タンパク質保存の迅速な評価のための種間の感受性を予測するための配列アラインメントツールのデモンストレーション

化学物質の安全性の文脈では、SeqAPASSプロトコルは、毒性と生物学的経路の知識の両方を外挿するために、種の多様性にわたるタンパク質保存を評価するための迅速かつ合理化されたプロセスを提供します。SeqAPASSは、研究者と意思決定者の両方による使用を目的とした、迅速な種間外挿のための簡素化された透過的でユーザーフレンドリーなWebベースのインターフェイスとして開発されました。このツールは、種の感受性に関する入手可能な情報を使用して化学毒性の知識を推定するという課題に対処し、実験室の設定ではテストできない数百から数千の種の化学物質感受性を一貫して予測します。

SeqAPASS ツールの操作を開始するには、まず [seqapass.epa.gov] に移動します。既存のユーザーは、アカウントのログインボタンを選択できます。新規ユーザーは、ホームページのリンクを選択してアカウントを作成できます。

SeqAPASS ツールにログインした後、[SeqAPASS の実行をリクエスト] タブに移動します。SeqAPASSには、ユーザーがクエリタンパク質ターゲットを特定するのに役立ついくつかの役立つリソースが含まれています。これらには、[タンパク質ターゲットの特定]の下のドロップダウンボタンをクリックしてアクセスできます。

タンパク質ターゲットが特定されたら、一次アミノ酸配列の比較の下にある種別またはアクセッション別をクリックします。たとえば、ミューオピオイド受容体の保存を分析するには、[アクセッション別] をクリックし、[タンパク質アクセッション] ボックスにアクセッション番号を入力します。タンパク質アクセッションがユーザーによってすでに特定されていない限り、種検索オプションが推奨されます。

[要求の実行] を選択してクエリを開始します。クエリが送信されたら、ページの上部にある [SeqAPASS 実行状態] タブを選択して、送信された実行の状態を表示します。完了までの時間は、現在のツールの使用状況によって異なります。

[SeqAPASS レポートの表示] タブには、特定のアカウントで実行されたすべての実行が一覧表示されます。「レポートの表示」を選択して Web ブラウザーでデータを表示し、「選択したレポートをリクエスト」をクリックしてレベル 1 の「Query Protein Information」ページを開き、結果とデータのカスタマイズ・オプションを表示します。レベル2のSeqAPASS解析を開発して実行し、特定のタンパク質ドメインの保存を評価するには、レベル1のクエリタンパク質情報ページのレベル2ヘッダーの横にあるプラス記号をクリックして、レベル2のクエリメニューに入力します。

[ドメインの選択] ボックスをクリックして、クエリタンパク質の機能ドメインの一覧を入力します。NCBI 保存ドメインデータベースからドメインが識別され、[SeqAPASS] ドロップダウンリストで選択されたら、レベル 2 のクエリを開始します。これを行うには、[ドメイン実行の要求] ボタンをクリックします。

[レベル 2 と 3 回の実行の更新] をクリックして、レベル 2 のデータを入力します。[レベル 2 データの表示] で、[完了したドメインの選択] ボックスをクリックして、完了したドメイン アクセッションを選択します。次に、[レベル 2 データの表示] ボタンをクリックして結果を開くことができます。

選択したレベルの [SeqAPASS の表示] タブにデータが表示されるので、まずレベル 1 のデータを見てみましょう。[タンパク質情報のクエリ] ページで、プライマリレポートまたはフルレポートの横にあるラジオボタンを選択して、データを要約形式または拡張形式で表示します。種は、タンパク質がクエリ配列に対して保存されているかどうかを示す「はい」または「いいえ」の感受性予測を持ちます。

レポート内で、適切なタンパク質アクセッションまたは種IDをクリックして、NCBIデータベースにリンクし、詳細情報にアクセスします。感受性予測のある種の対応する毒性データを調べるには、結果表の右側までスクロールしてECOTOX列を表示します。リンクをクリックすると、ECOTOXicologyナレッジベース内で問題の種が開き、毒性データを見つけることができます。 フルレポートとプライマリレポートに加えて、データの概要レポートは、[レベル1のサマリーレポートを表示]を選択して表示できます。

概要レポートには、分類グループ全体の概要メトリックと感受性予測が表示されます。任意のレポート形式のデータを簡単にダウンロードできます。目的のレポートタイプを選択した状態で、[表のダウンロード] をクリックしてスプレッドシートファイルとして保存します。

レベル 2 のデータを表示するには、[SeqAPASS の表示] タブの一番上までスクロールし、[レベル 2] を選択します。レベル2のSeqAPASSデータは、レベル1のレポートと同様に表示され、タンパク質情報のクエリページの下部にも使用できます。目的のレポートタイプの横にあるラジオボタンを選択して、データを表示します。

レベル2のレポートには、レベル1と同様の情報が表示されますが、タンパク質ドメインに関する情報が追加されています。SeqAPASSデータは、解釈を容易にするために簡単に視覚化できます。[ビジュアライゼーション]の横にあるプラス記号をクリックしてから[データの視覚化]ボタンをクリックして、インタラクティブなBoxPlotを新しいタブで開きます。

新しいタブで、[箱ひげ図] ボタンを選択します。BoxPlot ページの上部にあるコントロール オプションは、ユーザーがグラフをカスタマイズするのに役立ちます。ユーザーは、グラフに分類グループを追加または削除したり、凡例に表示する種を選択したり、種の名前の表示方法を選択したり、絶滅危惧種や絶滅危惧種などの特定の種のサブセットを強調表示したりできます。

ビジュアライゼーションは簡単にエクスポートして保存できます。BoxPlotのダウンロードをクリックしてファイルタイプを選択し、図をダウンロードします。ダウンロードする前に、ユーザーは画像のファイルタイプの解像度をカスタマイズできます。

ほとんどの解析ではデフォルトのレポート設定で十分ですが、パラメータはタンパク質情報の照会メニューの上部にあるサブメニューを使用して変更できます。現在のレポート設定を記録するには、[現在のレポート設定のダウンロード] ボタンをクリックして、現在適用されている設定をキャプチャしたファイルをダウンロードします。これは、レベル 1 とレベル 2 で実行できます。

ここでは、レベル 1 の例を示します。レベル3のSeqAPASS分析を開始するには、レベル1のクエリタンパク質情報ページに移動し、レベル3ヘッダーの横にあるプラス記号をクリックして、個々のアミノ酸残基の比較を可能にするレベル3のクエリメニューを入力します。レベル3の分析を行う前に、既存の文献のレビューを通じて特定のアミノ酸残基を特定する必要があります。

参照エクスプローラーの横にあるプラス記号をクリックして、参照エクスプローラー ツールを開きます。これは、使用可能な文献を照会するための定義済みのブール文字列を生成するのに役立ちます。[Google 学者の生成] リンクをクリックして、文献検索文字列を生成します。

これをコピーして、目的の文献データベースを検索するために使用できます。または、[Google 学者を検索] を選択すると、定義済みの検索文字列を使用して Google 学者の文献が自動的に検索されます。アミノ酸残基が選択されると、ユーザーはレベル3の分析を設定できます。

ユーザーが選択した種を整列して比較するテンプレートシーケンスを選択します。オプションで、追加のテンプレートシーケンスを[追加の比較]ボックスに入力できます。特定のシーケンスを整列する前に、ユーザーはユーザー定義の実行名を入力する必要があります。

これは、実行を識別するために使用されます。[分類グループの選択] ボックスで分類グループを選択します。このプロセスは、ユーザーが保全のために評価したいすべての分類グループに対して繰り返されることに注意してください。

テンプレート配列にアラインメントするすべての必要な種を選択したら、[残渣実行の要求]を選択します。すべての種が整列したら、[レベル 2 および 3 の実行を更新] をクリックして、[レベル 3 の実行名の選択] メニューに完了したレベル 3 のジョブを入力します。レベル 3 のデータは、個々の分類グループごとに、または複数の分類グループ間で表示できます。

[レベル 3 データの結合] をクリックしてレベル 3 の結合ダイアログ ボックスを開き、複数の分類グループを同時に分析します。[レベル 3 レポートを結合] ダイアログ ボックスを使用して、比較の基準として使用するレベル 3 テンプレートを選択します。次に、比較する完了したジョブを選択します。

必要に応じてレベル 3 のジョブを注文し、[レベル 3 データの表示] をクリックしてレベル 3 のレポート ページを作成します。レベル3テンプレートタンパク質情報ページには、テンプレート配列から以前に同定されたアミノ酸位置が表示され、アラインメントのために選択することができます。テキストボックスにコンマで区切って位置を入力するか、残余リストから選択します。

すべての位置を入力したら、[残渣リストにコピー]を選択して、残渣を選択ボックスにシャトルします。すべてのアミノ酸位置を選択し、精度をチェックしたら、[レポートの更新]をクリックして、指定された位置で整列した配列を更新します。ページの一番下までスクロールして、結果のレポートを表示します。

前のレベルと同様に、プライマリレポートまたはフルレポートの横にあるラジオボタンを選択して、レポートタイプを選択します。レベル3のレポートには、類似の種とタンパク質が表示され、評価された各アミノ酸残基のアラインメントと保存情報が含まれています。レポートを保存するには、レポートの下部にある [表のダウンロード] をクリックし、スプレッドシート ファイルとして保存します。

ユーザーは、[レベル 3 の概要レポートの表示] を選択して、概要レポートのテーブルを表示およびダウンロードすることもできます。レベル 3 データのビジュアリゼーションを表示するには、ビジュアリゼーション ヘッダーの横にあるプラス記号をクリックし、[データの視覚化] を選択して新しいページを開きます。ビジュアリゼーション情報ページの「ヒートマップ」(Heat Map) をクリックして、インタラクティブなグラフィックとコントロールを開きます。

[コントロール] の下のビジュアライゼーション ページで、ヒート マップに表示する分類グループを選択し、矢印ボタンを使用してそれらをシャトルし、必要に応じて並べ替えます。デフォルトでは、ヒート マップ ビジュアリゼーションには、種の共通名、全体的な感受性予測、および各アミノ酸残基の一致ステータスが表示されます。ヒートマップ設定を操作するためのオプションは、[コントロール]見出しの下の展開可能なメニューにあります。

[レポート オプション] で、単純なレポートまたは完全なレポートを選択でき、表示される種を一般名または学名の間で切り替えることができます。[オプションの選択] では、オルソログ候補、絶滅危惧種、絶滅危惧種、一般的なモデル生物などの種のサブセットを選択し、ヒート マップで強調表示できます。[ヒート マップ設定] で、ヒート マップに表示される情報は、チェック ボックスとチェック ボックスをオフにしてカスタマイズできます。

感受性予測および感受性テキストを削除することができ、アミノ酸アラインメントおよびアミノ酸情報を削除することができる。ヒート マップ ビジュアリゼーションを保存するには、[ヒートマップのダウンロード] をクリックし、目的のファイル タイプを選択します。SeqAPASSは、ユーザーがレベルと種全体の感受性予測を同時に迅速に評価できるようにする決定要約レポートを備えています。

[結果] ページまたは [データ ビジュアライゼーション] ページから [レベルを DS レポートにプッシュ] をクリックすると、データが [DS レポート] タブに転送され、すべてのレベルの分析を組み合わせて表示できます。ミューオピオイド受容体のレベル1分析の結果は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、およびほとんどの魚種がこのカットオフを上回り、感受性予測を受けて55%の感受性カットオフを示し、はい。カットオフを完全に下回るボックスは、いいえの感受性予測を受け取ります。

ミューオピオイド機能ドメインのレベル2分析では、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、およびこのカットオフを超えるほとんどの魚種との88%の類似性の高い感受性カットオフが特定され、脊椎動物全体の保存またはミューオピオイド受容体の別の証拠ラインを提供しました。レベル3の分析では、評価されたすべての種が「はい」の感受性予測をもたらしました。これらのアミノ酸は、強力なミューオピオイド受容体アゴニストと強力なアンタゴニストの両方の結合に重要であるため、これらのデータは、ヒト受容体を標的とするオピオイド化合物が脊椎動物種全体の受容体と同様に相互作用する可能性があることを示唆しています。

SeqAPASSのレベル3は、仮説の生成に役立ちます。目的のタンパク質の重要なアミノ酸残基が不明な場合でも、このツールを使用して種全体を調べ、保存が存在する場所、または保存状態が低い場所を特定できます。これらの仮説は、部位特異的突然変異誘発研究などの分子生物学的手法でテストできます。

SeqAPASSの最初の焦点は、化学的標的にありました。しかし、私たちの研究は、一次代謝酵素、輸送タンパク質、および生体内蓄積に関与するタンパク質を探索するために拡大しています。