanin.</a> Journal of Immunology. 180 (5), 3502-3511 (2008).</li>
<li>Aits, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+lysosomal+membrane+permeabilization+by+lysosomal+galectin+puncta+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay.</a> Autophagy. 11 (8), 1408-1424 (2015).</li>
<li>Prasmickaite, L., Hogset, A., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+photosensitizers+for+use+in+photochemical+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different photosensitizers for use in photochemical gene transfection.</a> Photochemistry and Photobiology. 73 (4), 388-395 (2001).</li>
<li>Berg, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+internalization%3A+a+novel+technology+for+delivery+of+macromolecules+into+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Photochemical internalization: a novel technology for delivery of macromolecules into cytosol.</a> Cancer Research. 59 (6), 1180-1183 (1999).</li>
<li>Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photodegradation+of+porphyrins+in+cells+can+be+used+to+estimate+the+lifetime+of+singlet+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen.</a> Photochemistry and Photobiology. 53 (4), 549-553 (1991).</li>
<li>Thurston, T. L., Wandel, M. P., von Muhlinen, N., Foeglein, A., Randow, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin+8+targets+damaged+vesicles+for+autophagy+to+defend+cells+against+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Galectin 8 targets damaged vesicles for autophagy to defend cells against bacterial invasion.</a> Nature. 482 (7385), 414-418 (2012).</li>
<li>Repnik, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-leucyl-L-leucine+methyl+ester+does+not+release+cysteine+cathepsins+to+the+cytosol+but+inactivates+them+in+transiently+permeabilized+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">L-leucyl-L-leucine methyl ester does not release cysteine cathepsins to the cytosol but inactivates them in transiently permeabilized lysosomes.</a> Journal of Cell Science. 130 (18), 3124-3140 (2017).</li>
<li>Griffiths, G., Hoflack, B., Simons, K., Mellman, I., Kornfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mannose+6-phosphate+receptor+and+the+biogenesis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mannose 6-phosphate receptor and the biogenesis of lysosomes.</a> Cell. 52 (3), 329-341 (1988).</li>
<li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+Coordinates+a+cellular+system+for+lysosomal+repair+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 Coordinates a cellular system for lysosomal repair and removal.</a> Developmental Cell. 52 (1), 69-87 (2020).</li>
<li>Chu, Y. P., Hung, Y. H., Chang, H. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+to+monitor+lysophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Assays to monitor lysophagy.</a> Methods in Enzymology. 588, 231-244 (2017).</li>
<li>Nguyen, L., Madsen, S. J., Berg, K., Hirschberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+in+vitro+photochemical+internalization+protocol+for+3D+spheroid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">An improved in vitro photochemical internalization protocol for 3D spheroid cultures.</a> Lasers in Medical Science. 36 (8), 1567-1571 (2021).</li>
<li>Daugelaviciene, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-targeted+photodynamic+treatment+induces+primary+keratinocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology.+B%2C+Biology%22%5BJournal%5D)">Lysosome-targeted photodynamic treatment induces primary keratinocyte differentiation.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. 218, 112183(2021).</li>
<li>Hong, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+galectins+control+cellular+responses+commensurate+with+cell+surface+carbohydrate+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Intracellular galectins control cellular responses commensurate with cell surface carbohydrate composition.</a> Glycobiology. 30 (1), 49-57 (2019).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

AlPcS2aは原形質膜に結合し、次いでエンドサイトーシスによって内在化され、最終的にリソソームに蓄積する。AlPcS2aは、したがって、インキュベーション期間を調整することによって細胞内区画に局在化することができる。この方法論の限界は、ERやゴルジ装置など、IVの膜源が他にもたくさんあるため、エンドサイトーシスを介してAlPcS2aによって標識できるのはIVの亜集団のみであることです。さらに、初期または後期エンドソームへのAlPcS2aの選択的標識は困難ですが、蛍光マーカーを使用して、細胞内イメージング中に初期形成エンドソームと後期形成エンドソームを区別することができます。CALI誘発IV損傷は、種々の色素3、24を用いて誘発され得る。
損傷の強さは、光のパワーと照明時間によって制御できます。損傷の強度が高いと、細胞の収縮または壊死を引き起こす可能性があります。ここでは、IV損...

細胞内小胞(IV)の一種であるエンドソームは、エンドサイトーシスによって形成され、その後リソソームに成熟します。さまざまな細胞内シグナル経路がIVの形成に関与しています。さらに、異なる内因性および外因性刺激がIVを損傷する可能性があります(たとえば、病原体は感染中に境界膜から逃げ出し、細胞質1に入る可能性があります)。これは通常、エンドサイトーシス小胞2の破裂を伴う。したがって、IVを標的にして損傷を与えるための技術は、関連する研究3で使用できます。
光線力学療法(PDT)は、腫瘍や病原体を殺すことによって病気と戦うための光依存療法です4。PDTでは、標的細胞は、光増感剤と呼ばれる非毒性発色団で標識され、光照射によって局所的に活性化され得る5,6。光増感剤は光からエネルギーを吸収して励起一重項状態に変化し、長寿命の励起三重項状態になります。三重項状態の光増感剤は、電子またはエネルギー移動を受け、酸素の存在下で活性酸素種(ROS)を形成することができ、照明領域7内の標識細胞を空間的に破壊することができる。結果は光の力によって異なります8.光増感剤の濃度と光照射の強度を制御することにより、発色団支援光不活性化(CALI)9と呼ばれる、細胞溶解なしで標的生体分子を選択的に不活性化することができます。さまざまな細胞内標的を選択的に標識できる光増感剤の大幅な開発により、CALIは、ヌクレオチドやタンパク質などの低分子生体分子、およびミトコンドリアやエンドリソソームなどの細胞小器官の生体分子の光を介した不活性化を制御するための貴重なツールになりました3,10,11,12,13。
CALIと比較して、細菌毒素14,15やリソソーム損傷に対するLeu-Leu-OMe16治療などの膜を損なうために化学的または物理的方法も使用されます。ただし、これらの方法では、細胞内のIVの大量の障害が表示されます。堅牢な光増感剤(すなわち、Al(III)フタロシアニンクロリドジスルホン酸(AlPcS2a))がCALIで使用されます。AlPcS2aは、エンドサイトーシスを介してリソソームを標的とし、制御領域17においてエンドソームまたはリソソームを破裂させるために使用される。AlPcS2aは、細胞膜不透過性のフタロシアニンベースの発色団であり、原形質膜上の脂質に結合し、エンドサイトーシスを介してインターナライズされ、最終的にはエンドサイトーシス経路18を介してリソソーム内に蓄積する。近赤外スペクトル領域内の光を吸収し、励起されたAlPcS2a18によって生成される主要なROSである一重項酸素を生成します。一重項酸素の崩壊は、細胞内の小さな領域(約10-20 nm)内での拡散と反応の距離を急速に制限します19。AlPcS2aインキュベーションと光照明の持続時間を調整することにより、細胞内領域内のIVの損傷の時空間制御が可能になります。したがって、CALIは、IV損傷の結果、およびIVの形成と調節を調べるための強力なツールになります。
この研究では、光増感剤としてAlPcS2aを使用するCALIの特定のプロトコルに対処します。このプロトコルは、エンドソームやリソソームを含むさまざまなタイプのIVに適用でき、膜破裂後のフォローアップ応答を調べるために使用できます。リソソーム破裂後に明らかにされた蛍光色素結合ガレクチン-316,20を発現するHeLa細胞を使用して、このプロトコルを実証します。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Al(III) 塩化フタロシアニンジスルホン酸 (AlPcS2a)</td><td>Frontier Scientific</td><td>P40632</td><td></td></tr><tr><td>培養皿</td><td>同上</td><td>812128-200</td><td></td></tr><tr><td>培養培地</td><td></td><td></td><td>DMEM 10% FBS と 100 U/mL ペニシリン G と 100 mg/mL ストレプトマイシン</td></tr><tr><td>DMEM を補充</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A4736301</td><td></td></tr><tr><td>Gal3-GFP プラスミド</td><td>addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 3000 キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker グリーン DND-26</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>L7526</td><td>緑色蛍光色素</td></tr><tr><td>マルチウォールプレート</td><td>パーキネルマー</td><td>PK-6005550</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Q15895</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>細胞株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa細胞株</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>この方法は、付着したほとんどの細胞株に適用できます。条件は個別に決定する必要があります。</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro;m</td><td>フィルター メルク</td><td>SLGV013SL</td><td></td></tr><tr><td>コリメートLEDライト&nbsp;(660nm)</td><td>Thorlabs</td><td>M660L3-C1およびDC2100</td><td>近赤外線は、AlPcS2aの励起スペクトルに理想的なベースです。</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 780</td><td>長期イメージングにはインキュベーションシステムが必要です。</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c 分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赤色LEDライト</td><td>Tholabs</td><td>M660L4-C1</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞内小胞破裂の機能を調べるための光力学的アプローチ

A Photodynamic Approach to Study Function of Intracellular Vesicle Rupture

細胞内小胞(IV)は、小胞の細胞質へのエンドサイトーシスによって形成されます。IV形成は、IV膜の透過処理やエンドソームやリソソームの形成を通じて、さまざまなシグナル経路の活性化に関与しています。発色団支援レーザー不活性化(CALI)と呼ばれる方法は、IVの形成とIV制御の制御における材料の研究に適用されます。CALIは、膜透過処理によって誘導されるシグナル伝達経路を研究するためのイメージングベースの光力学方法論です。この方法は、選択された細胞小器官の時空間操作を細胞内で透過処理することを可能にする。CALI法は、エンドソームやリソソームの透過処理を通じて特定の分子を観察・モニタリングするために応用されています。IVの膜破裂は、ガレクチン-3などの糖鎖結合タンパク質を選択的に動員することが知られています。ここでは、AlPcS2a によるIV破裂の誘導と、障害のあるリソソームを標識するためのマーカーとしてのガレクチン-3の使用について説明しており、さまざまな状況下でのIV膜破裂の下流効果とその下流効果の研究に役立ちます。

エンドソームおよびリソソームを含むIVのAlPcS2a誘発損傷を表す模式図が示されている(図1)。
市販のマーカーを使用して、AlPcS2a 染色条件を決定することができる。例えば、AlPcS2a 点状点および緑色蛍光色素22 共局在(図2)。
蛍光色素標識ガレクチン-3は、IV損傷をモニタリングするための指標として適用できます(図3)。さらに、Gal3 punctaの位置は、リソソーム修復およびリソファジー3,23を含む下流シグナル伝達経路をアッセイするために追跡することもできます。細胞質ゾルから損傷したIVへのGal3...

AlPcS2aを介した発色団支援レーザー不活性化(CALI)は、生細胞の細胞内小胞(IV)の時空間的損傷を研究するための強力なツールです。

Intracellular vesicles (IVs) are formed through endocytosis of vesicles into cytoplasm. IV formation is involved in activating various signal pathways ...

小胞の細胞形成へのエンドサイトーシスは、細胞内小胞の形成をもたらす。小胞の透過処理は様々なシグナル経路を活性化する。発色団支援レーザー不活性化は、細胞内小胞破裂の結果を研究するために使用されます。細胞内小胞に対する細胞内損傷の空間的および時間的制御は、静置状態および光照明を調整することによって達成することができる。まず、HeLa細胞培養を10%FBSを添加したDMEMで維持します。細胞をPBSで洗浄した後、細胞をトリプシン処理します。次に、10%FBSを添加したDMEMで細胞を再懸濁します。300ナノグラムのGal3-GFPプラスミドを25マイクロリットルの還元血清培地で希釈する。次に、0.6マイクロリットルのP3000試薬を追加します。そして穏やかに混合し、続いて溶液をボルテックスする。0.45マイクロリットルのリポフェクタミン3000試薬を25マイクロリットルの還元血清培地で希釈し、穏やかに混合します。室温で5分間インキュベートします。次に、希釈したDNAと希釈したリポフェクタミン3000を混合し、室温で10分間インキュベートします。DNAリポフェクタミン混合物を混合した後、300, 000個のHeLa細胞と200マイクロリットルのDMEMを10%FBSと混合し、35ミリメートルのガラスボタン皿の中央ガラス領域に細胞を播種します。細胞を付着させるには、5%二酸化炭素を供給されたインキュベーター内で摂氏37度で細胞を少なくとも4時間インキュベートします。10%FBSを添加したDMEMでAlPcS2aを希釈して、1マイクロモルのAlPcS2a溶液を作製します。AlPcS2a含有培地を摂氏37度のウォーターバスで予熱し、培養培地をAlPcS2a含有培地と交換します。5%二酸化炭素を供給したインキュベーター内で摂氏37度で細胞を一晩インキュベートします。翌日、細胞をPBSで2回洗浄し、培地を新鮮な培地に交換した後、細胞外AlPcS2aを除去した。摂氏37度で4時間インキュベートし、エンドサイトーシス経路に沿った残留色素がリソソームに蓄積できるようにします。リソソームを損傷して単一細胞を操作するには、共焦点顕微鏡のステージに培養皿を置きます。GFPとAlPcS2aを励起するには、それぞれ488ナノメートルと561ナノメートルのレーザーを使用します。損傷するように選択されたAlPcS2a標識小胞上の5×5マイクロメートル四方の関心領域を丸で囲みます。次に、0.21ミリワットの633ナノメートルレーザー、つまり70回の繰り返しで関心領域をパルス照明します。リソソーム膜透過処理の指標としてGal3プンクタの形成を監視する。HeLa細胞におけるAlPcS2aによるリソソーム染色は市販のマーカーを用いて行い、緑色蛍光色素で陽性染色した。TagRFP-ガレクチン3発現HeLa細胞中のリソソームをAlPcS2aで染色した。近赤外光で照明を集束させた後、結果は、AlPcS2aベースの発色団支援レーザー不活性化が、関心のある領域内の局所的なリソソーム破裂を制御し、残りのリソソームを無傷のままにすることができることを示しています。インキュベーション時間が立っているエンドソームまたはリソソームを決定するため、このステップは重要です。例えば、人々は膜不透過性色素の放出によってサイズを決定することができる。また、FITCデキストランなどのpH感受性色素を使用して、エンドソームとリソソームを区別することもできます。この技術は、細胞内小胞膜破裂の下流効果を開始するのに有用である。そして、さまざまな状況下で下流の影響があります。

a-photodynamic-approach-to-study-function-intracellular-vesicle

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は内膜破裂を追跡するための方法を説明することは細胞内細菌によって誘発...

細胞内病原体によって引き起こされる液胞破裂のシングルセル測定

親油性色素FM1-43に曝露された細胞のライブイメージングは​​、孔形成毒素は原形質膜から除去されることにより、反応速度の正確な決定を可能にする。これは、Ca 2 +、スフィンゴミエリナーゼおよび原形質膜の修復に関する他の要因のための要件を評価するために使用できる高感度のアッセイである。...

カルシウムの役割を評価するためのイメージングアッセイを生きる<sup&gt; 2 +</sup孔形成毒素の傷の修復&gt;とスフィンゴミエリナーゼ

治癒損傷した細胞の処理は細胞膜の損傷部位に特異的なタンパク質および細胞内コンパートメントの輸送を伴う。このプロトコルは、これらのプロセスを監視するためのアッセイを説明しています。...

イメージング細胞膜の損傷および修復に関与する細胞内プロセス

この論文は、シナプトブレビン2-pHluorinコンストラクトと全反射蛍光顕微鏡を使用して、神経芽細胞腫細胞における神経伝達物質小胞動態を調査する方法を提供します。また、画像処理とデータ分析のために開発された戦略についても報告されています。...

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

2 光子レーザーを介して細胞膜が負傷した膜を再シール能力評価に広く使われている方法で、複数の細胞のタイプに適用できます。ここでは、体外でライブ イメージング dysferlinopathy 2 光子レーザー アブレーション患者細胞の膜を再シールするためのプロトコルについて述べる.

2 光子レーザー顕微鏡を用いた細胞膜修復法

住セルイメージ投射は、固定細胞イメージングだけで達成可能ではない単一セルまたは全体人口の豊富な情報を提供します。ここでは、下記の抗有糸分裂薬パクリタ キセルで治療細胞運命決定を評価する生細胞イメージング...

長期的な住セルイメージ投射細胞の運命をパクリタ キセルに応答を評価するために

ローカライズされたカルシウム イオン勾配を使用して小胞の非接触マイクロマニピュレーション用手法を提案します。巨大な脂質ベシクルの近くのカルシウム...

ローカライズされたカルシウム イオン勾配に対応した膜小胞の膜を改造

走査型電子顕微鏡および NMR による脂質結合ネクロトーシス従来および共焦点の生細胞顕微鏡イメージングなどの MLKL...

ネクロトーシス MLKL を介した細胞膜破壊の解析

蛍光漏れアッセイは、ペプチド/膜相互作用の調査を可能にする簡単な方法であり、いくつかの生物学的プロセスへの関与、特に細胞内転位プロセス中に細胞透過性ペプチドが二重層のリン脂質を乱す能力を理解する。...

細胞透過性ペプチドによる膜不安定化を調べる蛍光漏れアッセイ

サーモプラズモニック穿刺法は、共焦点顕微鏡、光ピンセット、金ナノ粒子を統合して、細胞や巨大な単層小胞の原形質膜修復中のタンパク質応答を研究します。この技術により、迅速かつ局所的な膜穿刺が可能になり、複雑な原形質膜修復機構における重要なタンパク質とその機能的役割を同定することができます。...

生細胞およびモデル膜における原形質膜修復研究のための熱プラズモニックアプローチ

このプロトコルは、リソソーム膜の完全性と酸性化の変化を検出する蛍光プローブを利用して、ネクロプトーシス中のリソソーム膜透過性をモニタリングするための生細胞イメージング法を説明しています。...

ネクロプトーシス中のリソソーム膜透過処理の生細胞イメージング

学ぶCALIを用いた細胞内小胞破裂の光力学的制御法。HeLa細胞でリソソーム膜透過化を誘導し、シグナル伝達経路の動態を解析する技術です。生細胞イメージングで局所的なダメージ制御を実現します。

細胞内小胞破裂の機能を調べるための光力学的アプローチ

さらに動画を探す