Name: 軟骨再生を促進するための層ごとのヤヌスベースナノマトリックスの作製とキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶ層ごとのヤヌスベースナノマトリックス（JBNm）の作製とキャラクタリゼーション。TGF-β1を封入し、軟骨組織再生のための恒常性微小環境を提供する生体材料スカフォールドの標準化手法です。

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この研究は、NIH助成金7R01AR072027および7R03AR069383、NSFキャリアアワード1905785、NSF 2025362、およびコネチカット大学のサポートを受けています。この作業は、NIH助成金S10OD016435によっても部分的にサポートされています。

1. JBNtsの合成
<ol><li>JBNtモノマーを調製するには、既報の方法を利用して、種々の化合物12を合成することを含む。</li>
	<li>精製後の粗JBNtモノマーは、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で精製します。溶媒A:100%水、溶媒B:100%アセトニトリル、および溶媒C:pH=1のHCl水溶液を使用してください。3 mL/分の流量を使用してください。HPLCで得られた最大のピークを7.2分で収集します。</li>
</ol>2. JBNt/Matn1/TGF-β1の作製(動画1)
注: ビデオ1 は、JBNmが生理学的環境(水溶液、紫外線なし、化学添加物なし、加熱なし)で形成された注射可能な固体であり、生物学的にも触発されていることを示しています。
<ol><li>H2 Oに懸濁した1 mg/mL TGF-β1を8 μLからH2O.ピペットに懸濁した1 mg/mLマトリリン-3 32 μLを加えて、これらのタンパク質が適切に混合されるようにします。</li>
	<li>H2Oに懸濁した1 mg/mL JBNtsを80 μL添加し、TGF-β1/マトリリン-3溶液に加えます。適切なブレンドを確実にするために繰り返しピペットします。JBNtsを添加した直後に白い凝集体の存在が観察され、JBNmの形成を示しています(ビデオ1)。</li>
</ol>3. 紫外可視(UV-Vis)吸収による試料の観察
注:UV-Vis吸収スペクトルは、JBNmのアセンブリを特徴付けるために研究されました。この測定値は、JBNts単独、マトリリン-3単独、TGF-β1単独、および3つの部分すべてで構成される完全な層ごとのJBNmの4つのカテゴリーについて分析されました。全ての初期濃度はH2Oに懸濁されている。
<ol><li>JBNtグループの場合、50 μLのH2Oに5 μLの1 mg/mL JBNtsを加えて、90.9 μg/mLの溶液を作ります。</li>
	<li>マトリリン-3群の場合、40 μLの10 μg/mLマトリリン-3を15 μLのH2Oに加え、7.3 μg/mLの溶液を作ります。</li>
	<li>TGF-β1群の場合、10 μLの10 μLのTGF-β1を45 μLのH2Oに加え、1.8 μg/mLの溶液を作ります。</li>
	<li>JBNm群の場合、10 μg/mLのマトリリン-3を10 μL/mL TGF-β1の10 μLに加えます。適切な混合を確実にするために攪拌し、次に5 μLの1 mg/mL JBNtsを溶液に加え、ピペッティングを繰り返してサンプルを混合します。</li>
	<li>分光光度計を用いて、各群の吸収スペクトルを測定する。</li>
</ol>4. 試料のゼータ電位測定
注:ゼータ電位を分析して、JBNmが in vivo 組織とどのように相互作用するかをより適切に予測しました。マトリリン-3単独、TGF-β1を含むマトリリン-3、および全層JBNmの3つのグループが測定されました。
<ol><li>マトリリン-3群の場合、10 mg/mLのマトリリン-3を640 μLのH2Oに加え、800 μLの溶液を作ります。</li>
	<li>マトリリン-3/TGF-β1化合物については、10 μg/mLのマトリリン-3を10 μg/mLのTGF-β1の40 μLに加えます。適切な均質性を確保するために繰り返しピペットします。次に、それを600μLのH2Oに加え、800μLの溶液を得る。</li>
	<li>JBNmグループの場合、10 μg/mLのマトリリン-3を10 μg/mLのTGF-β1の40 μLに追加します。ピペットを複数回使用してタンパク質を混合します。次に、20 μLの1 mg/mL JBNtsを溶液とピペットに加え、均質性を確保します。最後に、JBNm溶液を580 μLのH2Oに加え、800 μLの溶液を生成します。</li>
	<li>3つのグループのゼータ電位値を測定します。</li>
</ol>5. 透過型電子顕微鏡(TEM)のためのJBNt/マトリリン-3ナノマトリックスの作製
注:TEMの特性評価は、JBNtsおよびJBNmの形態を特徴付けるために実行されます。
<ol><li>2つのグリッドをプラズマクリーナーに挿入して、公開されているプロトコルとメーカーのプロトコルに従ってJBNtsとJBNmがネガティブに染色される前にグリッドを適切にクリーニングします12。</li>
	<li>10 μLの1 mg/mL JBNtsと40 μLの蒸留水を混合して、200 μg/mLのJBNt溶液を作成します。</li>
	<li>30 μLの100 μg/mLマトリリン-3と20 μLの100 μg/mL TGF-β1とピペットを数回混合します。マトリリン-3/TGF-β1混合物に10 μLの1 mg/mL JBNtsを加えて、JBNmサンプルを調製します。繰り返しますが、ピペットを繰り返します。</li>
	<li>3 μLのJBNt溶液(200 μg/mL)と3 μLのJBNm溶液を別々のグリッドに加え、2分間放置します。</li>
	<li>各グリッドを100μLの酢酸ウラニル溶液(0.5%)ですすぐ。ろ紙を使用して余分な溶液を取り除き、グリッドを風乾させます。</li>
	<li>透過型電子顕微鏡を操作して、以前に公開されたように、サンプルを適切に観察および特性評価します11,12。</li>
</ol>6. 蛍光標識タンパク質の吸収スペクトル測定
注:JBNmの構造は、吸収スペクトル分析でJBNmの構造を観察することによって検証されます。
<ol><li>TGF-β1は、製造元の指示に従ってタンパク質標識キットを使用して標識します。20 μLの標識TGF-β1を25 μLのH2Oに加え、8.9 μg/mLのテスト溶液を作ります。</li>
	<li>別のラベリングキットを使用してマトリリン-3にラベルを付けます。20 μLの80 μg/mL標識マトリリン-3を25 μLのH2Oに加え、36 μg/mLのテスト溶液を作ります。 注:TGF-β1の蛍光色素標識の最終濃度は20 μg/mLでしたが、マトリリン-3の標識は80 μg/mLの最終濃度でした。</li>
	<li>20 μLの80 μg/mL標識マトリリン-3と20 μLの20 μLの標識TGF-β1および5 μLのH2Oを混合し、標識TGF-β1/マトリリン-3化合物を得る。混合物を数回ピペットで混合する。</li>
	<li>40 μLのH2Oに5 μLの1 mg/mL JBNtsを加えると、111 μg/mLの溶液が得られます。</li>
	<li>20 μLの20 μLの標識TGF-β1を20 μLの80 μg/mLの標識マトリリン-3とピペットを数回加えます。標識したTGF-β1/マトリリン-3溶液に5 μLの1 mg/mL JBNtsを加え、ピペットで繰り返し化合物を適切に混合します。 注:JBNt、標識TGF-β1、および標識マトリリン-3サンプルの最終濃度は、それぞれ111 μg / mL、8.9 μg / mL、および36 μg / mLでした。</li>
	<li>各サンプルグループ(すなわち、標識TGF-β1(ステップ6.1)、標識マトリリン-3(ステップ6.2)、標識TGF-β1/マトリリン-3(ステップ6.3)、JBNts(ステップ6.4)、JBNm(ステップ6.5))を黒色384ウェルプレートの自身のウェルに移します。</li>
	<li>黒色の384ウェルプレートをマルチモードマイクロプレートリーダーにロードし、メーカーのプロトコルに従って488 nmおよび555 nmの励起波長で測定を行います。</li>
</ol>7. インビトロ 生物学的機能アッセイ
<ol><li>プレコートカバーガラスチャンバーでの細胞接着試験<ol><li>各セルタイプに1つのカバーガラスが使用されるため、5つのサンプルグループを含む2つのチャンバーカバーガラスを準備します。</li>
		<li>198.75 μLの蒸留水に1.25 μLの1 mg/mL JBNtsを加えると、6.25 μg/mLの溶液が得られます。</li>
		<li>10 μLの10 μg/mLマトリリン-3を190 μLの蒸留水に加え、0.5 μg/mL溶液にします。</li>
		<li>10 μg/mLのTGF-β1を197.5 μg/mLの蒸留水2.5 μL加えると、0.125 μg/mL溶液が得られます。</li>
		<li>JBNm群の場合、10 μg/mLのマトリリン-3を10 μg/mLTGF-β1の2.5 μLに加え、ピペットを繰り返し加えます。1.25 μLの濃度のJBNtsを混合溶液とピペットに加えます。最後に、186.25 μLの蒸留水を加えて、200 μLのJBNm溶液にします。<ol><li>対照群には、200μLの蒸留水を使用してください。</li>
		</ol></li>
		<li>各サンプルグループをNo.1.5チャンバーカバーガラスの独自のウェルに追加します。カバーガラスを-80°Cの冷凍庫に1時間入れた後、凍結乾燥機で凍結乾燥します。</li>
		<li>ヒト間葉系幹細胞(hMSC)およびヒト軟骨細胞(ウェルあたり10,000細胞)を、準備したチャンバー付きカバーグラスの各ウェルに播種します。</li>
		<li>2つのカバーグラスを37°Cのインキュベーターで4時間インキュベートします。その後、細胞培養培地を吸引し、PBSで2回すすぐ。</li>
		<li>細胞を4%パラホルムアルデヒドで5分間固定した後、サンプルを除去してPBSですすいでください。サンプルをもう一度すすぎ、4%パラホルムアルデヒドを完全に除去します。</li>
		<li>細胞を100 μLの0.1%Triton-Xで10分間インキュベートし、PBSで洗浄します。100 μLの0.165 μMローダミン-ファロイジンを各ウェルに加えます。30分待ってから、もう一度PBSで洗ってください。</li>
		<li>0.1 μg/mL DAPIを各ウェルに加え、核を染色します。5分間待ってから、PBSでウェルを2回すすいでください。</li>
		<li>分光共焦点顕微鏡を使用して細胞の形態を観察し、蛍光画像をキャプチャします。</li>
		<li>また、画像処理ソフトを用いて細胞数や形態を解析する。ソフトウェアを開き、画像をロードします。縮尺記号を追加し、ソフトウェアを調整します。各サンプルの特定の領域内のセルの数をカウントします。次に、測定ツールを使用して、各サンプルの細胞形態に関するデータを収集します。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞増殖<ol><li>3つの未処理の96ウェルプレートを準備し、それぞれに5つのサンプルグループを追加します。<ol><li>JBNtグループの場合、596.25 μLの蒸留水に3.75 μLの1 mg/mL JBNtsを加えると、濃度6.25 μg/mLの600 μLのJBNt溶液が得られます。</li>
			<li>TGF-β1群の場合、592.5 μLの蒸留水に7.5 μLの10 μg/mL TGF-β1を加えると、0.125 μg/mLの試験液が得られます。</li>
			<li>マトリリン-3グループの場合、30 μLの10 μg / mLマトリリン-3を570 μLの蒸留水に加えると、0.5 μg / mLのテスト溶液が得られます。</li>
			<li>JBNm群では、7.5 μLの10 μg/mL TGF-β1と30 μLの10 μg/mLマトリリン-3とピペットを数回混合した後、3.75 μLの1 mg/mL JBNtsを溶液に加えます。</li>
			<li>JBNt、TGF-β1、およびマトリリン-3サンプルの最終濃度をそれぞれ6.25 μg/mL、0.125 μg/mL、および0.5 μg/mLの最終濃度を得るために、JBNm溶液を558.75μLの蒸留水で希釈します。</li>
			<li>対照群には、600μLの蒸留水を使用してください。</li>
		</ol></li>
		<li>各サンプルグループを6つのウェルに分割します(ウェルあたり100 μLサンプル)。</li>
		<li>すべてのサンプルを含む3枚のプレートを-80°Cの冷凍庫に1時間入れた後、凍結乾燥装置で凍結乾燥します。</li>
		<li>これらのプレートにhMSCをシードし、それぞれに5,000個の細胞を含む100 μLの細胞懸濁液(ウェルあたり)を受け取ります。3枚のプレートを37°Cで5%CO2で1日、3日、または5日間インキュベートします。</li>
		<li>細胞を含む各ウェルに10 μLのCCK-8溶液を加え、37°Cでさらに2時間インキュベートします。</li>
		<li>450 nmのマルチモードマイクロプレートリーダーで各ウェルの吸収値を測定します。</li>
		<li>既知の勾配のhMSCを96ウェルプレートに播種し、4時間インキュベートします。CCK-8アッセイを使用して、既知の細胞数の吸収値を測定し、検量線を生成します。</li>
		<li>吸収検量線を用いて細胞増殖を計算します。</li>
	</ol></li>
	<li>安定性試験 注:ヒトTGF-β1標的ELISAキットを使用して、アガロースヒドロゲル中のJBNmからのTGF-β1の放出率を決定しました。<ol><li>20 mLのPBSに400 mgのアガロース粉末を加え、100°Cまで加熱してアガロース粉末を完全に溶解することにより、2%アガロースを調製します。</li>
		<li>冷却した2%アガロースヒドロゲル内にJBNmを準備します。<ol><li>10 μg/mL TGF-β1 10 μL、10 μg/mL マトリリン-3 40 μL、1 mg/mL JBNts5 μL、PBS 195 μLを組み合わせます。この溶液を250 μLの2%アガロースと混合し、JBNmヒドロゲルを作成します。</li>
		</ol></li>
		<li>500 μLのPBSを放出溶液として使用し、必ず3日ごとに交換してください。放出されたすべての溶液を保持し、サンプルを15日間放置します。</li>
		<li>ELISAキットを使用して、製造元の指示に従って、キャプチャされた各リリースソリューションをテストします。 注:理論負荷値100%からPBSに放出されたTGF-β1の量を差し引くことにより、TGF-β1の残りの量を決定することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>PCR26による細胞分化解析。<ol><li>20 μLの細胞懸濁液(4 x 104 細胞)、30 μLの特異的溶液(またはサンプルグループによってはPBS)、および50 μLの2 wt%アガロースを含む7つのサンプルグループを調製します。<ol><li>TGF-β1群の場合、10 μg/mLのTGF-β1を25 μLのPBSに加えると、1.6 μg/mLの溶液が得られます。</li>
			<li>マトリリン-3群の場合、20 μLの10 μg/mLマトリリン-3を10 μLのPBSに加えると、6.7 μg/mLの溶液が得られます。</li>
			<li>JBNtグループの場合、27.5 μLのPBSに2.5 μLの1 mg/mL JBNtsを加えると、83.3 μg/mLの溶液が得られます。</li>
			<li>J/T/M JBNm群の場合、10 μLの10 μLのマトリリン-3を10 μL/mLのTGF-β1の5 μLに加え、ピペットで上下に混合します。その後、2.5 μLの1 mg/mL JBNtsを加え、再度ピペットでピペットします。最後に、2.5 μLのPBSで希釈します。</li>
			<li>各対照群について、サンプルとして30 μLのPBSを使用します。</li>
		</ol></li>
		<li>0.5 mLの細胞培養培地を各ウェルに加え、3日ごとに交換してください。<ol><li>陽性対照群については、TGF-β1を添加した市販のhMSC軟骨形成培地を使用する。この追加のTGF-β1は、TGF-β1およびJ/T/M JBNmグループの両方の量に等しい。</li>
			<li>陰性対照群の1つには、TGF-β1を含まない市販のhMSC軟骨原性培地を使用してください。他の陰性対照群には、10%ウシ胎児血清(FBS)を含むDMEM細胞培養培地を使用してください。</li>
			<li>他のすべてのグループについては、TGF-β1を含まない市販のhMSC軟骨形成細胞培養培地を使用してください。</li>
		</ol></li>
		<li>サンプルを15日間培養します。</li>
		<li>サンプルのRNAを抽出し、PCRを実行して、前述のようにサンプルの分化を研究します26。</li>
	</ol></li>
	<li>X型コラーゲン発現アッセイのための免疫染色<ol><li>PCR法による細胞分化と同様の方法でアガロース系サンプル7種を調製する(ステップ7.4)。</li>
		<li>サンプルを15日間培養します。</li>
		<li>サンプルを4%ホルムアルデヒドで1日間固定し、30%ショ糖溶液に一晩浸した後、液体窒素で-80°Cで一晩凍結します。水溶性グリコールと樹脂のブレンドである最適な切断温度の化合物試薬(OCT)を使用して、-10°Cでサンプルを固定します。</li>
		<li>クライオスタットミクロトームを操作して、各サンプルの厚さ20 μmの凍結切片を取得します。</li>
		<li>メーカーのプロトコルに従って、1:800希釈の抗コラーゲンX抗体とPBSで希釈した蛍光標識二次抗体で各セクションを染色します。</li>
		<li>接眼レンズ上で488 nmの励起と40倍の倍率を使用して、共焦点顕微鏡で各切片を観察します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Yupeng Chen博士は、Eascra Biotech, Inc.とNanoDe Therapeutics, Inc.の共同創設者です。

この研究の目標は、細胞分化を媒介するために細胞培養環境に依存する従来の組織構築物の限界を克服するために、生体模倣足場プラットフォームであるJBNmを開発することです。JBNmは、自立可能な軟骨組織構築のための層ごとの構造足場です。革新的なデザインは、DNAに触発された新しいナノ材料であるJBNtsに基づいています。JBNts30、TGF-β1、マトリリン-3からなるJBNmは、足場の自己組織化を分子レベルで制御する新しい層ごとの技術によって組み立てられます。JBNmのアセンブリを観察し、ゼータ電位測定、UV-Vis吸収、TEM、および蛍光スペクトル分析で特徴付けました。
図2B(ステップ3)のUV-Visスペクトルは、JBNmの階層的な層ごとの内部の形成を実証しています。結合親和性の違いにより、吸光度ピークの違いが観察されます。JBNtsとマトリリン-3の間では、JBNtsとTGF-β1の間よりも大きな相互作用が起こり、JBNtsが線維形態とリジン表面化学の点でコラーゲンタン...

組織工学における足場は、細胞の付着とその後の組織発生の構造的サポートを提供する上で重要な役割を果たします1。典型的には、足場のない従来の組織構築物は、細胞培養環境に依存し、細胞分化を媒介するために成長因子を添加した。さらに、足場への生理活性分子のこの添加は、細胞の分化と機能を導く上でしばしば好ましいアプローチです2,3。いくつかの足場は、天然組織の生化学的微小環境を独立して模倣することができますが、他の足場は成長因子を介して細胞機能に直接影響を与えることができます。しかし、研究者は、細胞の接着、成長、分化にプラスの影響を与える可能性のある足場を選択する際に、長期間にわたって最適な構造サポートと安定性を提供するという課題に直面することがよくあります4,5。生理活性分子は足場に緩く結合していることが多く、移植時にこれらのタンパク質が急速に放出され、望ましくない場所に放出されます。これは、意図的に標的とされなかった組織または細胞への副作用で最高潮に達します6,7。
足場は通常、高分子材料でできています。ヤヌスベースナノマトリックス(JBNm)は、自立可能な軟骨組織構築物のための新しい層ごとの方法で作成された生体模倣足場プラットフォームです8。これらの新しいDNAに触発されたナノチューブは、細胞外マトリックス(ECM)に見られるコラーゲンの構造と表面化学を適切に模倣しているため、ヤヌスベースナノチューブ(JBNts)と呼ばれています。マトリリン-3やトランスフォーミング成長因子β-1(TGF-β1)などの生理活性分子を添加することで、JBNmは最適な微小環境を作り出すことができ、それが所望の細胞および組織の機能を刺激することができる9。
JBNtsは、核酸塩基アデニンとチミンの合成バージョンに由来する新しいナノチューブです。JBNtsは自己組織化10によって形成されます。6つの合成核酸塩基が結合して環を形成し、これらの環はπ-πスタッキング相互作用を受けて、長さ200〜300μmのナノチューブを形成します11。これらのナノチューブは、コラーゲンタンパク質と構造的に類似しています。JBNtsは、天然の軟骨微小環境の側面を模倣することにより、軟骨細胞およびヒト間葉系幹細胞(hMSC)に好ましい付着部位を提供することが示されています11,12,13,14。ナノチューブは自己組織化され、いかなる種類のイニシエーター(UV光など)も必要としないため、到達困難な欠陥領域の注射可能な足場として刺激的な可能性を示します15。
マトリリン-3は、軟骨に見られる構造的な細胞外マトリックスタンパク質です。このタンパク質は、軟骨形成および適切な軟骨機能において重要な役割を果たしている16,17。最近、それは生体材料足場に含まれており、肥大を伴わない軟骨形成を促進する9、18、19。このタンパク質をJBNmに含めることにより、軟骨細胞は、その天然の微小環境と同様の成分を含む足場に引き付けられます。さらに、マトリリン-3は、軟骨細胞20内の適切なTGF-β1シグナル伝達に必要であることが示されています。成長因子はシグナル伝達分子として機能し、特定の細胞または組織の特異的成長を引き起こします。したがって、最適な軟骨再生を達成するためには、マトリリン-3とTGF-β1がJBNm内の必須成分です。TGF−β1を層ごとの足場に添加すると、組織構築物における軟骨再生をさらに促進することができる。TGF-β1は、骨軟骨欠損の治癒過程を促進するために使用される成長因子であり、軟骨細胞およびhMSCの増殖および分化を促進する21,22。したがって、TGF-β1は軟骨再生JBNm(J/T/M JBNm)23において重要な役割を果たし、特にJBNm層内に局在している場合に適切な増殖を促進します。
前述のように、成長因子は通常、足場の外側に組み立てられ、特定の取り込み方法はありません。ここでは、生体材料の正確に設計されたナノアーキテクチャにより、JBNmは目的の細胞や組織を特異的に標的とするために開発されました。JBNmは、内層のJBNt表面に付着したTGF-β1と、外層のJBNt表面に付着したマトリリン-3とから構成される24,25。層ごとの構造の内層にTGF-β1を組み込むことで、JBNm繊維に沿って高度に局在化した微小環境が可能になり、タンパク質12の放出がはるかに遅い恒常性組織構築物が作成されます。JBNmの注射性は、将来のさまざまな生体材料用途に理想的な軟骨組織構築物になります26。

<table><tbody><tr><td>10 % Normal Goat Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>50062Z</td><td>Agent は、染色中の非特異的抗体結合作用をブロックするために使用されます。</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>07-200-740</td><td>比較細胞培養に使用する24ウェルプレートです。</td></tr><tr><td>384ウェルブラック未処理プレート</td><td>サーモフィッシャー</td><td>262260</td><td>吸収測定に使用される384ウェルプレート。</td></tr><tr><td>8ウェルチャンバーカバーグラス</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー155409PK</td><td>比較細胞培養に使用される8ウェルカバーガラス。</td></tr><tr><td>96ウェル平底</td><td>Corning</td><td>07-200-91</td><td>比較細胞培養に使用される96ウェルプレート。</td></tr><tr><td>96ウェルプレート未処理</td><td>サーモフィッシャー</td><td>260895</td><td>96ウェルプレートは、比較細胞培養および分析に使用されます。</td></tr><tr><td>アガロースゲル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>細胞培養に使用されるハイドロゲル。</td></tr><tr><td>アガロースゲル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td>細胞培養の環境として使用されるハイドロゲル。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor マイクロスケールタンパク質ラベリングキット</td><td>Thermo Fisher</td><td>A30006 (488) および A30007 (555)</td><td>タンパク質の標識に使用される蛍光色素。</td></tr><tr><td>抗コラーゲンX抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>41-9771-82</td><td>コラーゲンXの染色に用いる抗体です。</td></tr><tr><td>バイオ・ラッド PCR マシン</td><td>サンプルの PCR を実行するために使用される</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td>の装置。</tr><tr><td>C28/I2軟骨細胞株細胞は</td><td></td><td></td><td>、さまざまなサンプルの増殖能力を分析するために使用されます。</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit 8</td><td>Milipore Sigma</td><td>96992</td><td>細胞増殖アッセイ。</td></tr><tr><td>Cell Profiler</td><td>Broad Institute</td><td></td>は<td>、細胞画像の解析に使用するソフトウェアです。</td></tr><tr><td>クライオスタットミクロトーム</td><td></td><td></td><td>装置は、染色や顕微鏡検査に使用するサンプルの薄いセグメントを作成するために使用されます。</td></tr><tr><td>DAPI</td>:<td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>アデニン-チミンDNA領域に結合する青色蛍光染色剤。</td></tr><tr><td>使い捨てキュベット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-955-128</td><td>分光光度法に使用される容器。</td></tr><tr><td>DMEM細胞培養培地</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10566032</td><td>培地は、細胞増殖をサポートするために使用されます。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>GIBCO</td><td>A4766801</td><td>細胞増殖をサポートするために細胞培養培地に使用される血清です。</td></tr><tr><td>Fluoromount-G 埋込媒体</td><td>サーモフィッシャー</td><td>00-4958-02</td><td>免疫染色用スライドの埋込に使用する溶液です。</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td></td><td></td><td>化合物は、マイクロトーミングの前にサンプルを固定するために使用されます。</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG (H+L) 高交差吸着二次抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>A16110</td><td>タンパク質染色に用いる抗体です。</td></tr><tr><td>ヒト間葉系幹細胞</td><td>LONZA</td><td>PT-2501</td><td>細胞は、さまざまなサンプルの差別化能力を分析するために使用されます。</td></tr><tr><td>人間の間葉系幹の軟骨原性媒体</td><td>LONZA</td><td>PT-3003</td><td>軟骨形成の分化を促進するために使用される細胞媒体。</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td> 顕微鏡<td>と組み合わせて使用する画像解析ソフトウェア。</td></tr><tr><td>itaq Universal SYBR Green One-Step Kit</td><td>BioRad</td><td>1725150</td><td>PCRに使用するキットです。</td></tr><tr><td>ヤヌスベースナノチューブ(JBNts)</td><td></td><td></td><td>合成核酸塩基から作られたナノチューブで、細胞の足場ツールとして機能します。</td></tr><tr><td>LaB6 20-120 kV 透過型電子顕微鏡</td><td>Tecnai</td><td></td><td>試料に対して透過型電子顕微鏡を行うために使用される機器です。</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td> モデリング<td>とデータ解析に使用される統計ソフトウェア。</td></tr><tr><td>Matrilin-3</td><td>Fisher Scientific</td><td>3017MN050</td><td>軟骨細胞の接着部位として使用される構造タンパク質。</td></tr><tr><td>NanoDrop分光光度計</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>装置 サンプルの吸収値を測定するために使用されます。</td></tr><tr><td>ニコンA1Rスペクトル共焦点顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>A1R HD25</td><td>共焦点顕微鏡は、サンプルの分析に使用されます。</td></tr><tr><td>ナンバー1.5 チャンバーカバーグラス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>152250</td><td>無菌細胞培養とイメージングのための環境。</td></tr><tr><td>最適な切断温度 コンパウンド</td><td></td><td></td>試薬 <td>マイクロトーミング前に細胞を埋め込むために使用されるコンパウンド。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td>細胞を固定するために使用される化合物。</td></tr><tr><td>PDC-32G プラズマクリーナー</td><td>ハリックプラズマ</td><td></td><td>クリーナーは、透過型電子顕微鏡の前にグリッドを準備するために使用されます。</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>GIBCO</td><td>15-140-148</td>細胞<td>培養中の細菌増殖を阻止するために使用される抗生物質。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td>溶液は、細胞培地を洗浄し、実験中に緩衝液として作用するために使用されます。</td></tr><tr><td>Rhodamine-phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td>F-Actin赤色蛍光色素。</td></tr><tr><td>Rneasy Plant Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74904</td><td>RNA抽出中にサンプルをろ過し、均質化するために使用されるキットです。</td></tr><tr><td>ショ糖液</td><td></td><td></td><td>マイクロトーミング前のサンプル処理に使用される溶液。</td></tr><tr><td>TGF β-1 ヒト ELISA キット</td><td>Invitrogen</td><td>BMS249-4</td><td>TGF-&β の存在を決定するために使用されるアッセイキット。サンプルに 1 です。</td></tr><tr><td>TGF-&ベータ;1</td><td>PEPROTECH</td><td>100-21C</td><td>軟骨形成の分化と増殖の刺激に使用される成長因子。</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Invitrogen</td><td>HFH10</td><td>コンパウンドは、染色プロセス中に固定されていない細胞を溶解するために使用されます。</td></tr><tr><td>トリゾール試薬</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15596026</td><td>RNAを単離するために使用される試薬です。</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>装置は、サンプルのゼータ電位値を測定するために使用されます。</td></tr></tbody></table>

軟骨再生を促進するための層ごとのヤヌスベースナノマトリックスの作製とキャラクタリゼーション

Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration

in vitroおよびin vivo使用のための特定の機能を促進することを期待して、細胞の接着および増殖を導くために様々な生体材料足場が開発されている。これらの生体材料足場への成長因子の添加は、一般に、最適な細胞培養環境を提供し、細胞分化およびその後の機能を媒介するために行われる。ただし、従来の生体材料足場の成長因子は、通常、移植時に放出されるように設計されており、周囲の組織や細胞に意図しない副作用をもたらす可能性があります。ここでは、DNAに触発されたヤヌスベースナノマトリックス(JBNm)が、自立可能な軟骨組織構築のための層ごとの構造を持つ高度に局在化した微小環境を実現することに成功しました。JBNmsは、ヤヌスベースナノチューブ(JBNts)、マトリリン-3、およびトランスフォーミング成長因子β-1(TGF-β1)から生体親和性を介して自己組織化されます。JBNmは、TGF-β1:マトリリン-3:JBNt比1:4:10で組み立てられましたが、これは、層ごとの構造への適切な組み立てが起こり得る決定された比率です。まず、マトリリン-3溶液にTGF-β1溶液を添加した。次に、この混合物を数回ピペットで移動して、JBNt溶液を添加する前に十分な均質性を確保しました。これにより、再び数回ピペッティングした後、層ごとのJBNmが形成されました。JBNm構造、JBNts単独、マトリリン-3単独、TGF-β1単独を層ごとに特徴付けるために、様々な実験を行った。JBNmの形成を紫外可視吸収スペクトルで調べ、透過型電子顕微鏡(TEM)でJBNmの構造を観察した。革新的な層ごとのJBNm足場が分子スケールで形成されるため、蛍光色素標識JBNmを観察することができました。TGF-β1は注射可能なJBNmの内層内に閉じ込められており、周囲への成長因子の放出を防ぎ、局所的な軟骨形成を促進し、抗肥厚微小環境を促進することができます。

プロトコルに従って、JBNtsの合成に成功し、UV-Vis吸収とTEMで特徴付けられました。JBNmは、迅速な生体模倣プロセスを経る注射可能な固体足場です。生理的環境でTGF-β1/マトリリン-3溶液の混合物にJBNtsを添加した後、 図1に示すように、JBNmの組み立てが成功したことを示す固体の白いメッシュの足場が形成されました。これは、特性評価方法で実証されました。
生理学的条件下では、マトリリン-3はその等電点27 のために負に帯電します(図2A)。TGF-β1溶液をマトリリン-3溶液に添加した後、TGF-β1/マトリリン-3化合物のゼータ電位は中性に近い値に増加し、2つのタンパク質が電荷相互作用 を介して 結合していることを示しています。 図2Aに見られるように、JBNmのゼータ電位は、リジン側鎖の等電点が生理的環境で約9.74であ...

このプロトコルは、ヤヌスベースナノチューブ(JBNts)、マトリリン-3、およびトランスフォーミング成長因子ベータ-1(TGF-β1)を順次追加することにより、層ごとのヤヌスベースナノマトリックス(JBNm)足場の組み立てを記述します。JBNmは製造され、特徴付けられました。さらに、優れた生理活性を示し、接着、増殖、分化などの細胞機能を促進しました。

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo ...

このプロトコルは、分子レベルでJBNmを層ごとに組み立てて特徴付けた方法を示しています。JBNmはTGF-B1をカプセル化し、周囲組織への放出を防ぎ、局所的な軟骨形成を促進します。JBNmの形成は標準化されており、将来のアプリケーションのために異なるJBNmを形成することができます。独自の層ごとの構造により、成長因子のカプセル化が可能になり、安定した局所放出が作成され、肥大を回避し、成長を維持します。JBNmは、不規則な形状の骨折や空洞などのさまざまなシナリオに使用できる注射能力により、限られた場所で軟骨組織再生のための恒常性微小環境を提供します。はじめに、水に懸濁した1ミリリットルあたり1ミリグラムのTGF-B1を8マイクロリットル、水に懸濁した1ミリリットルあたり1ミリグラムのマトリリン-3を32マイクロリットル加えます。これらのタンパク質の適切な混合を確実にするためのピペット。ミリリットルあたり1ミリグラムの80マイクロリットルを追加します。ヤヌスベースナノチューブ、または水中に懸濁したJBNtsをTGF-B1、マトリリン-3溶液に。適切なブレンドを確実にするために繰り返しピペットします。JBNtグループの場合、50マイクロリットルの水に1ミリリットルあたり1ミリグラムの5マイクロリットル、JBNtsを加えて、1ミリリットルあたり90.9マイクログラムの溶液を作ります。マトリリン-3グループの場合、1ミリリットルあたり10マイクログラムの40マイクロリットルのマトリリン-3を15マイクロリットルの水に加えて、1ミリリットルあたり7.3マイクログラムの溶液を作ります。TGF-B1グループの場合、1ミリリットルあたり10マイクログラムのTGF-B1を45マイクロリットルの水に10マイクロリットル加えて、1ミリリットルあたり1.8マイクログラムの溶液を作ります。ヤヌスベースナノマトリックスまたはJBNmグループの場合、ミリリットルあたり10マイクログラムの40マイクロリットル、ミリリットルあたり10マイクログラムのマトリリン-3を10マイクロリットルTGF-B1に追加します。適切な混合を確実にするために攪拌します。次に、1ミリリットル当たり1ミリグラムのJBNtsを5マイクロリットル溶液に加え、ピペッティングを繰り返してサンプルを混合する。分光光度計を用いて、各群の吸収スペクトルを測定する。TGF-B1は、製造元の指示に従って、タンパク質標識キットを使用して標識します。TGF-B1とラベル付けされた20マイクログラム/ミリリットルを25マイクロリットルの水に加え、1ミリリットルあたり8.9マイクログラムのテスト溶液を作ります。別のラベリングキットを使用して、マトリリン-3にラベルを付けます。20マイクロリットルの80マイクログラム/ミリリットルの標識マトリリン-3を25マイクロリットルの水に加え、1ミリリットルあたり36マイクログラムの試験溶液を作ります。20マイクロリットルの標識マトリリン-3を1ミリリットル当たり20マイクログラムの標識TGF-B1と20マイクロリットルの1ミリリットル当たりの20マイクログラム、および5マイクロリットルの水と混合し、標識TGF-B1、マトリリン-3化合物を得る。混合物を数回ピペットで混合する。1ミリリットルあたり5マイクロリットルのJBNtsを40マイクロリットルの水に加えると、1ミリリットルあたり111マイクログラムの溶液になります。次に、標識したTGF-B1、マトリリン-3溶液に1ミリグラム/ミリグラムのJBNtsを5マイクロリットル加え、ピペットで繰り返し化合物を混合します。各サンプル群を黒色の384ウェルプレートのウェルに移します。プレートをマルチモードマイクロプレートリーダーにロードし、メーカーのプロトコルに従って488ナノメートルと555ナノメートルの励起波長で測定を行います。生理学的条件下では、マトリリン-3のゼータ電位スペクトルは、その等電点のために負に帯電した。TGF-B1をマトリリン-3に添加した後、TGF-B1マトリリン-3化合物のゼータ電位は中性に近い値まで増加した。JBNmのゼータ電位は3群の中で最も高かった。紫外可視吸収スペクトルは、JBNmの層内部構造、リジン側鎖の芳香環、およびJBNtsがそれぞれ220ナノメートルおよび280ナノメートルの吸収ピークに寄与することにより、階層層の形成を確認した。TEMは、JBNtsおよびJBNmの形態を特徴付けるために使用された。タンパク質と結合した後、JBNmの厚い束が足場構造を形成するのが観察された。蛍光顕微鏡は層構造ごとに層の存在を確認し、JBNmの断面を示した。赤色蛍光マトリリン-3を標識した後、JBNtバンドルを包み込み、JBNmの外層を形成し、一方、緑色蛍光TGF-B1は内層を形成した。蛍光共鳴エネルギー移動は、標識されたTGF-B1群で520ナノメートル、マトリリン-3群で570ナノメートルに発光ピークを示した。HMSCの接着と細胞増殖に対するJBNmの効果を調べました。JBNmは、HMSCがそれ自体と一緒にクラスター化していることを示しましたが、JBNtsに接着する細胞は少なかった。JBNm上の細胞の整列と細胞の大きさは、JBNtsが細胞接着に関与し、タンパク質が細胞接着の親和性を高めることを示しました。細胞培養1日目後、JBNm群およびTGF-B1群は他の群と比較して有意な細胞増殖を示した。細胞構造の持続時間を3日および5日に延長すると、JBNmおよびTGF-B1グループはさらに細胞増殖の増加を示しました。JBNmを蛍光標識する場合、JBNtsを添加する前にTGF-B1とマトリリン-3を個別に標識して混合し、層ごとの構造を適切に形成することが重要です。足場のさらなる評価は、それらが治療的治療においてどのように有効であるかの理解を提供することができる。より具体的には、ハイスループット増殖アッセイにより、インビトロで、および後にインビボで最適な投与量を決定することができる。この新しいNanoMatriXの作成により、研究者はナノ材料ベースの注射可能な足場を利用して軟骨を再生することができます。このポリ模倣アプローチは、アンドロジェネシスおよびカウンターサイト増殖の増強を可能にする。

fabrication-characterization-layer-layer-janus-base-nano-matrix-to

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Bioengineering

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軟骨再生を促進するための層ごとのヤヌスベースナノマトリックスの作製とキャラクタリゼーション

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