Name: 治療誘発性老化癌細胞における複数の蛍光老化マーカーの同時イメージングおよびフローサイトメトリーベースの検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぶ イメージングフローサイトメトリーを用いて、治療誘発性老化したDLBCL細胞における複数の蛍光老化マーカーを単一細胞レベルで可視化・定量化する方法。この技術は高解像度イメージングと高速解析を組み合わせ、従来の手法では得られない空間情報を提供します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、ヨハネス・ケプラー大学リンツ校(BERM16108001)からヨン・ユーへの助成金によって支援されました。

1. 細胞老化を誘導するマフォスファミドまたはダウノルビシン処理によるDLBCL細胞株
注:このプロトコルは、付着がん細胞に対しても機能します。細胞サイズに応じて、種子1〜2×105 個の細胞を6ウェルプレートの1ウェルに浸し、処理前にプレートを5%CO2、37°Cインキュベーター中で一晩インキュベートする。プロトコルの手順は浮遊細胞の場合と同じですが、2 つの例外があります。まず、ステップ3.4の後に細胞をプレートからトリプシン処理する必要があります。第2に、洗浄工程は、トリプシン処理の前に遠心分離なしで行われる。
<ol><li>DLBCL細胞および種子1×106細胞/mLを1 ウェルあたり4mLの培地でカウントし、6ウェル培養プレートに入れます。10%ウシ胎児血清(FBS)および100U/mLペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地でDLBCL細胞を培養する。</li>
	<li>MAF(5 μg/mL)またはDN(20 ng/mL)を細胞培養物に加え、プレートを静かに揺らして混合します。 メモ: MAF と DN は安定していません。DMSOに溶解した後、原液を小分けし、-20°Cで保存すべきである。 凍結/解凍サイクルは避けるべきです。</li>
	<li>プレートを5%CO2、37°Cのインキュベーター内で3日間インキュベートする。</li>
	<li>3日間のインキュベーション後、DLBCL細胞を15mL滅菌遠沈管に集め、100× g、4°Cで5分間スピンさせた。</li>
	<li>上清を捨て、細胞ペレットを4 mLの新鮮な培地で再懸濁し、懸濁液を6ウェルプレートに戻します。</li>
	<li>分析のために回収する前に、細胞プレートを5%CO2、37°Cのインキュベーター内でさらに2日間培養する。</li>
</ol>2. 染色用溶液の調製(表1)
3. 異なる老化マーカーでDLBCL細胞を染色する
注:個々のマーカー(パシフィックブルーEdU、C12FDG、またはAlexa Fluor 647-γH2AX)で染色された細胞サンプルは、測定中の蛍光スピルオーバーを補正するための補償マトリックスを生成するために調製されます。強く示唆されていますが、異なる蛍光色素分子間で発光スペクトルの省略可能な重複(補償係数値≤0.1)がある場合、このステップは中断される可能性があります。ただし、ユーザーは、異なる機器や蛍光パネルを使用する場合、標準化された補償手順を決定する必要があります。
<ol><li>ステップ1.6から生成したDLBCL細胞培養物に10mM EdU溶液を1:1,000の割合で加える(最終EdU濃度は10μM)。プレートを穏やかに揺らして混合し、5%CO2、37°Cのインキュベーター内で3時間インキュベートする。</li>
	<li>プレートをインキュベーターから取り出し、100 mM クロロキン溶液を終濃度 75 μM になるように加えます (ディスカッションを参照)。プレートを穏やかに揺らして混合し、5%CO2、37°Cのインキュベーター内で30分間インキュベートする。</li>
	<li>プレートをインキュベーターから取り出し、20mM C 12 FDG 溶液を 1:1,000 で加え、最終 C12FDG 濃度 20 μM にします。プレートを静かに揺らして混合し、5%CO2、37 °C インキュベーター内で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>プレートをインキュベーターから取り出し、100 mM 2-フェニルエチル-β-D-チオガラクトシド(PETG)溶液を1:50で加えて、fSA-β-gal染色(最終PETG濃度2 mM)を停止します。プレートを静かに回転させて混合します。</li>
	<li>細胞を15mL滅菌遠沈管に移し、100 × g、4°Cで5分間スピンさせた。上清を捨て、4 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄する。</li>
	<li>PBS洗浄工程を繰り返す。上清を捨て、細胞ペレットを500μLの4%パラホルムアルデヒド固定溶液に再懸濁する。</li>
	<li>室温で10分間インキュベートした後、250× gで遠心分離機、室温で5分間培養する。上清を捨て、4mLのPBSで細胞を洗浄する。</li>
	<li>PBS洗浄工程を繰り返す。上清を捨て、細胞ペレットを200 μLのサポニン透過バッファーに再懸濁し、懸濁液を新しい1.5 mLチューブに移します。室温で10分間インキュベートした後、250× gで遠心分離機、室温で5分間培養する。</li>
	<li>上清を捨て、細胞ペレットを200 μLの一次抗体溶液(抗体インキュベーション溶液中の1:500 γH2AX抗体)に再懸濁する。暗所で一晩4°Cでインキュベートする。</li>
	<li>チューブを250 × g、4°Cで5分間遠心分離する。上清を捨て、100μLのサポニン洗浄液で洗浄する。</li>
	<li>洗浄ステップをさらに2回繰り返します。上清を捨て、細胞ペレットを500μLのEdU検出カクテルに再懸濁する。</li>
	<li>暗所で室温で30分間インキュベートする。250× g、室温で5分間遠心分離する。上清を捨て、1mLのサポニン洗浄液で洗浄する。</li>
	<li>洗浄工程を2回繰り返します。上清を捨て、細胞ペレットを20〜50μLのPBSに再懸濁する。サンプル測定については、セクション 4 に進みます。</li>
</ol>4. イメージングフローサイトメーターシステムを用いた老化マーカーのイメージング
<ol><li>廃液ボトルを空にします。スピードビーズ、滅菌器、クリーナー、デバブラー、シース、すすぎ試薬(脱イオン水)のレベルをチェックして、機器の電源を入れる前に十分な液体を確認してください( 材料表を参照)。</li>
	<li>計測器とイメージングソフトウェアの電源を入れます( 図1Aのソフトウェアインタフェースを参照)。</li>
	<li>スタートアップ ボタンをクリックして、 流体工学とシステムキャリブレーションを初期化します。 メモ: この手順には約 45 分かかります。</li>
	<li>倍率を40倍に設定し、流体速度を低く設定し、実験に必要なレーザーをオンにします。405 nm、488 nm、および 642 nm レーザーをオンにして、それぞれ EdU-Pacific blue、C 12 FDG、Alexa Fluor 647-γH2AX(または Alexa Fluor 647-Ki67)を測定します。散乱チャンネルには Ch6、明視野には Ch1 と Ch9 を設定します。</li>
	<li>レーザーの強度を設定するために、最も高い蛍光を有すると予想されるサンプルから始めます。サンプルチューブを静かにひっくり返して混合します。チューブの蓋を開き、サンプルチューブをドックに挿入します。 [読み込み] をクリックして開始します。</li>
	<li>散布図を開き、X 軸と Y 軸のフィーチャArea_M01とアスペクトRatio_M01をそれぞれ選択します。アスペクト比より上のゲートを0.5に設定して、下側と右側のダブレットと細胞凝集体を除外し、左側にスピードビーズ集団を除外します(図1B)。</li>
	<li>ヒストグラムプロットを開き、X 軸の勾配RMS_M01_Ch01機能を選択します。一重項集団を選択し、集束した細胞を選択するゲートを設定します(図1C)。 メモ:イメージングシステムは、自動的にスピードビーズを使用してイメージングの焦点を調整します。ただし、ヒストグラムのピークの右半分を、最も焦点を絞った母集団に対して選択することをお勧めします。</li>
	<li>ヒストグラムプロットを開き、各カラーチャンネル(Ch2、7、および11)のX軸の生の最大ピクセル強度を選択します。レーザー出力を調整します (つまり、Ch2、7、および 11 のレーザーはそれぞれ 488 nm、405 nm、および 642 nm レーザー)、過飽和を避けるために、各蛍光色素の Raw Max Pixel 値が 100 ~ 4,000 になるようにします。 メモ: この実験では、レーザー出力の設定は、レーザー 488 nm、405 nm、および 642 nm の場合、それぞれ 50 mW、200 mW、および 50 mW です。</li>
	<li>記録する焦点を絞った母集団を選択し、[ 集録] をクリックして、一貫した設定でDLBCLサンプルを測定します。測定用のサンプルを変更する場合は、[ 戻る] をクリックしてサンプルチューブを回収します。 Load を押してサンプルを 破棄 します。</li>
	<li>すべてのサンプルが測定されたら、明視野と散乱レーザーをオフにします。単色コントロールサンプルを測定して補正マトリックスを生成します。</li>
	<li>シャットダウンをクリックして、イメージングシステムを閉じます。</li>
	<li>画像解析ソフトでデータを解析します。<ol><li>画像解析ソフトウェアの スポットウィザード ツールを使用して、生細胞画像中の核γH2AX病巣を自動的にカウントおよび定量します。2 つの細胞集団 (1 つは高い細胞集団ともう 1 つは低いスポット数) を選択して、スポットウィザードをトレーニングして、さらに自動スポットカウント分析を行います。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+is+a+DNA+damage+response+triggered+by+DNA+hyper-replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication.</a> Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).</li>
<li>Milanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+reprogramming+promotes+cancer+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness.</a> Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).</li>
<li>Passos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+between+p21+and+reactive+oxygen+production+is+necessary+for+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 347(2010).</li>
<li>Lee, S., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+nature+of+senescence+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The dynamic nature of senescence in cancer.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).</li>
<li>Toussaint, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+premature+senescence+or+stress-induced+senescence-like+phenotype%3A+one+in+vivo+reality%2C+two+possible+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions.</a> The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).</li>
<li>Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+cancer+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in cancer and aging.</a> Cell. 130 (2), 223-233 (2007).</li>
<li>Munoz-Espin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+senescence+during+mammalian+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed cell senescence during mammalian embryonic development.</a> Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).</li>
<li>Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmasking+senescence%3A+context-dependent+effects+of+SASP+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).</li>
<li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease%3A+from+mechanisms+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li>
<li>Chandra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reorganization+of+the+nuclear+landscape+in+senescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells.</a> Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).</li>
<li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+DNA+damage+signalling+triggers+senescence-associated+inflammatory+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).</li>
<li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3-mediated+epigenetic+regulation+of+senescence+in+mice+predicts+outcome+of+lymphoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients.</a> Nature Communications. 11 (1), 3651(2020).</li>
<li>Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+ageing%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).</li>
<li>Fan, D. N., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+markers+of+therapy-induced+senescence+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).</li>
<li>Schmitt, C. A., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+chemoresistance+in+transgenic+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models.</a> Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).</li>
<li>Dorr, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+lethal+metabolic+targeting+of+cellular+senescence+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy.</a> Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).</li>
<li>Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxic+stress-induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genotoxic stress-induced senescence.</a> Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).</li>
<li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li>
<li>Biran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+identification+of+senescent+cells+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative identification of senescent cells in aging and disease.</a> Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).</li>
<li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740(2021).</li>
<li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li>
</ol>

著者らは、開示すべき利益相反はありません。

この方法は、明視野イメージングおよびフローサイトメトリーベースの定量化を用いて、化学療法治療時の4つの異なるDLBCL細胞株の老化侵入能力を調べた。単一細胞レベルでは、治療されたKARPAS422およびWSU-DLCL2細胞において主要なC12 FDG+EdU-Ki67+老化集団を検出することに成功し、OCI-LY1細胞においてより少ない程度であったが、SU-DHL6細胞株は治療に対して耐性であった。細胞株間の老化導入能力の違いは、それらの明確なゲノム欠損によって説明され得る16,17。しかしながら、不適切な細胞培養密度または薬物濃度も老化誘導性に影響を及ぼす可能性がある。細胞密度および薬物濃度の段階希釈は、より包括的な検査のために慎重に選択されるべきである。特に、この方法は、追加の遺伝毒性刺激なしにDLBCL細胞中の天然に存在する老化集団を正確に検出するのに十分な感度を有していた(図3</s...

様々な刺激が細胞老化を誘発し、細胞が安定した細胞周期停止の状態に入る原因となり得る。これらの刺激には、内因性シグナル伝達変化または外因性ストレスが含まれる。内因性シグナルには、進行性テロメア短縮、テロメア構造の変化、エピジェネティック修飾、プロテオスタシス障害、ミトコンドリア機能障害、および癌遺伝子の活性化が含まれる。外因性ストレスには、炎症性および/または組織損傷シグナル、放射線または化学的処置、および栄養欠乏が含まれる1,2,3,4。異なるタイプの老化の中で、最も一般的に見られ、よく研究されているのは、複製性老化、癌遺伝子誘発性老化(OIS)、放射線誘発性老化、および治療誘発性老化(TIS)である。OISは、異常な癌遺伝子活性化によって生じる複製ストレスによって引き起こされる遺伝毒性損傷に対する急性細胞応答であり、腫瘍前病変から本格的な腫瘍への病理学的進行をある程度防ぐことができる。TISは、腫瘍細胞が化学療法薬または電離放射線によってストレスを受けているときに起こります5,6。
老化は、その非常にダイナミックな性質のために病理学において諸刃の剣と考えられている。当初、分裂細胞の循環プールから損傷細胞を除去し、臓器の正常な機能を保護し、腫瘍増殖を阻害する有益な腫瘍抑制機構として記載されていた7,8,9。しかし、新たな証拠は老化の暗い側面を示唆している。老化細胞は、老化関連分泌表現型(SASP)として知られる炎症誘発性サイトカインを分泌し、線維症および機能不全の器官をもたらし、腫瘍の開始および進行を促進する10。さらに、老化癌細胞は、クロマチンリモデリングおよび持続的DNA損傷応答(DDR)11,12の活性化と並行してエピジェネティックおよび遺伝子発現リプログラミングを受け、新たに新しい癌幹細胞特性を獲得する3。老化可能な腫瘍は、老化が不可能な腫瘍と比較して治療介入に対してよりよく応答するが13、老化細胞の持続性は、それらが血清分解薬によって効果的に同定および排除されない場合、長期予後不良につながる可能性がある5。いずれにせよ、老化を評価するための信頼できる方法は、治療治療の予後だけでなく、老化細胞を標的とする新規戦略の開発にとっても、重要な臨床的関心がある。
異なるトリガーにかかわらず、老化細胞は、大きな液胞を有する拡大、扁平化、多核形態、有意に拡張された核、核内のH3K9me3リッチ老化関連ヘテロクロマチン(SAHF)の形成、DNA損傷マーカーγH2AX病巣の持続的な蓄積、活性化p53-p21CIP1およびRb-p16 INK4aを含むいくつかの共通の特徴を示す。 細胞周期調節機構、安定したG1細胞周期停止、SASPの大量誘導、および老化関連β−ガラクトシダーゼ(SA−β−gal)活性の上昇14。老化を定義するのに十分な単一のマーカーはないため、老化検出のゴールドスタンダードと考えられているSA-β-gal活性の酵素染色は、通常、H3K9me3およびKi67の免疫組織化学染色と組み合わせてTIS15を検出します。しかしながら、化学的発色系SA−β−galは定量化が困難である。ここでは、5-ドデカノイルアミノフルオレセイン-ジ-D-ガラクトピラノシド(C12FDG)蛍光ベースのSA-β-gal(fSA-β β-gal)検出とγH2AXおよびEdU組み込みDNAの免疫蛍光染色を組み合わせて、速度、感度、詳細な単一細胞画像とフローサイトメトリーおよび顕微鏡では提供できない空間情報を組み合わせた高度なイメージングフローサイトメーターシステムを使用して、C12 FDG+EdU-γH2AX+老化細胞を同定しました。この方法により、細胞内の蛍光シグナルの位置決めと定量を可能にする高解像度画像の迅速な生成が可能になり、標準パイプラインを構築することで複数のサンプルの迅速な分析がライセンスされます。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td><td>Biolegend</td><td>613407</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)</td><td>Biolegend</td><td>350509</td><td></td></tr><tr><td>C12FDG (5-ドデカノイルアミノフルオレセインジベータ;-D-ガラクトピラノシド)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11590276</td><td></td></tr><tr><td>Chloroquin -Diphosphat</td><td>Sigma aldrich</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>クレンザー (コールター クレンツ)</td><td>ベックマン・コールター</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU パシフィック ブルー フロー サイトメトリー アッセイ キット</td><td>サーモ サイエンティフィック</td><td>C10418</td><td></td></tr><tr><td>ダウノルビシン</td><td>Medchemexpress</td><td>HY-13062A</td><td></td></tr><tr><td>デバブラー (70% イソプロパノール)</td><td>ミリポア</td><td>1.3704</td><td></td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア (Amnis&nbsp;アイデア&nbsp;6.3)</td><td>Luminex</td><td>CN-SW69-12</td><td></td></tr><tr><td>装置およびイメージングソフトウェア (Amnis&nbsp;ImageStreamX&nbsp;Mk II イメージングフローサイトメーターシステムおよびINSPIREソフトウェア)</td><td>Luminex</td><td>100220</td><td></td></tr><tr><td>KARPAS</td><td>DSMZ</td><td>ACC 31</td><td></td></tr><tr><td>mafosfamide cyclohexylamine</td><td>Niomech</td><td>D-17272</td><td></td></tr><tr><td>OCI-LY1</td><td>DSMZ</td><td>ACC 722</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>11473704</td><td></td></tr><tr><td>PETG (2-フェニルエチル-&β;-D-チオガラクトシド)&nbsp;</td><td>ImageStream</td> Luminex 400041<td></td>滅菌器用シグマアルドリッチP4902<td></td></tr><tr><td>サポニン</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>47036</td><td></td></tr>シー<tr><td>ス</td><td>ミリポア</td><td>BSS-1006-B</td><td></td></tr><tr><td>Speedビーズキット</td><td></td><td></td>(0.4-0.7%次亜塩素酸塩)VWR JT9416-1 SU-DHL6 DSMZ ACC 572 WSU-DLCL2 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>DSMZ</td><td>のACC 575</td><td></td></tr></tbody></table>

治療誘発性老化癌細胞における複数の蛍光老化マーカーの同時イメージングおよびフローサイトメトリーベースの検出

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

化学療法薬は、癌細胞に回復不能なDNA損傷を誘発し、アポトーシスまたは早期老化をもたらす可能性がある。アポトーシス細胞死とは異なり、老化は癌細胞の増殖を抑制する根本的に異なる機構である。何十年にもわたる科学的研究により、がん細胞や間質細胞を調節する腫瘍や微小環境における老化がん細胞の複雑な病理学的影響が明らかになってきました。新しい証拠は、老化が癌治療中の強力な予後因子であることを示唆しているため、癌サンプル中の老化細胞の迅速かつ正確な検出が不可欠である。本稿では、がん細胞における治療誘発性老化(TIS)を可視化・検出する方法を提示する。びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)細胞株をマフォスファミド(MAF)またはダウノルビシン(DN)で処理し、老化マーカー、老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)、DNA合成マーカー5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)、およびDNA損傷マーカーγ-H2AX(γH2AX)について調べた。フローサイトメーターイメージングは、高解像度の単一細胞画像を短時間で生成し、がん細胞の3つのマーカーを同時に視覚化および定量化するのに役立ちます。

画像解析ソフトウェアを用いて、単色対照サンプルの記録データをロードして補正マトリックスを生成した。 補足図S1に示すように、EdUからC12 FDGへの無視できない(係数値≥0.1)光スピルオーバーはクロストーク係数値0.248で検出されましたが、他のチャネル間のクロストークは有意ではありませんでした。4つの異なるDLBCL細胞株を5μg/mL MAFまたは20ng/mL DNで処理して細胞老化を誘導し、従来のSA-β-gal染色またはイメージングフローサイトメトリー法のいずれかを用いて分析した。
KARPAS422、WSU-DLCL2、およびOCI-LY1細胞の70%以上がSA-β-gal陽性で示された老化状態に入り、SU-DHL6はMAFおよびDNによる老化誘導に対して完全に耐性であった(補足図S2A)。注目すべきことに、MAFおよびDNはまた、劇的ではないが、すべてのDLBCL細胞において細胞死を誘導した(補足図S2B)。イメージングフローサイトメトリー...

ここでは、単一細胞における複数の老化関連マーカーの可視化および定量化のためのフローサイトメトリーベースの方法を提示する。

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

この手法は、細胞内の蛍光シグナルの空間分布の解析と定量を可能にする高解像度の画像を迅速に生成し、複数のサンプルの迅速な解析を可能にします。細胞は、高度なイメージングフローサイトメトリーシステムを使用して測定され、速度、感度、詳細な単一細胞画像と空間情報を組み合わせることで、フロー検眼や顕微鏡では提供できない独自のデータが得られます。重要なアドバイスの1つは、機器の設定を確立するのに十分なセルを提供し、測定のためにセルを高密度で吊り下げることです。このデータ取得を除けば、従来のフローサイトメトリーと同様に簡単です。まず、原稿に記載されているようにDLBCL細胞株を生成します。次に、10ミリモルのEdU溶液を1対1000の比率でDLBCL細胞培養液に加え、プレートを穏やかに揺動させて混合した後、摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターでプレートを3時間インキュベートします。インキュベーション後にプレートを取り出し、100ミリモルのクロロキン溶液を最終濃度75マイクロモルまで加えます。穏やかに揺り動かして混合し、30分間インキュベートします。次に、20ミリモルのC12 FDG溶液を最終濃度20マイクロモルまで加えます。穏やかに混合した後、前に示したようにプレートを1時間インキュベートします。次に、100ミリモルの2−フェニルエチル−β−d−チオガラクトシド溶液を1〜50で添加し、FSAベータ−gal染色を停止した。そして、プレートをゆっくりと回転させて混ぜます。細胞を15ミリリットルの滅菌遠心チューブに移し、摂氏4度で5分間100倍Gで回転させます。上清が廃棄されたら、細胞を4ミリリットルのPBSで洗浄し、摂氏4度で5分間100倍Gで遠心分離します。次いで、細胞ペレットを4%パラホルムアルデヒド固定溶液中の500マイクロリットルに再懸濁する。室温で10分間インキュベートした後、室温で5分間250倍Gで遠心分離する。上清を捨て、細胞を4ミリリットルのPBSで2回洗浄し、室温で5分間100倍Gで遠心分離します。洗浄後、上清を捨て、細胞ペレットを200マイクロリットルのサポニン透過処理バッファーに再懸濁する。懸濁液を新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、室温で10分間インキュベートします。細胞を250倍Gで室温で5分間ペレット化する。その後、細胞を200マイクロリットルの一次抗体溶液に再懸濁し、暗所で摂氏4度で一晩インキュベートします。チューブを摂氏4度で5分間、250倍Gで遠心分離します。上清を捨て、100マイクロリットルのサポニン洗浄液で洗浄する。細胞を2回洗浄した後、上清を捨て、細胞ペレットを500マイクロリットルのEdU検出カクテルに再懸濁します。室温で暗所で30分間インキュベートし、室温で5分間250倍Gで遠心分離します。上清を捨て、1ミリリットルのサポニン洗浄液で洗浄する。洗浄を2回繰り返し、上清を捨て、細胞ペレットを20〜50マイクロリットルのPBSに再懸濁します。機器の電源を入れる前に、廃液ボトルを空にし、SpeedBeeds、滅菌器、クリーナー、デバブラー、シース液のレベルを確認してください。機器とイメージングソフトウェアの電源を入れた後、起動ボタンをクリックして、流体工学とシステムキャリブレーションを初期化します。倍率を40倍に設定し、流体速度を低に設定します。レーザーのスイッチを入れた後、405ナノメートルのレーザーをオンにしてEdUパシフィックブルーを測定し、488ナノメートルでC12-FDGを測定し、642ナノメートルをオンにしてAlexa-Fluor-647-γ-H2AXを測定します。散乱チャンネルにはチャンネル6、明視野にはチャンネル1、チャンネル9を設定します。次に、最も高い蛍光が予想されるサンプルから始めてレーザーの強度を設定し、サンプルチューブを静かに反転させて混合します。チューブの蓋を開けた後、サンプルチューブをドックに挿入します。[読み込み]をクリックして散布図を開始し、開きます。次に、[機能]領域を選択し、X軸とY軸にそれぞれMO1とアスペクト比の下線MO1を引きます。アスペクト比より上のゲートを 0.5 に設定して、その下と右側のダブレットと細胞凝集体を除外し、左側の SpeedBead 集団を除外します。次に、ヒストグラムプロットを開き、X軸のマスク1とチャンネル1の特徴勾配根平均平方根を選択します。一重項母集団を選択し、フォーカスされたセルを選択するようにゲートを設定します。ヒストグラムプロットを開き、X軸チャンネル2、7、および11の生の最大ピクセル強度を選択します。次に、チャンネル2、7、11のレーザー488ナノメートル、405ナノメートル、642ナノメートルのレーザーパワーを調整して、過飽和を避けるために各蛍光色素の生の最大ピクセル値が100〜4, 000になるようにします。記録する焦点を絞った母集団を選択し、取得をクリックして、一貫した設定でDLBCLサンプルを測定します。測定のためにサンプルを交換するときは、戻るをクリックしてサンプルチューブを回収します。ロードを押してサンプルを破棄します。すべてのサンプルが測定されたら、明視野と散乱レーザーをオフにします。単一のカラーコントロールサンプルを測定して、補正マトリックスを生成します。シャットダウンをクリックして、イメージングシステムを閉じます。画像解析ソフトウェアでデータを解析します。画像解析ソフトウェアのスポットウィザードツールを使用して、核ガンマH2AX病巣と生細胞画像を自動的にカウントおよび定量化します。スポット数が多い細胞と少ない細胞の2つの細胞集団を選択して、スポットウィザードをトレーニングして、さらに自動スポットカウント分析を行います。シングルセル画像におけるフローサイトメトリー法は、C12-FDG陽性、EdU陰性、γH2AX陽性、老化集団およびKARPAS422の増加を示した。WSU-DLCL2 および OCI-LY1 細胞であるが、SU-DHL6 細胞には存在しない。イメージングベースの解析では、ガンマH2AX病巣とKARPAS422、WSU-DLCL2、OCI-LY1の数が有意に多かったが、SU-DHL6細胞では見られなかった。同様の結果は、頻度および定量化データによって表された。細胞懸濁液にサポニンを添加することは極めて重要であり、そうでなければ抗体は細胞内部抗原に到達できず、界面活性剤はC12-FTGシグナルの喪失につながる イメージングサイトメトリーは、特定の刺激に応答して転写因子の核への転座など、マーカー局在の変化を分析するのに最適です。このような分析は、私たちのプロトコルでも達成できます。この方法では、単一細胞レベルで複数の蛍光マーカーを可視化することができ、個々のシグナルの存在、強度、局在を検出するのに役立ちます。

simultaneous-imaging-flow-cytometry-based-detection-multiple

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオは、治療によって誘発される老化がん細胞を二重老化マーカーで定量するためのフローサイトメトリーベースのアッセイを示しています。老化細胞の検出と定量には、β-ガラクトシダーゼ基質の使用が含まれます。基質は老化細胞内の活性リソソームβ-ガラクトシダーゼによって切断され、自己蛍光リポフスチン顆粒と結合して老化癌細胞をマークする蛍光産物を産生します。...

フローサイトメトリーによる治療誘発性老化がん細胞の定量化

このビデオは、腫瘍組織に浸潤するT細胞のさまざまな亜集団を分析するためのin-situ蛍光マルチスペクトルイメージング技術を示しています。腎細胞がん組織凍結切片は、特異的な阻害性受容体を発現し、免疫療法抵抗性の表現型を示すCD8+ T細胞を標識する抗体で処理されます。標識された切片をマルチスペクトル顕微鏡を用いて可視化し、異なるCD8+...

免疫療法耐性T細胞亜集団を解析するためのマルチプレックス免疫蛍光イメージング

老化は防止または腫瘍形成は議論の余地があるかどうかを促進。化学療法薬は老化するがん細胞を誘導することができるので、老化を研究する新しい治療法を提案するために不可欠である。ただし、標準化され広く使用されたβ-ガラクトシダーゼアッセイは、大きな欠点を提示します。我々はここで老化を定量化するための迅速かつ高感度フローサイトメトリーベースのアッセイを提案する。...

老化がん細胞を定量化するための感度の高い方法

二色蛍光顕微鏡用のデュアルカメラ発光分割システムは、優れた光学的および時間的解像度、パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイを含む特定の生細胞アッセイの要件にリアルタイム画像シーケンスを生成する。ソフトウェアは同時に取得放出チャネルからの画像を合成するために使用された場合、疑似色画像シーケンスが生成される。...

同時にデュアルカメラエミッション分割システムを使用して、2つの発光チャンネルにリアルタイム画像のキャプチャ：アプリケーションは、接着性を細胞する

細胞老化は、慢性加齢病理の発症における重要な因子である。老化細胞を標的とする治療薬の同定は、健康な老化を延長する約束を示す。ここでは、単一細胞における老化関連β-ガラクトシダーゼ活性の測定に基づくセノセラピューティクスの同定をスクリーニングするための新規アッセイを提示する。...

セノ治療薬同定のためのSA-β-ガラクトーシダーゼベーススクリーニングアッセイ

マウスの脳や脊髄から取り出した異なる細胞の種類を同時に同定するためのフローサイトメトリー法を提示する。この方法は、神経変性疾患における純粋な細胞集団を単離または特徴付けたり、ウイルスベクターまたはナノ粒子の生体内投与を標的とする細胞の程度を定量化するために利用され得る。...

異なる均質化法を通じてマウス脳/脊髄から取り出された複数の細胞型の同時フロー細胞特性評価

凍結組織に対してマルチスペクトルイメージングを行う迅速な染色法について述べます。...

凍結組織切片の多スペクトル蛍光イメージングの迅速な方法

細胞培養またはマウス腫瘍モデルにおける化学療法薬によって誘導された老化癌細胞の蛍光フローサイトメトリー定量のためのプロトコルが提示されます。オプションの手順には、共免疫染色、大規模なバッチまたは時点分析を容易にするためのサンプル固定、およびフローサイトメトリーソーティングによる生細胞濃縮が含まれます。...

フローサイトメトリーによる老化腫瘍細胞の同定と濃縮のための遠赤色蛍光老化関連β-ガラクトシダーゼプローブ

多重免疫蛍光は、単一の組織切片内で複数の抗体マーカーを逐次標識し、組織構造や細胞集団の空間解析を支援します。ここでは、老化に関連する構造的および免疫マーカーの多重検出のためのワークフローを紹介し、手動および自動スライド準備、反復画像診断、デジタル病理ソフトウェアを用いた単細胞解析を含みます。...

生体内での老化マーカーの空間評価のための多重免疫蛍光アッセイ

神経膠芽腫幹細胞 (GSCs) のグリア分化を促進する小さい分子の同定の効率的なスクリーニングのプロトコルが表示されます。アッセイは、人間の GFAP プロモーターによって強化された GFP (eGFP)...

流れの Cytometry ベースの医薬品スクリーニング システム神経膠芽腫幹細胞の細胞分化を促進する小さい分子の同定に関する研究

学ぶ イメージングフローサイトメトリーを用いて、治療誘発性老化したDLBCL細胞における複数の蛍光老化マーカーを単一細胞レベルで可視化・定量化する方法。この技術は高解像度イメージングと高速解析を組み合わせ、従来の手法では得られない空間情報を提供します。

治療誘発性老化癌細胞における複数の蛍光老化マーカーの同時イメージングおよびフローサイトメトリーベースの検出

さらに動画を探す