CUBICによる全腎三次元染色
2022年7月18日
本プロトコルは、3次元(3D)腎臓イメージングのための組織透明化法およびホールマウント免疫蛍光染色を記載する。この技術は、腎臓病理学における巨視的な視点を提供し、新しい生物学的発見につながる可能性があります。
このプロトコルは、完全な腎臓の3次元構造の視覚化を可能にし、巨視的な視点を提供することにより、腎臓研究における革新的な発見につながる可能性があります。ホールマウント臓器染色は、抗体の浸透が難しいため困難です。このプロトコルは、抗体による腎臓の高品質でホールマウント染色を実証しています。
まず、灌流固定と腎臓サンプリングの直後に、腎臓を4%パラホルムアルデヒドに摂氏4度で16時間浸漬して浸漬固定を行います。PBSを使用してそれぞれ2時間3回洗浄します。固定した腎臓を7ミリの50%CUBIC-Lに14ミリリットルの丸底チューブに浸し、室温で穏やかに振とうして脱色および脱脂プロセスを実行します。
6時間後、14ミリメートルの丸底チューブに入った7ミリリットルのCUBIC-Lに腎臓を浸し、摂氏37度で5日間穏やかに振とうします。キュービック-Lを毎日リフレッシュしてください。脱色と脱脂が完了したら、サンプル処理にディスペンシングスプーンを使用し、腎臓をPBSで室温で2時間3回洗浄します。
脱脂した腎臓を染色バッファー溶液で希釈した一次抗体で免疫染色し、摂氏37度のインキュベーターシェーカーで7日間穏やかに振とうします。次に、PBSTとしても知られるPBS中の0.5%Triton X-100で腎臓を室温で1日間洗浄します。二次抗体染色の場合は、腎臓を染色バッファー中の二次抗体で、暗所で、摂氏37度で7日間穏やかに振とうして処理します。
PBST洗浄で室温で1日染色を修正します。固定後、腎臓をPB中の1%ホルムアルデヒドに3時間浸し、PBSで室温で6時間洗浄します。14ミリリットルの丸底チューブに7ミリリットルの50%CUBIC-R+に腎臓を1日振とうした後、7ミリリットルのCUBIC-R+で室温で2日間振とうして治療し、屈折率マッチングを行います。
免疫染色法の助けを借りて、腎臓全体の交感神経と動脈を3D腎臓イメージングで視覚化しました。また,虚血再灌流障害後の腎交感神経異常を可視化した。このプロトコルはまた、脾臓全体の交感神経の視覚化を容易にしました。
3次元免疫蛍光染色のためのデータ定量処理をここに表示した。さらに、集合管、近位尿細管のS1セグメント、および糸球体は、腎臓全体で首尾よく視覚化されました。糖尿病性腎疾患の初期段階での薬物投与に起因する糸球体腫大の抑制も、3Dイメージングで視覚化されました。
このプロトコルは、腎臓全体の特定の分子を標識することができます。したがって、研究者は血管系の構造変化を分析したり、腎臓組織のまれなイベントを見つけることができます。
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概要
本プロトコルでは、腎臓全体の三次元構造の可視化が可能となり、腎臓研究における革新的な発見につながるマクロ的な視点を提供します。この手法には、イメージング品質を向上させるための組織透明化およびホールマウント免疫蛍光染色が含まれています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- 病理学
背景
- 抗体の浸透が困難であるため、器官全体のホールマウント染色は困難を伴います。
- 正確な3Dイメージングには、高品質な染色が不可欠です。
- 本プロトコルでは、腎臓のイメージングにおける一般的な課題に対処します。
- マクロ的な視点は、新たな生物学的知見につながる可能性があります。
研究目的
- 信頼性の高い腎臓の3Dイメージング手法を開発すること。
- 腎臓構造の可視化を向上させること。
- 腎病理学における革新的な発見を促進すること。
使用方法
- 4% パラホルムアルデヒド中での4°C、16時間の浸漬固定。
- PBSによる洗浄を、各2時間、計3回行う。
- 50% CUBIC-Lを用いた脱色および脱脂。
- 脱脂プロセス中、室温で緩やかに振盪させる。
主な結果
- 腎臓の高品質なホールマウント染色の実演。
- 抗体浸透性の向上を達成。
- 腎臓構造の明確な3D可視化を実現。
- 腎病理学のより深い理解のためのマクロ的視点を提供。
結論
- このプロトコルにより、腎臓のイメージング技術が効果的に向上します。
- これにより、腎臓研究における新たな発見への道が開かれます。
- 今後の研究において、さらなる知見を得るために本手法を応用することが可能です。
よくある質問
産業界における重要性
CUBICを用いた腎臓全体の三次元染色により、従来の病理学的検査の限界を克服し、腎臓の微細構造を包括的に可視化することが可能になります。この手法は、血管、尿細管、糸球体、および交感神経の高解像度マッピングを可能にし、腎疾患研究における早期発見やメカニズム解明によるリスク低減のための重要な知見を提供します。本手法は、前臨床ポートフォリオの進展における重要な転換点において、予測の信頼性を高めます。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 単一細胞解像度での腎臓の組織構造および細胞ネットワークの解析を可能にします。
- 損傷または介入後の構造的変化を可視化することで、生物学的なリスク低減をサポートします。
- 交感神経および糸球体の包括的なマッピングを通じて、機能的ターゲットの検証を促進します。
- 腎疾患ターゲットの優先順位付けにおける予測的信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームのイメージングおよび定量化ワークフローに向けて、検証済みの3D生物学的システムを調製します。
- 全臓器染色の標準化により、研究全体で再現性のある定量的なアウトプットを実現します。
- 腎臓組織における稀なイベントや構造的変化のスケール可能なイメージングを可能にします。
- 腎臓の微細解剖学的構造に対する化合物の影響の信頼性の高い評価をサポートします。
翻訳・前臨床研究
- 糸球体肥大などの疾患関連バイオマーカーと3Dイメージング出力を整合させます。
- 介入効果を可視化することで、創薬から前臨床検証までの一貫性を提供します。
- 包括的な組織分析に基づき、リスクを調整した進展決定を可能にします。
- トランスレーショナル腎臓研究プログラムにおいて、予測的なリスク軽減を実現します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この腎臓全体の3D染色プロトコルは、基盤研究から前臨床研究への一連の流れに統合されており、腎臓研究における仮説検証、ターゲットのバリデーション、およびトランスレーショナルなバイオマーカーの整合性確認を支援します。
- 探索生物学：腎臓の構造および傷害応答をマッピングすることで、仮説検証とパスウェイの解明を促進します。
- スクリーニング：実験条件の定量的な比較が可能な、アッセイにそのまま利用できる再現性の高い3Dイメージング出力を提供します。
- 分析：構造的変化の測定と定量化を可能にし、堅牢な統計分析をサポートします。
- トランスレーショナルリサーチ：イメージングによる知見を疾患モデルおよび早期バイオマーカーの同定へと結びつけます。
- エンタープライズでの再利用：腎臓および関連組織研究における全臓器イメージングのための、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 腎臓ターゲットのバリデーションにおける予測信頼性を向上させ、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用上の価値： 標準化され、拡張可能で、再現性のある3Dイメージングワークフローを提供します。
- 戦略的価値： 包括的な組織解析を可能にすることで、Go/No-go判断を改善し、資本効率を高めます。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整後の優先順位付けと、腎疾患プログラムの推進を支援します。
実施上の考慮事項
- 組織透明化、免疫染色、および3D画像解析の専門知識が必要です。
- 高度な画像解析装置および計算解析ツールへのアクセスが必要です。
- 再現性とデータの比較可能性を確保するため、チーム間での標準化が求められます。
- 異なる器官系や抗体パネルに合わせて調整が必要な場合があります。
- 全器官イメージングにおいては、抗体の浸透性と染色時間が実用上の制限となります。
