Name: 三次元細胞培養基材のUVフォトパターニングによるマルチキュー細胞微小環境の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶ UVフォトパターニングによる三次元細胞培養基材の作製法。PDMSを用いて複数の微小環境キューを組み合わせ、細胞の接着と形態応答を系統的に解析する手法を解説。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は、ヒト初代角化細胞を提供してくれたネロ・フォルミサーノ博士(MERLN技術に触発された再生医療研究所)に感謝する。この研究は、Chemelot InSciTe(プロジェクトBM3.02)によってサポートされています。欧州研究評議会(助成金851960);重力プログラムのための文部科学省024.003.013「材料駆動再生」。著者は、Alvéoleの対応、ヘルプ、トラブルシューティングに感謝します。

著者らは、開示すべき利益相反はありません。

今日、細胞挙動は、天然の細胞微小環境の複雑さを欠いている平坦な培養基質上でしばしば研究される。足場やヒドロゲルなどの3D環境が代替として使用されます。これらの細胞培養環境はin vivoでの関連性を向上させるが、細胞挙動の体系的な研究と読み出し方法の実現可能性の両方は依然として課題である。代表的な培養基質上の細胞挙動を体系的に調査するには、顕微鏡的な読み出しを可能にする一貫したマルチキュー基質が必要です。したがって、このプロトコルでは、生理学的に関連する形状およびパターン化されたECMタンパク質を有するマルチキュー細胞培養基質を作成する方法を記載する。in vitroプラットフォーム上で組織形状や接触誘導キューなどの環境キューを組み合わせる際の主な課題は、主に技術的な性質のものです。接触誘導手がかり(例えば、ソフトリソグラフィー、深紫外パターニング、およびマイクロコンタクトプリンティング35,36)を細胞培養材料に適用する従来の方法は、平面基板用に最適化されてきた。接触ガイダンスの手がかりと組み合わせた3D細胞培養材料の必要性は、パターンアライメントの貧弱さ、解像度、柔軟性など、いくつかの技術的課題を強調しました。これらの課題を克服するために、高スループット、マスクレス、光ベースのパターニング方法を使用することができる45,49。ここで、光学顕微鏡は、正確なパターンアライメントとマイクロメートルオーダーの分解能を可能にします(図6参照)。さらに、デジタルマスクを使用することで、研究者は労働集約的な物理マスクを製造することなく、幅広いパターンで細胞の挙動を研究することができます。
UVフォトパターニングアプローチは、様々な材料48から生成される様々な3D形状(例えば、シリンダー、サドル、ドーム、ピット)と組み合わせて使用することができる。この研究で使用した3D細胞培養基質はPDMSから作られています。ただし、他の材料も使用できます。これは、目的の特徴を含む最終的な細胞培養基材を製造するために異なるステップを必要とするかもしれない。細胞は細胞培養材料の表面粗さに敏感であることが示されているので、観察された細胞の応答が3D幾何学的および接触誘導手がかりに完全に起因するように、滑らかな表面を有する細胞培養チップを作成することが重要です50,51。表面粗さの測定には、光学プロフィロメトリー、走査型電子顕微鏡、原子間力顕微鏡などの測定方法を使用できます。細胞培養材料の作製後、関心のある特徴の特定の寸法に依存する1つまたは複数の焦点面に基づくパターニング方法を選択することができる(図3参照)。通常、単一焦点面を使用して、約50μmのZ範囲内の領域をパターン化します。この経験則を使用して、パターン解決に一貫性があることが示されました(図6参照)。しかし、この方法の欠点は、複数の焦点面とパターンの導入によりパターニング時間が長くなることです。私たちの手では、複数の焦点面を使用して、最大16 mm x 16 mm x 0.17 mm(X x Y x Z)の3D幾何学的特徴が、高いパターン品質で正常にパターン化されています。
さらに、このプロトコルと組み合わせて使用できる幾何学的特徴の高さ(Z軸)には限界があることに言及することが重要です。UVフォトパターニングと多くのセルラー読み出しの両方が顕微鏡セットアップに依存しているため、対物レンズの作動距離によってフィーチャの最大高さが決まります。私たちの手の中では、高さ300μmを超える形状は依然としてUVフォトパターン化することができ、40倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用して読み出しが行われています。したがって、細胞内から細胞および組織スケールに至るまでのメカノバイオロジカル研究は、記載されたプロトコルを使用して可能である。 
考慮する必要がある別の要因は、UV光パターニング49の間または後にサンプルが乾燥するリスクである。これは、凸部が細胞培養材料の外部に露出することが多いため、3D ジオメトリを使用する場合に特に重要です。 図 4 に示すように、これにより、目的のフィーチャの上にタンパク質凝集体が形成される不均一なパターンが生じる可能性があります。タンパク質インキュベーション後および細胞培養中の細胞培養チップの洗浄は、3D形状の適切なコーティングにとって重要です。したがって、細胞培養チップの上には、常に少量の作業溶液(PBS、PLPP、タンパク質溶液、細胞培養培地)を残すことをお勧めします。
これまでのところ、いくつかのタンパク質コーティング(フィブロネクチン、コラーゲンタイプIおよびIV、ゼラチン、FNC)および細胞型(ヒト骨髄間質細胞、ヒト筋線維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト角化細胞、および皮膚線維芽細胞)が、構造化細胞培養材料に関する記載されたフォトパターニングアプローチと組み合わせて使用されてきた。以前の研究48で示されているように、タンパク質インキュベーションパラメータの最適化は、新しい細胞型における体系的調査のための鍵である。したがって、新しいタンパク質または細胞で新しい実験を行う前に、さまざまなタンパク質濃度、インキュベーション温度、およびインキュベーション時間を試験することをお勧めします。均質でパターン化された平坦な領域での初期接着後の細胞形態を、「正常な」細胞培養条件下での細胞形態と比較することにより、最適化された実験パラメータのセットを得ることができる。さらに、各細胞型は、特定のマルチキュー環境で認識可能な接着形態を示すために、播種後に異なる時間を必要とする場合があります( 図5参照)。この目的のために、ステップ8.4の洗浄中にパターン化された領域に接触事象を提示するために細胞タイプごとに必要な時間を最適化することが極めて重要である。例えば、ラインパターン上では、ヒト角化細胞は播種後最初の30分以内に細長い形態を示すが、内皮細胞および皮膚線維芽細胞は接着形態の変化を示すまでに数時間かかることが観察された。したがって、タンパク質インキュベーション(ステップ7)および細胞播種(ステップ8)に必要な実験パラメータは、選択するタンパク質および細胞タイプに依存する可能性がある。 
3Dジオメトリに接触ガイダンスの手がかりを適用するための提示されたアプローチは、複雑なマルチキュー環境での細胞の動作をより深く理解するのに役立ちます。これには、焦点接着や核などの細胞内成分の調査が含まれ、提案された方法を使用して、より大きな、細胞、または組織スケールで実施される実験も含まれ得る。最終的に、得られた知識は、複雑な細胞環境が所望の結果に向かって細胞挙動を導くように設計されている組織工学アプリケーションの設計に使用することができることが期待される。

インビボでは、細胞は、細胞外マトリックス(ECM)に由来する機械的、物理的、および生化学的性質のものであり得る多種多様な環境手がかりを受ける。増殖、分化、遊走などの細胞行動の調節に重要な役割を果たしている多数の環境手がかりが同定されている1,2,3,4,5。最も広く調査された現象の1つは接触ガイダンスであり、細胞外基板6、7、8、9、10、11上に存在する異方性生化学的または地形学的パターンに沿った接着媒介性細胞アライメントを記述する。細胞のアライメントを指示するだけでなく、接触ガイダンスの手がかりは、細胞遊走、細胞内タンパク質の組織化、細胞形状、および細胞運命などの他の細胞特性にも影響を与えることが示されている12、13、14、15。さらに、3Dセルラー環境の幾何学的アーキテクチャは、セル挙動に対するその調節的影響についても認められている16,17。人体では、細胞はマイクロスケールのコラーゲン線維、毛細血管、糸球体からメソスケールの肺胞や動脈まで、さまざまな湾曲した形状にさらされています18,19。興味深いことに、最近のインビトロ研究は、細胞がナノスケールからメソスケールまで、そのような物理的手がかりを感知し、応答することができることを示している20、21、22、23。
今日まで、環境手がかりに対する細胞応答を調査するほとんどの研究は、単一の手がかりを分離する実験セットアップを使用して主に行われてきた。このアプローチは、環境手がかりの細胞センシングの背後にある基本的なメカニズムの理解において驚異的な進歩を可能にしましたが、複数の手がかりを同時に提示するin vivo環境をほとんど再現していません。このギャップを埋めるには、複数の環境手がかりを独立して同時に制御できる文化プラットフォームを開発することが有用です。この概念は、マトリックス剛性と配位子密度26,27,28,29、基板剛性と気孔率30、基板剛性と3Dマイクロニッチ体積31、表面地形と接触誘導手がかり32,33,34を組み合わせた研究により、最近24,25の牽引力を高めています。、およびメソスケール曲率ガイダンスキュー23を有するナノスケール接触ガイダンスキュー。しかし、接触誘導の手がかりをさまざまな3D形状と制御された高スループットの方法で組み合わせることは依然として困難です。
この研究プロトコルは、この課題に対処し、ECMタンパク質のパターン化された接着領域(接触誘導手がかり)と基質曲率(幾何学的手がかり)の制御された組み合わせを有する細胞培養基質を作成する方法を導入する。このアプローチは、生物模倣マルチキュー環境における細胞応答の解剖を、体系的かつハイスループットな方法で可能にする。得られた知識は、複雑な環境における細胞挙動のさらなる理解に役立ち、細胞応答を所望の結果に導く特性を有する有益な材料を設計するために使用することができる。
3Dタンパク質フォトパターニング 細胞培養材料上のECMタンパク質の接着領域(接触誘導手がかり)の作成は、例えば、深紫外(deep-UV)パターニングまたはマイクロコンタクト印刷によって、様々な技術を用いて達成することができる35、36。ディープUVパターニングは、ポリマー材料上のマスクを介して投影されるUV光を利用して、細胞培養基板上の特定の位置で不動態化ポリマーを分解する。次いで、パターン化された基板を、目的のリガンドと共にインキュベートし、予め定義された位置12、37、38上で細胞付着および培養を支持する接着領域をもたらす。タンパク質パターンを導入する別の方法は、マイクロコンタクト印刷によるものであり、所望の形状を含むエラストマースタンプを任意のタンパク質でコーティングし、細胞培養基材上にプレスし、それによって細胞が接着できるタンパク質コーティングを転写する35,37,39,40.残念ながら、どちらの手法もマスク調製法とソフトリソグラフィー法に依存しているため、実験には時間と労力がかかり、パターンの柔軟性の点では限られています。さらに、深紫外パターニングとマイクロコンタクト印刷はどちらも平面材料に最も適しており、3D環境での配位子のパターニングには不可能ではないにしても技術的に困難です。
これらの従来の方法を改善するために、Waterkotteらは、マスクレスリソグラフィー、化学気相成長、および熱成形を組み合わせて、マイクロパターン化された3Dポリマー基板41を生成する。しかし、この技術は熱成形可能なポリマーフィルムの使用に依存しており、低いタンパク質パターン分解能(7.5μm)を提供し、細胞は0.1μm2,42という小さな幾何学的タンパク質パターンに応答することが報告されている。Sevcikらは、ナノおよびマイクロメートルの地形図を含む基板上のECMリガンドをナノパターン化する別の有望な方法を記載した43。マイクロコンタクト印刷を用いて、ECMタンパク質をポリジメチルシロキサン(PDMS)スタンプから温度応答性ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(pNIPAM)基板に転写した。その後、pNIPAMネットワークの温度応答性により、2次元(2D)タンパク質パターンを地形PDMS基板(10-100μmの深溝)に転写することができ、それによって地形学的特徴上の接着部位の局在を制御することができた。しかし、濡れ性の低下の問題により、より深い地形基板をパターン化することがより困難になるため、すべての可能なマイクロトポグラフィーをパターン化できるわけではありません。深さ対幅アスペクト比が2.4のトレンチは、地形基板43にパターンを首尾よく転写するための究極の限界であると報告されている。さらに、さまざまなパターンの柔軟性と生成されたパターンの解像度は、マイクロコンタクト印刷の要件のために貧弱です。
本稿では、上記のボトルネックを克服し、細胞培養に使用できるマルチキュー基質を作成するための柔軟でハイスループットな方法を提示する方法について説明します( 図1参照)。曲率が ĸ = 1/2500 ~ ĸ = 1/125 μm-1 の範囲の生理学的に関連する形状(シリンダー、ドーム、楕円、およびサドル表面)は、PDMSチップで事前に設計および微細加工されています。その後、1.5μm44という小さな解像度のフォトパターニング技術を採用することにより、さまざまなデジタルパターン設計を使用して、3Dジオメトリの上に接触誘導キューが作成されます。この目的のために、PDMSチップは、細胞およびタンパク質が接着するのを防ぐために最初に不動態化される。次いで、このパッシベーション層は、光開始剤4−ベンゾイルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド(PLPP)およびUV光露光45の組み合わせによって除去することができる。デジタルマスクは、UV露光の位置、つまりパッシベーション層が除去される領域を指定するように設計されています。タンパク質はその後、これらの領域に接着することができ、細胞付着を可能にする。パターニングは(物理的なマスクではなく)デジタルマスクを使用して実行されるため、追加のフォトマスクの設計と製造に関連する手間とコストをかけずに、さまざまなパターンをすばやく作成できます。さらに、多様な範囲のECMタンパク質(例えば、コラーゲンタイプI、ゼラチン、およびフィブロネクチン)を基板上にパターニングすることができる。このプロトコルはPDMSで作製された細胞培養チップを用いて行われるが、この原理は、関心のある任意の他の材料に適用することができる46。

<table><tbody><tr><td>抗ビンクリン抗体、マウスモノクローナル IgG1</td><td>Sigma</td><td>V9131</td><td>希釈:1/600</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン、フラクションV</td><td>ロシュ</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、ピルビン酸</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x)</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>DMi8 エピ蛍光顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Biosolve0005250210BS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>セラナ</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>フィジー/ ImageJ、バージョンv1.53k</td><td>www.imageJ.nih.gov</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光蛍光蛍光ハイ</td><td>ライターStabilo</td><td>4006381333627</td><td></td></tr><tr><td>フルオレシン標識ゼラチン</td><td>Invitrogen</td><td>G13187</td><td>濃度:0.01%</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液</td><td>メルク</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>ガラス カバースリップ 24 x 60 mm, #1</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td></td></tr><tr><td>ガラス カバースリップ, &oslash; = 32 mm, #1</td><td>Menzel-Gl&auml;ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX PL fluotar L 20X/0.40na 顕微鏡対物レンズ</td><td>ライカ</td><td>11506242</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>ヒト皮膚線維芽細胞</td><td>ロンザ</td><td>CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>ヒト初代角化細胞</td><td>MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illustrator, Version 26.0.1</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>実験室</td>オーブン <td>カーボライト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸 2-リン酸 セスキマグネシウム塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X ソフトウェア、バージョン 3.5.7.23225</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レオナルド ソフトウェア、バージョン 4.16</td><td>Alv&eacute;</td><td></td><td></td>ole</tr><tr><td>Micro-manager, version 1.4.23</td><td>Open imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>埋込剤</td></tr><tr><td>mPEG-succinimidyl valerate MW 5,000 Da</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td>濃度: 50 mg/mL</td></tr><tr><td>ネガティブガラスモールド</td><td>FEMTOprint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live Readyprobes 試薬 (Hoechst 33342)</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>2 drops/mL</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (&oslash;=100 mm)</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Atto 647N</td><td>Sigma</td><td>65906</td><td>希釈:1/250</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>プラズマアッシャー</td><td>Emitech</td><td>K1050X</td><td></td></tr><tr><td>PLPP (光開始剤)</td><td>Alv&eacute;</td><td></td><td></td>ole</tr><tr><td>Poly-L-リジン、滅菌ろ過された</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td>濃度<td>:0.01%</td></tr><tr><td>PRIMO</td><td>Alv&eacute;</td><td></td><td></td>ole</tr><tr><td>Rhodamine標識フィブロネクチン</td><td>Cytoskeletn, Inc.</td><td>FNR01</td><td>濃度:10 & マイクロ;G/mL</td></tr><tr><td>Alexa 488、ヤギ抗マウスIgG1 (H)</td><td>Molecular Probes</td><td>A21121</td><td>希釈率:1/300</td></tr><tr><td>Alexa 555、ヤギ抗マウスIgG1 (H)</td><td>Molecular Probes</td><td>A21127</td><td>Dilution:1/300</td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td>Leurell Technologies Corporation</td><td>model WS-650MZ-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 シリコーンエラストマーキット</td><td>DOW</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP8X 共焦点顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステム</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td>トリデカフルオロ(1,1,2,2-テトラヒドロオクチル)トリクロロシラン</td><td>ABCR</td><td>AB111444</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

三次元細胞培養基材のuvフォトパターニングによるマルチキュー細胞微小環境の生成

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

細胞外マトリックスは、細胞機能の重要な調節因子である。リガンド分布や組織形状などの細胞微小環境に存在する環境手がかりは、細胞表現型および挙動を支配する上で重要な役割を果たすことがますます示されている。しかし、これらの環境手がかりと細胞に対するそれらの影響は、多くの場合、個々の手がかりを分離するin vitro プラットフォームを使用して別々に研究され、複数の手がかりの複雑な in vivo 状況を大幅に単純化する戦略です。エンジニアリングアプローチは、 in vivo 微小環境の複雑さを捉えながら、in vitro システムの精度と操作可能性の程度を保持する実験セットアップを開発することによって、このギャップを埋めるために特に有用であり得る。
この研究は、紫外線(UV)ベースのタンパク質パターニングとリソグラフィーベースの基板微細加工を組み合わせたアプローチを強調しており、マルチキュー環境における細胞挙動のハイスループット調査を可能にします。マスクレスUVフォトパターニングにより、さまざまな明確に定義された幾何学的手がかりを含むチップ上の3次元(3D)細胞培養基板上に複雑で接着性タンパク質分布を作成することが可能です。提案された技術は、異なるポリマー材料から作られ、広範囲のタンパク質の接着パターン化された領域と組み合わせた培養基材に採用することができる。このアプローチにより、単一細胞は、単層と同様に、パターン化された基板によって提示される幾何学的手がかりおよび接触誘導手がかりの組み合わせを受けることができる。したがって、チップ材料、タンパク質パターン、および細胞型の組み合わせを用いた体系的な研究は、マルチキュー環境に対する細胞応答に関する基本的な洞察を提供することができる。

記載されたプロトコルにより、3D PDMS細胞培養基材をUVフォトパターン化して、細胞接着に適した正確で高スループットの接着領域を作り出すことができます。このようにして、細胞は関連する基質形状と接着リガンドパターンの両方に同時にさらされる。配向、細胞面積、焦点接着の数などの細胞特性を簡単に監視し、複雑な 生体内のような環境での細胞挙動をよりよく理解するために使用できます。
3D PDMS基板上のパターニング事象を検証するために、プロトコルのさまざまな段階における材料の原子表面組成が、原子X線光電子分光法(XPS)48を使用して測定されています。要約すると、XPS測定は、パッシベーションされたサンプル上に増加した炭素シグナルを有するPEG鎖の存在を示し、これは光パターニング後に減少した。フィブロネクチンとのインキュベーションは炭素シグナルの増加をもたらし、細胞培養チップの表面上でのタンパク質接着の成功を再び示した。次に、さまざまな円パターンの凹型ピット(ĸ = 1/250 μm-1、ĸ = 1/1,000 μm-1、ĸ = 1/3,750 μm-1、図6参照)で3Dフィーチャのパターン解像度とアライメントを特徴付けました。最大強度投影から、タンパク質パターンは3つの3D特徴すべてで正常にパターン化されたと結論付けることができます。図6Aの強度プロファイルは、パターン化された領域とパターン化されていない領域との間の急激な遷移を伴う高いパターン解像度を示しています。さらに、ピット内の完全なパターン全体にわたって一貫したタンパク質強度が得られた。
ĸ=1/250μm-1の凹状のピットは単焦点面法(1パターン)を用いてパターニングし、ĸ=1/1,000μm-1及びĸ=1/3,750μm-1のピットはそれぞれ2面と3枚の焦点面(パターン)を用いてパターニングした。図 6 の最大強度投影でわかるように、どちらの方法でも、フィーチャの上にパターンが完全に配置されます。2つの異なる焦点面およびパターン間のずれた遷移は観察できない。
記載されたプロトコルを使用すると、広範囲のタンパク質パターンデザインをさまざまな形状に適用することができます( 図7 および ビデオ1を参照)。この方法の汎用性を説明するために、半円柱(凸面および凹面)、サドル面、およびピットを、様々な幅の線および円を用いてパターン化した。フォトパターン化された材料は、その後、細胞培養に使用することができる( 図7、 図8、ビデオ 2、ビデオ3、および ビデオ4を参照)。パターン化された凹状半円筒(フィブロネクチン線、赤色、幅5μm、および5μmギャップ)の凹状半円筒上で培養された真皮線維芽細胞の一例を、 図8、 図9、および ビデオ4に示す。実験中、細胞はマルチキュー細胞培養基材を感知して接着し、時間の経過とともに生存可能なままである。 図8の免疫蛍光染色から分かるように、細胞は主にフィブロネクチン株上に焦点接着(ビンクリンクラスター)を形成する。
これらの細胞培養材料を利用した別の例の研究が、最近、我々のグループ48によって発表された。この研究では、ヒト筋線維芽細胞および内皮細胞を、接触誘導手がかりおよび幾何学的地形図の組み合わせに供した。 インビボでは、両方のタイプの細胞が、ヒト血管系などの天然組織において湾曲および接触誘導の手がかりを経験する。インビ トロで 細胞を両方の環境手がかりを組み合わせた環境にさらすことによって、 インビボ の状況を反復することができ、細胞挙動に対する微小環境の役割をより深く理解することができる。ヒト筋線維芽細胞は、凹状の円筒形基板48上の接触誘導手がかり(平行なフィブロネクチン線)と位置合わせすることが示された。しかし、曲率が増加する凸構造では、幾何学的手がかりが生化学的手がかりを覆し、筋線維芽細胞が曲率の程度と徴候の両方を感知できることが示唆された。興味深いことに、内皮細胞は凹状のマルチキュー基質にのみ接着でき、凸状のPDMS基質には接着できなかった。凹状のタンパク質パターン化された基質上では、内皮細胞は接触誘導合図の方向に配向している。この基本的な in vitro 知識は、血管組織工学の分野において生理学的関連性を有し、最終的にはスマート組織工学構築物の設計を助けることができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig01.jpg"> 図1:3D細胞培養基材に接触ガイダンスの手がかりを適用する実験タイムライン。 まず、ポジティブな細胞培養チップは、さまざまな形状を含むネガティブPDMSモールドから製造される。未硬化のPDMSを金型に流し込み、65°Cで3時間硬化させた。 続いて、PDMSをO2プラズマで処理し、PLLおよびmPEG−SVA(青色、標識付き)と共にインキュベートして、細胞培養基材の表面を不動態化する。洗浄後、基板を光開始剤(PLPP、緑色、ラベル付き)の液滴中で逆さまに反転させ、LIMAPアプローチを使用してUVフォトパターン化する。ここでは、ユーザ定義のパターンを有するデジタルマスクを使用して、定義された位置でパッシベーション層を切断する。次に、タンパク質溶液(赤色、標識)をインキュベートすることができ、パッシベーション層が除去される位置にのみ付着する。基板上に播種された細胞は、幾何学的形状とタンパク質パターンの両方にさらされ、複雑な in vivo模倣環境での細胞挙動の研究を可能にします。略語:PDMS=ポリジメチルシロキサン;mPEG-SVA=メトキシポリエチレングリコール-スクシンイミジル吉草酸;PLPP=4-ベンゾイルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド;LIMAP = タンパク質の光誘導分子吸着。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig02.jpg"> 図2:3D細胞培養基材の製造および不動態化の間の異なる段階。 負のガラスモールドは、コンピュータ支援設計ソフトウェアで設計され、フェムト秒レーザー直接書き込み技術を使用して製造されています。このモールドは、中間の陽性PDMSチップおよび陰性PDMSモールドを製造するために利用され、その後、最終的な細胞培養チップを製造するために使用される。略語:PDMS=ポリジメチルシロキサン。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig03.jpg"> 図3:2つのパターニング方法の概略図。左:UVフォトパターニングは、単一の焦点面とパターンを使用して、より小さなフィーチャ(約1つのDMD)に対して実行されます。その結果、完全な機能が一度にパターン化されます。右:より大きなフィーチャ(1つのDMDより大きい)を使用する場合、パターニングは複数の焦点面とパターンに分割されます。略語:DMD =デジタルミラーデバイス。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig04.jpg"> 図4:通常および乾燥させたタンパク質インキュベート基質の典型的な例。 正常およびドライアウトされたタンパク質インキュベート基質の最大強度投影(XY)および直交図(XZ)。タンパク質溶液でインキュベーションした後にパターン化された細胞培養基材を洗浄する場合、サンプルを常に濡らしておくことが重要です。パターンは特徴(ĸ = 1/1,000 μm-1)上のすべての画像で同じですが、ゼラチン - フルオレセイン(緑色)は、サンプルを数秒間乾燥させたときに凝集して大きな塊を形成しました。サンプルが常に濡れたままであれば、正しいタンパク質パターンを観察することができます。スケール バー = 100 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig04large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig05.jpg"> 図5:シード後の明視野画像初代角化細胞(左)および皮膚線維芽細胞(右)を3D幾何学的特徴(ĸ=1/1,000μm-1の凹状ピットおよびĸ=1/500、1/375、1/250、1/175、および1/125μm-1の半円柱)上に播種してから4時間後。左上の挿入は、ジオメトリのパターン化に使用されるラインパターンを表します。白い矢印は、既に配置が示されているセルが広がっていることを示します。スケール バー = 250 μm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig05large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig06.jpg"> 図6:凹状ピット上の円形パターンの特性評価(A)LIMAP(線幅:20μm、ギャップ幅:20μm)を用いてパターン化し、ゼラチン-フルオレセイン(緑色)と共にインキュベートした凹状ピット(ĸ=1/250μm-1)の最大強度投影(XY)および直交図(XZ)。白い線に沿った強度プロファイルが距離に対してプロットされ、一貫したパターン品質と解像度を示します。(B) ĸ = 1/1,000 μm-1 および ĸ = 1/3750 μm-1 の凹状ピットに対して追加のパターニングが行われ、パターニングに使用できる幾何学的特徴の点で柔軟性が示されます。ここでも、最大強度投影(XY)と直交ビュー(XZ)の両方が視覚化されます。スケール バー = 100 μm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig06large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig07.jpg"> 図7:パターン化された構造の3D顕微鏡データ。 光パターニングおよび細胞培養後の3Dパターン化された細胞培養材料の典型的な例を、3Dレンダリングソフトウェアを用いて可視化する。(A)幅10μmの線(ローダミン - フィブロネクチン、赤色)と10μm幅の隙間でパターン化された凸状の半円筒。(B)F-アクチン(緑色)用に染色した皮膚線維芽細胞を、幅20μmの線(ローダミン-フィブロネクチン、赤色)および20μm幅の隙間でパターニングされた凹状の半円筒上で培養した。スケールバー = 5 μm. (C) 幅 20 μm の線 (ローダミン-フィブロネクチン、赤) と幅 20 μm のギャップでパターニングされたサドル表面。スケールバー = 5 μm. (D) 幅 20 μm の線 (ゼラチン - フルオレセイン、緑色) の同心円と幅 20 μm のギャップでパターン化された凹状のピット。ヒト角化細胞のF-アクチン細胞骨格をファロイジンを用いて染色し、赤色で可視化する。スケール バー = 200 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig07large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig08.jpg"> 図8:光パターン化された凹状の半円筒上のヒト皮膚線維芽細胞の免疫蛍光染色(A)パターン化された凹状半円筒(フィブロネクチン線、赤色、幅5μm、およびギャップ5μm)上で24時間培養したヒト皮膚線維芽細胞の最大強度投影(XY)および直交切片(XZおよびYZ)。細胞は、F-アクチン(マゼンタ)、ビンクリン(緑色)、および核(青色)について染色される。スケール バー = 100 μm。(B) マルチキュー環境に接着しているセルのズームイン。スケール バー = 50 μm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig08large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig09.jpg"> 図9:パターン状の凹状の円柱上のヒト皮膚線維芽細胞の明視野タイムラプス画像。 凹状の半円筒(ĸ = 1/250 μm-1)を平行線(幅5 μm、隙間5 μm)でパターニングし、細胞播種前にローダミン - フィブロネクチンと共にインキュベートした。タイムラプスイメージングは、最初の細胞播種から1時間後(左、0分)に開始され、細胞はまだ丸みを帯びていて接着していない(矢印)。約24時間後(中間、1,420分)、細胞はマルチキュー基板に接着し、接触ガイダンスパターンに従って位置合わせ応答を示す。アライメント応答および細胞生存率の両方が、培養期間全体(右、3,180分)を通して維持される。スケール バー = 200 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig09large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ビデオ 1: 3D 円筒形基板上のパターン例。 ローダミン - フィブロネクチン(赤)でパターン化された凸状の円柱の3D表現。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%201.zip" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
ビデオ2:パターン化された3D円筒形基材(ĸ = 1/500 μm-1)上で培養した皮膚線維芽細胞の3D表現。 皮膚線維芽細胞を、パターン化された(フィブロネクチン線、赤色、幅10μm、および10μmの隙間)凸半円筒上で24時間培養した。細胞は、F-アクチン(マゼンタ)、ビンクリン(緑色)、および核(青色)について染色される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%202.zip" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
ビデオ3:パターン化された3Dピット(ĸ = 1/3,750 μm-1)上で培養されたヒト角化細胞の3D表現。 凹状のパターン状のピット(ゼラチン円、緑色、幅20 μm、およびギャップ20 μm)で24時間培養したヒト角化細胞の3D表現。細胞はF-アクチン(赤色)について染色される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%203.zip" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
ビデオ4:パターン状の凹状の円柱上のヒト皮膚線維芽細胞の明視野タイムラプスイメージング。 凹状の半円筒(ĸ = 1/250 μm-1)を平行線(幅5 μm、隙間5 μm)でパターニングし、細胞播種前にローダミン - フィブロネクチンと共にインキュベートした。タイムラプスイメージングは、細胞がマルチキュー環境への初期接着を示す最初の細胞播種後1時間で開始されます。完全なタイムラプスの間、細胞は主に接触誘導手がかりに沿って配向し、細胞の生存率は維持される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%204.zip" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

伝統的に、細胞培養は、 インビボで細胞の自然環境をほとんど模倣しない平面基質上で行われる。ここでは、生理学的に関連する湾曲した形状およびマイクロパターン化された細胞外タンパク質を有する細胞培養基質を作製し、これらの細胞外手がかりの細胞センシングを系統的に調査する方法について説明する。

三次元細胞培養基材のUVフォトパターニングによるマルチキュー細胞微小環境の生成

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand ...

細胞の挙動に対する微小環境因子の影響は、単一の手がかりを分離する過度に単純化されたin vitroプラットフォームを使用して研究されることがよくあります。私たちのアプローチは、これらの手がかりの複数を組み合わせた細胞培養基質を作成します。このアプローチは非常に汎用性が高く、さまざまな細胞培養材料、接触誘導パターン、細胞読み出し、およびタンパク質を使用した体系的な研究を可能にします。手順は、私たちの研究室からの2人のPSE候補者によって実証されます。CAS VAN DER PUTTEN, と MIRKO D'URSO まず、関心のあるすべての特徴を含むフェムト秒レーザーダイレクト右技術を使用して、負のガラス型を作成します。次に、ネガガラスモールドをペトリ皿の底に注意深く置き、ネガガラスモールドの上にポリジメチルシロキサンプレポリマーを注ぎ、完全に覆います。このペトリ皿を真空デシケーターに入れ、真空ポンプを始動します。真空が達成されたら、5分間待って、金型表面とポリジメチルシロキサンプレポリマーの間の界面に存在するすべての気泡を除去します。PDMSプレポリマーを摂氏65度のオーブンで一晩硬化させます。硬化後、スパチュラを使用してPDMSの端を持ち上げます。新しく硬化したポジティブPDMSチップをネガティブガラスモールドから取り外し、ポジティブPDMSチップがネガティブガラスモールドに付着する傾向がある場合は、持ち上げながらインプリントの端にエタノールまたは水を追加します。次に、ポジティブポリジメチルシロキサンチップを、シラン化剤の液滴を入れた小さなバイアルの隣のデシケーターに入れ、チップを真空下で一晩放置します。PDMSプレポリマーをネガティブPDMSモールドに流し込み、厚さ5ミリメートルの複数の細胞培養チップを製造します。次に、デシケーターを使用して気泡を取り除き、摂氏65度で3時間硬化させます。かみそりの刃を使用してチップを最終的なサイズに切断し、チップを室温で保管します ピンセットを使用した基板パッシベーションの場合は、チップをプラズマアッシャーのバスケットに入れます。次に、酸素プラズマを使用してチップ表面のヒドロキシル基を活性化し、窒素を使用して灰室を通気します。バスケットからチップを取り出し、小さなポリジメチルシロキサン容器に入れます。次に、パスツールピペットを使用してチップの上部に500マイクロリットルのポリ-L-リジンを追加し、表面を溶液に完全に浸し、室温で30分間インキュベートします。次に、450マイクロリットルのPoly-L-リジンをピペットで細胞培養チップから取り出します。次に、チップ表面を500マイクロリットルの0.1モルHEPESバッファーですすいでください。ポリジメチルシロキサンチップ上に少量の液体を残して最終的なパターン品質を維持し、サンプルの乾燥を防ぎます。使用直前に、細胞培養チップ当たり0.1モルヒープ緩衝液中の500マイクロリットルの50ミリグラム/ミリリットルのメトキシポリエチレングリコシンシアナミド吉草酸塩溶液を調製し、その中にサンプルを60分間インキュベートする。マイクロピペットを使用して、450マイクロリットルのメトキシポリエチレングリコシングシアナミダル吉草酸溶液を除去する。チップ表面をPBSでピペッティングインおよびピペッティングアウトして5回洗浄します。バインドされていないすべてのmPEG-SVAを削除します。蛍光蛍光ペン付きのスライドガラスを顕微鏡の光路に置きます。顕微鏡で蛍光モードに切り替え、プリモ画像に注意深く焦点を合わせ、ロゴとテキストの両方に焦点が合っていることを確認します。次へをクリックしてキャリブレーションデータとパターンを表示し、キャリブレーション手順を終了します。キャリブレーション時にステージのZ位置を書き留め、この位置をプロトコルの後半で参照として使用します。キャリブレーションスライドをステージから取り出した後、光開始剤の液滴を含むスライドガラスをステージ上に置き、PDMS細胞培養基板を逆さまに置き、光開始液滴を入れた。細胞培養基板の表面の3Dフィーチャーがスライドガラスに面し、フォトイニシエーターに完全に沈んでいることを確認して、適切なパターン化を確保します。凸構造または凹構造の上部または下部にそれぞれ焦点を当て、原稿に記載されているように、適切な位置にあるチップの領域に焦点を合わせます。機能に応じてパターニング設定を調整し、ミリリットルあたり1000ミリジュールの用量を選択します。画面右下の再生ボタンをクリックして、パターン化を開始します。終了したら、緑色で表示されているパターンを確認します。マイクロピペットを使用して、20マイクログラムのローダミン標識フィブロネクチンのバイアルに2ミリリットルのPBSを加え、1ミリリットル当たり10マイクログラムの濃度を得た。タンパク質の塊を避け、光から保護するために、ピペットを穏やかに動かします。マイクロピペットを使用して、200〜500マイクロリットルのタンパク質溶液を細胞培養チップに加えます。選択したタンパク質に応じてインキュベーション時間と温度を調整し、サンプルを必ずカバーしてください。タンパク質溶液を取り出し、チップを500マイクロリットルの滅菌PBSで5回洗浄します。細胞培養チップのすべての関連機能の上にPBSを複数回ピペットで上下にピペットして、結合していないタンパク質を除去してください。細胞懸濁液が調製されたら、PBSを取り出し、1ミリリットルの細胞懸濁液をチップに加える。その後、摂氏37度で60分間インキュベートします。パターン細胞培養チップ上の細胞の接着を明視野顕微鏡で確認する。線パターンの場合は細長い細胞形態を探します。また、細胞がパターン領域の外側に接着し始めた場合は、基板上の細胞の真上で培地を上下にピペッティングしてこれらを取り除きます。染色後、染色したサンプルを逆さまにスライドガラス上のPBSの液滴に入れます。次に、必要な詳細レベルに応じて、適切な対物レンズとZ間隔を使用してZスタックを作成し、適切な画像取得を保証します。3Dレンダリングソフトウェアを使用してZスタックの3Dレンダリングを作成します。タンパク質の光誘起分子吸収を用いて凹状のピットをパターン化し、最大強度投影と直交図を可視化した。強度プロファイルは、パターン化された領域とパターン化されていない領域の間で高いパターン分解能の鋭い遷移と一貫したタンパク質強度を示しました。単焦点面法と2焦点面法、3焦点面法を用いたパターニングでは、特徴の上にパターンが完全に揃っていることが示されました。凹型半円筒、凸型半円筒、サドル表面およびPIDは、様々な幅の線または同心円を使用してパターン化された。ヒト角化細胞の骨格内部への影響をフォリデンを用いて染色し、可視化する。皮膚線維芽細胞をパターン化された凹状の半円筒上で培養し、可視化した。細胞はマルチキュー細胞培養基質を感知して接着し、F-アクチン、ビンキュリン、および核によって視覚化されるように、時間の経過とともに生存可能なままでした。また、細胞は主にフィブロネクチン株上に限局性接着を形成した。ローダミンフィブロネクチンの存在下でパターン化された凹面シリンダー上で培養されたヒト皮膚線維芽細胞は、マルチキュー基板に接着し、接触誘導パターンに従って配向応答を示した。アラインメント応答と細胞生存率は、培養期間全体にわたって維持されます。このプロトコルを実行する際に最も重要なことは、細胞培養チップの表面が乾燥するのを防ぐことです。異なる基質材料、タンパク質コーティング、細胞タイプを使用すると、追加の最適化が必要になる場合があります。3Dで複数の環境手がかりを提供することで、複雑なエンジニア組織の細胞組織を操縦する新しい可能性を開くことができます。

generation-multicue-cellular-microenvironments-uv-photopatterning

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

水性二相系が細胞のパターンを同時に複数の集団に使用されていました。セルパターニングのためのこの迅速かつ簡単な方法は、デキストランとポリエチレングリコールと2ポリマー溶液との間に存在する界面張力の水溶液の相分離を利用しています。...

水性二相系を用いた細胞の共培養パターニング

私たちは、水性環境下での足場表面の細胞親和性を変更するためのプロトコルを記述します。この方法は、二酸化チタンの光触媒を利用して、光照射領域の有機膜を分解します。私たちは、それがex situとin...

TiOを使用して水性環境中のタンパク質や細胞を光パターニング<sub&gt; 2</sub&gt;光触媒

次のプロトコルは、二次元(2D)と三次元(3D)の細胞環境の中間段階として使用されるサンドイッチ状の培養物を組み立てる手順を説明しています。設計されたシステムは、顕微鏡、バイオメカニクス、生化学、細胞生物学アッセイに応用できます。...

サンドイッチ状の微小環境は、Cell /材料の相互作用を活用します

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は差別化した別個の組織パターンに自己組織化するための固有の能力を持っています。これは、空間的な環境勾配の提示を必要とするが。我々はHPSC分化パターンを制御するための生化学的および機械的な勾配を生成するためのシンプルかつ堅牢な方法としてステンシル微細を提示します。...

分化運命の空間組織を探るためのヒト多能性幹細胞のステンシルマイクロパターニング

私たちは、三次元細胞培養アプリケーションのための合成ハイドロゲルマトリックスの光媒介形成とその後の生化学的パターニングの連続的なプロセスについて説明します。細胞適合性フォトクリックケミストリーによるハイドロゲルの構築と修飾が実証されています。さらに、これらのハイドロゲル内のパターンを定量化および観察し、細胞生存率を決定するための容易な技術が紹介されています。...

細胞培養アプリケーションのためのヒドロゲルの光媒介形成とパターニング

この資料は、物理と化学の高スループット操作キューが模倣した生体内で細胞微小と多重化人工細胞微小環境 (MACME) 配列を準備する詳細な方法についてを説明します単一セルのプロファイリングとひと多能性幹細胞 (hPSCs)...

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

反復可能なパターン形成を取得する 3 D 細胞外マトリックスの初期細胞クラスター形状を制御するための手順を紹介します。組織パターン形成のための多方向の画像を達成するために 2...

反復可能なパターン形成のためのハイブリッド ゲル キューブ デバイスで初期の 3 D 細胞クラスター制御

ここで提示する方法は、マイクロパターニングと定量イメージングを使用して、哺乳類培養における空間的組織を明らかにする。この技術は、標準的な細胞生物学研究室で確立することが容易であり、インビトロでのパターニングを研究するための扱いやすいシステムを提供しています。...

マイクロパターンと定量イメージングを用いた哺乳類細胞の新しい空間組織のマッピング

このプロトコルは、限られたバイオエンジニアリングのバックグラウンドを持つ人が簡単でアクセスできるリソグラフィーフリーのマイクロパターン化方法を導入しています。この方法は、カスタマイズされたレーザーカットステンシルを利用して、細胞形態を調節するために目的の形をした細胞外マトリックスタンパク質をマイクロパターン化します。マイクロパターン化の手順は、人工多能性幹細胞由来の心筋細胞を用いて実証される。...

レーザーカットステンシルを用いたシンプルリソグラフィフリーシングルセルマイクロパターニング

ここでは、マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームを用いて、3次元の簡易および未分化皮膚モデルを生成するプロトコルを提示する。平行流アプローチは上の上の上皮細胞の播種のための真皮のコンパートメントの その場の 堆積を可能にし、すべてシリンジポンプによって制御される。...

マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームにおける簡単な3次元スキンオンチップモデルの生成

ここで示すプロトコルは、哺乳類細胞内の細胞骨格構造を研究するために細胞形状を標準化するマイクロパターンの自動製作を可能にする。このユーザーフレンドリーな技術は市販のイメージ投射システムと設定することができ、標準的な細胞生物学の実験室にアクセスできない専門の装置を要求しない。...

赤外線レーザー支援マイクロパターンによる細胞形状の制御

学ぶ UVフォトパターニングによる三次元細胞培養基材の作製法。PDMSを用いて複数の微小環境キューを組み合わせ、細胞の接着と形態応答を系統的に解析する手法を解説。

三次元細胞培養基材のUVフォトパターニングによるマルチキュー細胞微小環境の生成

さらに動画を探す