Name: 骨格筋における筋肉内脂肪形成とその細胞起源を調べるためのガイド (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 学ぶ筋肉内脂肪の可視化と定量化の手法。グリセロール損傷モデルを用いて骨格筋における脂肪細胞の形態を保存し、筋萎縮症などの疾患における脂肪形成メカニズムを解明するための実験プロトコルです。

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コピンケ研究所のメンバーには、データ収集と原稿の批判的読解を手伝ってくれたことに感謝します。また、フロリダ大学の筋学研究所のメンバーにも、原稿に関する貴重な意見に感謝します。この作業は、NIH助成金1R01AR079449によって支援されました。図 2 は Biorender で作成したものです。

<ol><li>Milad, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+plasma+lipid+levels+exacerbate+muscle+pathology+in+the+mdx+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Increased plasma lipid levels exacerbate muscle pathology in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Skeletal Muscle. 7 (1), 19(2017).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+regional+body+fat+distribution%2C+and+the+metabolic+syndrome+in+older+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women.</a> Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+regional+adipose+tissue+distribution+and+both+type+2+diabetes+and+impaired+glucose+tolerance+in+elderly+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men and women.</a> Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+skeletal+muscle+strength%2C+mass%2C+and+quality+in+older+adults%3A+the+health%2C+aging+and+body+composition+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The loss of skeletal muscle strength, mass, and quality in older adults: the health, aging and body composition study.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (10), 1059-1064 (2006).</li>
<li>Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thigh+adipose+tissue+distribution+is+associated+with+insulin+resistance+in+obesity+and+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).</li>
<li>Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+lipid+content+is+increased+in+obesity+and+decreased+by+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss.</a> Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).</li>
<li>Burakiewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+fat+replacement+of+muscle+by+quantitative+MRI+in+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantifying fat replacement of muscle by quantitative MRI in muscular dystrophy.</a> Journal of Neurology. 264 (10), 2053-2067 (2017).</li>
<li>Murphy, W. A., Totty, W. G., Carroll, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+of+normal+and+pathologic+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Roentgenology%22%5BJournal%5D)">MRI of normal and pathologic skeletal muscle.</a> American Journal of Roentgenology. 146 (3), 565-574 (1986).</li>
<li>Willcocks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+prospective+longitudinal+study+of+magnetic+resonance+biomarkers+in+a+large+duchenne+muscular+dystrophy+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multicenter prospective longitudinal study of magnetic resonance biomarkers in a large duchenne muscular dystrophy cohort.</a> Annals of Neurology. 79 (4), 535-547 (2016).</li>
<li>Wokke, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+MRI+and+strength+measurements+in+the+assessment+of+muscle+quality+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Quantitative MRI and strength measurements in the assessment of muscle quality in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (5), 409-416 (2014).</li>
<li>Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins%2C+potency%2C+and+heterogeneity+of+skeletal+muscle+fibro-adipogenic+progenitors-time+for+new+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions.</a> Skeletal Muscle. 11 (1), 16(2021).</li>
<li>El Agha, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+fibrotic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in fibrotic disease.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).</li>
<li>Joe, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li>
<li>Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+adipose+is+derived+from+a+non-Pax3+lineage+and+required+for+efficient+regeneration+of+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles.</a> Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).</li>
<li>Scott, R. W., Arostegui, M., Schweitzer, R., Rossi, F. M. V., Underhill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hic1+defines+quiescent+mesenchymal+progenitor+subpopulations+with+distinct+functions+and+fates+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hic1 defines quiescent mesenchymal progenitor subpopulations with distinct functions and fates in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 797-813 (2019).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+adipogenesis+originate+from+a+common+mesenchymal+progenitor+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 21 3654-3664 (2011).</li>
<li>Hogarth, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroadipogenic+progenitors+are+responsible+for+muscle+loss+in+limb+girdle+muscular+dystrophy+2B%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fibroadipogenic progenitors are responsible for muscle loss in limb girdle muscular dystrophy 2B.</a> Nature Communications. 10 (1), 2430(2019).</li>
<li>Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li>
<li>Stumm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odd+skipped-related+1+%28Osr1%29+identifies+muscle-interstitial+fibro-adipogenic+progenitors+%28FAPs%29+activated+by+acute+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Odd skipped-related 1 (Osr1) identifies muscle-interstitial fibro-adipogenic progenitors (FAPs) activated by acute injury.</a> Stem Cell Research. 32, 8-16 (2018).</li>
<li>Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+Hedgehog+signaling+restricts+injury-induced+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ciliary Hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis.</a> Cell. 170 (2), 340-351 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Das, A. K., Yang, Q. Y., Zhu, M. J., Du, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zfp423+promotes+adipogenic+differentiation+of+bovine+stromal+vascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zfp423 promotes adipogenic differentiation of bovine stromal vascular cells.</a> PLoS One. 7 (10), 47496(2012).</li>
<li>Sun, Y. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFR%CE%B1+regulated+by+miR-34a+and+FoxO1+promotes+adipogenesis+in+porcine+intramuscular+preadipocytes+through+Erk+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">PDGFRα regulated by miR-34a and FoxO1 promotes adipogenesis in porcine intramuscular preadipocytes through Erk signaling pathway.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2424(2017).</li>
<li>Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+and+characterization+of+fibro-adipogenic+progenitors+%28FAPs%29+and+myogenic+progenitors+%28MPs%29+in+skeletal+muscle+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) in skeletal muscle in the rat.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e61750(2021).</li>
<li>Lukjanenko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+disrupts+muscle+stem+cell+function+by+impairing+matricellular+WISP1+secretion+from+fibro-adipogenic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).</li>
<li>Santini, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+PDGFRalpha%28%2B%29+progenitor+cells+contribute+to+fibrosis+versus+healing+in+a+context-+and+spatiotemporally+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident PDGFRalpha(+) progenitor cells contribute to fibrosis versus healing in a context- and spatiotemporally dependent manner.</a> Cell Reports. 30 (2), 555-570 (2020).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+PDGFRalpha%2B+mesenchymal+progenitors+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of PDGFRalpha+ mesenchymal progenitors in human skeletal muscle.</a> Cell Death & Disease. 5, 1186(2014).</li>
<li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li>
<li>Soliman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+potential+of+Hic1-expressing+cardiac+stromal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic potential of Hic1-expressing cardiac stromal progenitors.</a> Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).</li>
<li>Chung, M. I., Bujnis, M., Barkauskas, C. E., Kobayashi, Y., Hogan, B. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-mediated+BMP%2FSMAD+signaling+regulates+lung+alveolar+stem+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Niche-mediated BMP/SMAD signaling regulates lung alveolar stem cell proliferation and differentiation.</a> Development. 145 (9), Cambridge, England. (2018).</li>
<li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+fatty+acids+activate+ciliary+FFAR4+to+control+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Omega-3 fatty acids activate ciliary FFAR4 to control adipogenesis.</a> Cell. 179 (6), 1289-1305 (2019).</li>
<li>Waisman, A., Norris, A. M., Elías Costa, M., Kopinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+and+unbiased+segmentation+and+quantification+of+myofibers+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automatic and unbiased segmentation and quantification of myofibers in skeletal muscle.</a> Scientific Reports. 11 (1), 11793(2021).</li>
<li>Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+CNS+glial+progenitors+remain+committed+to+the+oligodendrocyte+lineage+in+postnatal+life+and+following+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration.</a> Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).</li>
<li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).</li>
<li>Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+reveals+that+transient+adipogenic+activation+is+a+hallmark+of+mouse+models+of+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration.</a> PLoS One. 8 (8), 71084(2013).</li>
<li>Mahdy, M. A., Lei, H. Y., Wakamatsu, J., Hosaka, Y. Z., Nishimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+muscle+regeneration+following+cardiotoxin+and+glycerol+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Anatomy+%3D+Anatomischer+Anzeiger%3A+Official+Organ+of+the+Anatomische+Gesellscaft%22%5BJournal%5D)">Comparative study of muscle regeneration following cardiotoxin and glycerol injury.</a> Annals of Anatomy = Anatomischer Anzeiger: Official Organ of the Anatomische Gesellscaft. 202, 18-27 (2015).</li>
<li>Pisani, D. F., Bottema, C. D., Butori, C., Dani, C., Dechesne, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+skeletal+muscle+adiposity%3A+a+glycerol+treatment+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mouse model of skeletal muscle adiposity: a glycerol treatment approach.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (3), 767-773 (2010).</li>
<li>Kawai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+glycerol+myopathy%3A+a+histological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Experimental glycerol myopathy: a histological study.</a> Acta Neuropathologica. 80 (2), 192-197 (1990).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Bmp3b+expression+maintains+skeletal+muscle+integrity+and+decreases+in+age-related+sarcopenia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Bmp3b expression maintains skeletal muscle integrity and decreases in age-related sarcopenia.</a> The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139617(2021).</li>
<li>Biferali, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm16-mediated+H3K9+methylation+controls+fibro-adipogenic+progenitors+identity+during+skeletal+muscle+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Prdm16-mediated H3K9 methylation controls fibro-adipogenic progenitors identity during skeletal muscle repair.</a> Science Advances. 7 (23), 9371(2021).</li>
<li>Biltz, N. K., Meyer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+quantification+of+fatty+infiltration+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle.</a> Skeletal Muscle. 7 (1), (2017).</li>
<li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), Cambridge, England. (2021).</li>
<li>Gómez-Gaviro, M. V., Sanderson, D., Ripoll, J., Desco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+tissue+clearing+and+three-dimensional+imaging+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of tissue clearing and three-dimensional imaging in health and disease.</a> iScience. 23 (8), 101432(2020).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
</ol>

著者らは、競合する利益を宣言していない。

このプロトコルは、筋肉内脂肪の効率的な視覚化と厳密な定量化を可能にする広範で詳細なプロトコルの概要を示しています。同じ筋肉を2つの部分に分割し、1つは免疫蛍光に、もう1つはRT-qPCR分析に使用することで、このプロトコルも非常に汎用性があります。また、FAPの遺伝的系統追跡と組み合わせて、特定の条件下で脂肪細胞への変換を研究することもでき、複数の追加の細胞型を標識および画像化するために高度に適応可能である。
筋肉内脂肪を視覚化するために最も一般的に使用される方法は、パラフィン切片に続いてヘマトキシリンおよびエオジン染色、またはオイルレッドO(ORO)などの親油性染料で染色された凍結切片である。しかし、パラフィン処理された組織は最高の組織学を維持する一方で、同じプロセスはまた、親油性染料の使用を妨げるすべての脂質を抽出する。親油性染色法はPFA固定組織切片と非固定組織切片の両方に作用するが、脂肪滴はカバースリップに圧力を加えることによって容易に変位し、それによって筋肉内脂肪の空間分布を歪める。これを回避するために、最近の研究では、ホールマウントアプローチを使用してORO+脂肪細胞を視覚化するための厳格なプロトコルが確立されました。このために、著者らはTAを脱細胞化し、TA41全体にわたる筋肉内脂肪の空間分布を視覚化した。この技術と同じくらい強力ですが、それはまた、追加の細胞構造をマークするために他の共染色剤の使用を防ぎます。ここで紹介するホールマウント免疫蛍光アプローチは、脂肪細胞をさまざまなマーカーと共染色するために使用でき、細胞環境の微細なマッピングを可能にします。しかし、1つの大きな課題は、抗体の組織浸透である。より多くの繊維が一緒に保たれるほど、抗体が均等に浸透し、利用可能なすべての抗原に結合することがより困難になります。したがって、この方法は、繊維の小さなグループを見るときに最も効果的です。同時に、筋肉内脂肪の全体的な解剖学的位置は、小さな剥離した繊維束のみに焦点を当てると失われているため、これも制限です。しかし、新しい組織クリアリング方法と新しいイメージング技術の現在の開発により、将来的には組織の浸透と視覚化が可能になります42,43,44。
筋肉組織の事前固定は脂肪細胞の形態を維持する一方で、筋肉の健康の重要な測定値である筋線維のサイズを評価するという課題も生み出します。ミオファイバーサイズは、ミオファイバーの断面積を測定することにより求められる。我々は以前、筋肉組織の事前固定により、筋線維の輪郭を描くために利用可能なほとんどのマーカーが失敗することを報告した31。このハードルを克服するために、我々は、固定筋肉切片31においても筋線維サイズの測定を可能にする新規な画像セグメンテーションパイプラインを開発した。したがって、このプロトコルと組み合わせて、筋肉組織の事前固定によって引き起こされるほとんどの欠点を克服する堅牢で効率的な組織処理パイプラインを確立しました。
このアプローチのもう1つの大きな利点は、汎用性です。TAを2つの部分に分割することで、1つの筋肉から得られる情報量が最大化されます。これは動物の数を減らすだけでなく、遺伝子発現を通して組織学を確認することによって、そしてその逆もまた然りであることによって、制御の余分な層を追加します。さらに、脂肪生成遺伝子を超えて多くの異なる遺伝子を調べることができる。単離されたRNAは、筋肉全体のRNAseq実験にも使用することができる。最後に、スナップ凍結筋肉片は、タンパク質作業にも使用できます。このプロトコルの1つの制限は、傷害がTAの全長にわたって一貫していない可能性である。これは、2つの筋肉部分がそれらに含まれる筋肉内脂肪の量で発散するシナリオにつながる可能性があり、下流の分析からそのようなサンプルを除外することを正当化する可能性がある。したがって、筋肉内脂肪の量に関する主要な結論を引き出すために単にRT-qPCRに頼るのではなく、むしろ組織学的定量化を支持するデータとして行うことが推奨される。
一緒に、このプロトコルは、脂肪線維症と戦うための新しい治療選択肢を開発するための最初のステップである筋肉内脂肪の視覚化と定量化を可能にする、堅牢で効率的で厳格な組織処理パイプラインを概説します。同時に、それは汎用性があり、筋肉内の多くの異なる細胞型ならびに他の組織の脂肪細胞に適応させることができる。

脂肪線維症を伴う健康な筋肉組織の浸潤は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)および他の神経筋疾患、ならびにサルコペニア、肥満、および糖尿病の顕著な特徴である1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 .これらの状態における脂肪浸潤の増加は筋肉機能の低下と強く関連していますが、筋肉内脂肪が形成される理由と方法に関する私たちの知識はまだ限られています。FAPsは、骨格筋を含むほとんどの成人器官に存在する多能性間葉間質細胞集団である11、12。しかし、加齢および慢性疾患において、FAPは線維性瘢痕組織を産生し、脂肪細胞に分化し、個々の筋線維の間に位置し、筋肉内脂肪を形成する13、14、15、16、17、18、19、20を形成する。
筋肉内脂肪形成との戦いを開始するには、FAPが脂肪細胞にどのように変化するかのメカニズムを定義する必要があります。PDGFRαは、複数の種13、16、17、18、20、21、22、23、24、25、26、27の筋肉内のFAPを同定するための分野における「ゴールドスタンダード」マーカーである。その結果、Pdgfrαプロモーターの制御下で、いくつかのマウスタモキシフェン誘導性Cre系統が生成され、Cre-LoxP系を用いてインビボでFAPを遺伝的に操作することが可能になった27、28、29。例えば、この誘導性Cre系統を遺伝子レポーターと組み合わせることにより、FAPsの系統追跡を行うことができ、この戦略を筋肉および白色脂肪組織におけるFAPsの運命マップに適用することに成功した20,30。リネージュトレースに加えて、これらのCreラインはFAPから脂肪への変換を研究するための貴重なツールを提供します。
FAPの筋肉内脂肪への脂肪生成変換のメカニズムを定義する際の1つの大きな障害は、異なる条件下で形成された筋肉内脂肪の量を厳密かつ再現性よく定量する能力である。重要なのは、筋肉と脂肪組織の保存のバランスを取り、これを脂肪細胞を視覚化するための利用可能な染色方法と一致させることです。例えば、骨格筋はしばしば事前の固定なしにスナップ凍結され、筋線維は保存されるが脂肪細胞の形態を破壊する(図1)。対照的に、固定に続いてパラフィン包埋を行うと、脂肪細胞を含む最良の組織組織学を表示しながら、すべての脂質を除去し、それによって一般的に使用される色素オイルレッドOなどのほとんどの親油性色素を使用不能にする。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig1v2.jpg"> 図1:スナップ凍結した筋肉組織と固定された筋肉組織における筋肉内脂肪の代表的な画像。グリセロール損傷後21日目に脂肪細胞(黄色)、筋線維(灰色)、および核(シアン)内の(B)スナップフリーズおよび(C)固定TAsの両方を示す免疫蛍光画像。スケール バー: 50 μm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig1v2large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ここで説明するプロトコルは、筋線維および脂肪細胞の形態を保持し、複数の細胞型の視覚化および分析を可能にする。このアプローチは、パラホルムアルデヒド(PFA)固定筋肉組織における脂肪細胞の免疫蛍光染色に基づいており、複数の抗体との共染色を可能にします。また、ホールマウントイメージングを使用して、無傷の組織中の筋肉内脂肪を空間的に表示するように容易に適合させることができ、それによって筋肉内の脂肪の細胞微小環境に関する情報を提供する。加えて、このプロトコルは、筋肉の健康状態を評価するための重要な測定値である固定筋肉組織31における筋線維の断面積を決定するために、最近公表された我々のアプローチと組み合わせることができる。このアプローチを遺伝的系統追跡と組み合わせて、脂肪細胞へのFAPの分化を運命マップすることもここで概説されています。したがって、ここで説明する汎用性の高いプロトコルは、組織切片および無傷の組織におけるFAPおよび筋肉内脂肪へのそれらの分化の厳密かつ再現性のある評価を可能にする。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig2v2.jpg"> 図2:概略プロトコルの概要 TAの3分の1を除去し、スナップフリーズし、ホモジナイズして、その後のRNA単離およびRT-qPCR を介した 転写解析を行う組織処理の概略概要。TAの他の3分の2はPFA固定され、凍結切片または全マウント繊維の免疫染色のために処理されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>16% PFA (12 個入りパック、10 mL ボトル)</td><td>Electron Miscroscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 微量遠心チューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>微量遠心チューブ スナップ凍結/ビーズビート用</td></tr><tr><td>2-メチルブタン (4 L)</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3551-4</td><td>isopentane</td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (200 proof)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab fragment ロバ抗マウス</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td>マウスオンマウスブロッキング</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ抗ニワトリ二次抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ抗マウス二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ抗ウサギ二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 ロバ抗ヤギ二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11057</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 ロバ抗ウサギ二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 ファロイジン抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A12380</td><td>1.5 mL メタノール (~66 &micro;BioLite</td></tr> <tr><td>24-well Multidishes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>930186</td><td>PFA組織インキュベーション用24ウェルプレート</td></tr><tr><td>Biometra TOne</td><td>analytikjena</td><td>8462070301</td><td>サーマルサイクラー</td></tr><tr><td>チキン抗GFP抗体</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform/isoamyl alcohol 24:1(v/v) for molecular biology, DNAse, RNAse, and Protease free</td><td>ThermoFisher科学</td><td>AC327155000</td><td></td></tr><tr><td>コーン油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>DAPI染色</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>150 &micro;dH2O</td></tr><tr><td>Donkey Serum (100 mL)</td><td>Millipore Sigma</td><td>5058837</td><td>for blocking solution</td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>Forceps Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>sharp-tiped tweezers</td></tr><tr><td>Fine Scissors Straight 9</td><td>cm Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>封入剤</td></tr><tr><td>グリセロール、99.5%、分子生物学用(500 mL)</td><td>Acros Organics</td><td>327255000</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-PDGFR&alpha; antibody</td><td>R&D</td><td>AF1062</td><td></td></tr><tr><td>タモキシフェン インキュベーション用</td><td>ハイブリダイゼーション オーブン</td><td>VWR</td><td>230301V</td></tr><tr><td>ImmEdge 疎水性バリア PAP ペン</td><td>ベクター ラボラトリーズ</td><td>H-4000</td><td>疎水性ペン</td></tr><tr><td>インスリン シリンジ マイクロファイン IV 針付き (28 G)</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>インスリン シリンジ スリップ チップ付き、1 mL</td><td>BD</td><td>329654</td><td>インスリン シリンジ、経口用gavaging</td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson 獣医</td><td>78938441</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8 倒立顕微鏡</td><td>広視野IFおよび共焦点イメージングに使用される</td><td>ライカ</td><td></td>マイクロ</tr><tr><td>スコープ マイクロスライド</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td>正に帯電した顕微鏡スライド</td></tr><tr><td>マウス抗MYOD抗体</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-41017</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗 PAX7 抗体 (上清)</td><td>DSHB</td><td>AB 428528</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Premier+ ミクロトームブレード</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3052835</td><td>ミクロトームブレード</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 分光光度計</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000</td><td>RNA収量用分光光度計</td></tr><tr><td>Play-Doh</td><td>Hasbro</td><td></td><td>モデリング化合物</td></tr><tr><td>PowerUp SYBR グリーンマスターミックス</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A25742</td><td>グリーン色素 PCR マスターミックス</td></tr><tr><td>Puralube 獣医軟膏</td><td>Puralube</td><td>17033-211-38</td><td>獣医眼科用軟膏</td></tr><tr><td>QuantStudi 6 Flex Real-Time 384-well PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>4485694</td><td>qPCR machine</td></tr><tr><td>ウサギ 抗ペリリピン抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>9349S</td><td></td></tr><tr><td>レッドローターシェーカー</td><td>Hoefer Scientific</td><td>PR70-115V</td><td>IF染色用シェーカー</td></tr><tr><td>リチャード・アラン・サイエンティフィック スリップライトカバー ガラス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>152460</td><td>カバースリップ</td></tr><tr><td>RNeasy ミニキット</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td>ミニスピンカラム</td></tr><tr><td>セーフロックチューブ 1.5 ml、天然</td><td>エッペンドルフ</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>サンプルチューブ RB (2 mL)</td><td>QIAGEN</td><td>990381</td><td></td></tr>ア<tr><td>ジ化ナトリウム</td><td>Alfa Aesar</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼ビーズ、2.8 mm</td><td>プレセリーズ</td><td>KT03961-1-101。BK</td><td>小さなビーズ</td></tr><tr><td>ステンレス鋼ビーズ、5 mm</td><td>QIAGEN</td><td>69989</td><td>中</td></tr><tr><td>ビーズ ステンレス鋼ビーズ、7 mm</td><td>QIAGEN</td><td>69990</td><td>大型ビーズ</td></tr><tr><td>ステンレス鋼使い捨てメス</td><td>Miltex</td><td>327-4102</td><td>メス</td></tr><tr><td>ステンレス鋼供給チューブ、20 G x 38 mm、ストレート</td><td>Instech Laboratories</td><td>FTSS-20S-3</td><td>強制針</td></tr><tr><td>タモキシフェン</td><td>トロント研究化学薬品</td><td>T006000</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュプラスOCTコンパウンド</td><td>フィッシャーヘルスケア</td><td>4585</td><td>埋め込み媒体</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>QIAGEN</td><td>85600</td><td>ビーズビー</td></tr><tr><td>ターTissueLyser LTアダプター、12チューブ</td><td>QIAGEN</td><td>69980</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>さくら</td><td>4566</td><td>標本金型</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 試薬</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596026</td><td>グアニジウム チオシアン酸</td></tr><tr><td>Tween20 (500 mL)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>VWR マイクロ スライド - Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311703</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Coplin 染色ジャー</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6016</td><td>Coplin ジャー</td></tr></tbody></table>

骨格筋における筋肉内脂肪形成とその細胞起源を調べるためのガイド

A Guide to Examining Intramuscular Fat Formation and its Cellular Origin in Skeletal Muscle

線維脂肪原性前駆細胞(FAP)は、骨格筋の恒常性および再生中に重要な役割を果たす間葉間質細胞である。FAPは、分子筋繊維足場として作用する細胞外マトリックスを構築し、維持する。さらに、FAPは筋幹細胞(MuSC)によって感知される多数の有益な因子を分泌するため、筋線維再生に不可欠です。しかし、罹患状態では、FAPは筋肉内脂肪および線維性瘢痕組織の細胞起源である。この脂肪線維症は、サルコペニアおよびデュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの神経筋疾患の特徴である。FAPが筋肉内脂肪に分化する理由と方法を決定する際の重要な障壁の1つは、特に凍結組織切片における脂肪細胞の効果的な保存とその後の視覚化です。スナップ凍結などの骨格筋組織処理の従来の方法は、個々の脂肪細胞の形態を適切に保存せず、それによって正確な視覚化および定量化を妨げる。このハードルを克服するために、骨格筋切片の脂肪細胞形態を保存し、筋肉内脂肪の視覚化、イメージング、定量化を可能にする厳格なプロトコルが開発されました。このプロトコルはまた、RT-qPCRのために筋肉組織の一部を処理する方法を概説し、脂肪生成遺伝子の発現の違いを見ることによって、観察された脂肪形成の変化を確認することを可能にする。さらに、筋肉サンプルの全マウント免疫蛍光によって脂肪細胞を視覚化するように適合させることができる。最後に、このプロトコルは、FAPの脂肪生成変換を研究するために 、Pdgfrα発現FAPの遺伝的系統追跡を実行する方法を概説する。このプロトコルは、RT-qPCRによる確認とともに、脂肪細胞の高解像度で形態学的に正確な免疫蛍光画像を一貫して生成し、筋肉内脂肪の堅牢で厳密で再現性のある視覚化と定量を可能にします。ここで説明する分析パイプラインは、FAPが筋肉内脂肪にどのように分化するかについての理解を深めるための最初のステップであり、脂肪形成を防ぐための新しい介入を検証するためのフレームワークを提供します。

筋肉内脂肪の免疫蛍光可視化 上記のステップおよび図1Aの観察に続いて、グリセロール傷害後21日目から、LN2冷却イソペンタン中で収穫直後にスナップ凍結するか、または4%PFA中で2.5時間固定したTA組織切片を採取した。両方のサンプルを凍結切除および染色した後、TAの最大面積である中腹部で画像を撮影した。非固定TAからのペリリピン+脂肪細胞(図1B)は、固定切片(図1C)と比較して形態を有意に変化させており、それらの同定、可視化、およびその後の定量化をはるかに困難にし、潜在的に不正確である。注目すべきことに、最初のPERILIPIN+脂肪滴は傷害後約5日目に検出され、ほとんどの脂肪細胞は7日目までに形成された。傷害後21日目までに、脂肪細胞は完全に成熟していた。
TAあたりの脂肪量は誘発された傷害の重症度と強く相関するため、筋肉内脂肪形成を効果的に観察および研究するためには、TAを有意に損傷しなければならない。死体TAにインクを使用して注射を練習することは、怪我の重症度を改善するための素晴らしい方法です。成功した怪我は筋肉の50%を超える傾向があります。注意すべきことに、筋肉の損傷領域は、筋線維を欠いている領域、または再生筋線維の既知の特徴である少なくとも1つの中心に位置する核を含む筋線維によって移入される領域を表す。
このプロトコルは、3DにおけるFAPおよび脂肪の染色に容易に適合させることができる。このために、固定後のTAから複数の筋線維を注意深く分離し、続いてホールマウント免疫蛍光を行った。重要なのは、繊維をスライドガラスに適切に固定すると同時に、組織の過圧を避けることです。成形可能な粘土の足を使用することで、ユーザーは必要な厚さを調整し、カバースリップをスライドに固定することができ、倒立顕微鏡の使用も可能になります(図4A)。この方法は、PDGFRα+ FAP、ファロイジン+ 筋線維、およびペリリピン発現脂肪細胞を標識するために首尾よく使用されました(図4B、補足ビデオ1および補足ビデオ2)。厚さが最大150μmの複数のz平面で画像を取得した後、顕微鏡ソフトウェア内の3Dレンダリングモジュールを使用して3D再構成を作成しました。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig4v3.jpg"> 図4:ホールマウント免疫蛍光染色。(A)サンプルのマウント方法と、ホールマウント染色用のカバースリップの追加方法の上面図と側面図。(B)筋線維(灰色)および核(青)とともに、FAPs(緑色;左)および脂肪細胞(赤色;右)の代表的な3D再構成。スケール バー: 50 μm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig4v3large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
筋肉内脂肪の定量化 筋肉内脂肪の画像が撮影されると、ImageJ/FIJIのセルカウンター機能を使用して、PERLIPIN+ 脂肪細胞の数を手動でカウントしました(図5A)。次に、筋線維内の中央に位置する核によって定義される筋肉部および損傷領域の総面積を決定した。傷害重症度を制御するために、脂肪細胞の総数を損傷領域で割って、損傷した筋肉の1mm2 あたりの脂肪細胞の数をもたらした。通常、&lt;30%の傷害を示すTAは定量化から除外されます。脂肪細胞は傷害のない稀であり、断面積当たり0〜8個の範囲であるが、脂肪細胞の総数は依然として総面積によって正常化される。 図5Bで強調されているように、グリセロール損傷は、損傷を受けていないTA筋肉と比較して大量の筋肉内脂肪を引き起こす。あるいは、ペリリピン染色は非常にクリーンで、高い信号対雑音比であるため、 Analyze Particle 関数を使用してペリリピンが占める総面積を決定することもできます。しかしながら、この方法は、より小さい脂肪細胞とより少ない脂肪細胞とを区別することができないであろう。最小4個体の動物から最大3つの切片を画像化および定量化し、マウスあたりに存在する脂肪細胞の平均数を報告した。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig5v2.jpg"> 図5:筋肉内脂肪の定量化 (A)ImageJのセルカウンター機能を用いたペリリピン+ 脂肪細胞(白色)の計数方法の代表画像。スケールバー:50 μm. (B)グリセロール注射後21日目の全TA脂肪細胞定量を、損傷領域の1mm2 に正規化した。各ドットは、1 匹のマウスの平均を表します。エラー バーは SEM として表示されます。**** = p &lt; 0.0001。(c)クロロホルムによるホモジナイゼーションおよびその後の相分離後のRNA層がRT-qPCR分析に使用されている。(d)グリセロール損傷後の異なる時点で、 Pparg および Cepbα、初期脂肪生成遺伝子、ならびに2つの成熟脂肪細胞マーカーである Plin1 および Adipoq の発現レベルのフォールド変化。各ドットは、1 匹のマウスの平均を表します。エラー バーは SEM と表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig5v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
存在する筋肉内脂肪の量を独立して確認するために、種々の脂肪生成マーカーの遺伝子発現レベルを決定することができる。このために、RNAは、損傷後の異なる点で免疫蛍光に使用される同じTA筋肉の一部(上記のステップを参照)から単離することができる。ビーズビーターをチオシアン酸グアニジウムと組み合わせて使用して、組織を均質化した。クロロホルムを加えた後、遠心分離を行い、上部のRNA含有層を注意深く抽出し、RNAクリーンアップにミニスピンカラムを使用した(図5C)。この方法は、RT-qPCRやRNAseqなどのすべての下流分析に適した高品質および量のRNAを日常的に生成します。RT-qPCRについて、ハウスキーピング遺伝子に対する脂肪生成の相対発現レベルを決定し、ΔΔCT法38に従って任意の相対的変化を評価した。 図5Dに記載されるように、損傷を受けていないTA筋肉と比較して、グリセロール傷害は、損傷後3日目に Pparg および Cebpα などの初期の脂肪生成マーカーの発現を誘導する。 アディポネクチン (Adipoq)および ペリリピン (Plin1)などの成熟マーカーは、 グリセロール損傷の5日後という早い時期に検出することができる。
脂肪細胞の遺伝的系統追跡 ここで紹介する脂肪細胞染色プロトコルは、脂肪細胞にマッピングしてその運命をたどるFAPの遺伝的系統追跡を含むように容易に適応させることができる。我々は、例えば、PdgfrαCreERT2におけるタモキシフェン投与を介して組換えが誘導され得ることを以前に実証した。Rosa26EYFPマウスは、損傷の2週間前に、FAPsにおけるEYFP発現のコードおよび不滅に活性化するフロックス停止を効果的に除去した(図6A)。我々は、ここで提示したタモキシフェンレジメンを用いて高い組換え効率を達成し、PDGFRα+ FAPの約75%がEYFP 20を発現し、他の研究室が報告したもの27、39、40と同様である。FAPが実際に筋肉内脂肪の細胞起源であることを実証し、FAPの大部分はグリセロール損傷の7日後にEYFP+ペリリピン発現脂肪細胞に変わった(図6B)。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig6v3.jpg"> 図6:FAPの系統追跡(A)実験セットアップの概略概要。(B)PDGFRα+ FAP(赤、矢印)およびペリリピン+脂肪細胞(赤、アスタリスク)内のEYFP(黄色)の組換えおよび活性化の成功を示す代表的な免疫蛍光画像。スケール バー: 25 μm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig6v3large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
複数の細胞型の検出 このプロトコルはまた、筋原性コンパートメントを視覚化するために使用され得る。PAX7およびMYOD1に対する抗体を用いると、筋幹細胞(MuSC)および筋芽細胞は、それぞれ、PFA固定筋組織切片においてもグリセロール損傷後5日目に容易に検出することができる(図7)。したがって、提示されたプロトコルは、脂肪細胞およびFAPの標識および画像化だけでなく、筋原性系統の他の細胞型にも汎用性および適応可能である。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig7v2.jpg"> 図7:筋幹細胞および筋芽細胞免疫蛍光染色(A)実験セットアップの概略概要。(B)PAX7による筋幹細胞(MuSC)(黄色、左)およびMYOD1による筋芽細胞(黄色、右)の染色の成功を示す代表的な免疫蛍光画像。ラミニンは筋線維(白色)を輪郭を描き、核はシアン色である。スケール バー: 50 μm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig7v2large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ビデオ 1: FAP の 3D レンダリング。 損傷後21日目に、それぞれファロイジン(灰色)、PDGFRα(緑色)、およびDAPI(青色)について染色された筋線維、FAP、および核の3次元再構成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/FAPs.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ビデオ2:筋肉内脂肪の3Dレンダリング。 筋線維束(灰色、ファロイジン)および筋肉内脂肪(赤色、ペリリピン)の体積レンダリングは、グリセロール損傷の21日後に筋線維を置換した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/FAT.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

健康な筋肉組織を筋肉内脂肪で置き換えることは、ヒトの疾患および状態の顕著な特徴である。このプロトコルは、筋肉内脂肪を視覚化、画像化、定量化する方法を概説し、筋肉内脂肪形成の根底にあるメカニズムの厳密な研究を可能にします。

Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) are mesenchymal stromal cells that play a crucial role during skeletal muscle homeostasis and regeneration. FAPs build ...

サルコペニアおよび神経筋疾患の特徴である筋肉内脂肪を研究する上で重要な障壁の1つは、特に凍結組織切片における脂肪細胞の効果的な保存およびその後の可視化である。このプロトコルは、脂肪細胞の形態と骨格筋セクションを保持し、筋肉内脂肪の堅牢で厳密で再現性のある視覚化と定量化を実現します。私たちの分析パイプラインは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの疾患における脂肪形成を防ぐための新しい介入を検証するためのフレームワークを提供します 手順を実証するのは、私の研究室の研究技術者であるコナージョンソンです。まず、消毒するために新鮮なアルコールワイプで注射する脚をきれいにします。30〜50マイクロリットルの50%グリセロールをインスリンシリンジに引き込む。すねの毛をそっとブラッシングして、TAの位置を露出させます。TAの位置を特定したら、足首付近の遠位でTAに針を挿入します。筋肉に完全に針を挿入し、ゆっくりとグリセロールを注入しながら、筋肉の大部分を傷つけるのに役立つ針を徐々に引き抜きます。切除するマウスの任意の領域に70%エタノールを自由にスプレーして、髪を解剖領域や器具から遠ざけます。はさみを使って骨盤の近くの脚の上部の皮膚を切ってください。脚の皮膚を上から足首まで優しく引っ張ります。まず、TAを採取する前に鋭利な先端ピンセットを用いて外側結合組織層を除去する。遠位腱から始めて、筋肉の下からTAの下にあるピンセットをスライドさせ、膝に向かってゆっくりと上に引っ張ります。筋肉の端で止まる。下膝で感じた抵抗を押しのけないでください。下膝に達する前に大きな抵抗がある場合は、停止して結合組織の残りの層を除去し続けます。ピンセットでTAを脚から部分的に持ち上げたら、メスで同じ動きをして、TAと下膝の接続を切断します。足首の腱をはさみで腸に入れ、TAを完全に取り除きます。繊維を傷つけないように、腱の筋肉だけを扱います。最後にTAの3分の1を切断し、腱の反対側に切る。それをマイクロ遠沈管に入れ、液体窒素に滴下してスナップフリーズします。組織の残りの3分の2を組織学のために4%PFAで標識されたウェルに沈める。最初と最後の組織が固定液に入れられた時期を必ず追跡してください。摂氏4度で2〜2時間半栄養剤の上に置きます。固定後、PFAをウェルから除去する。冷たい1つのX PBSで組織を2〜3回すすぎ、冷たい1X PBSで2〜3回、1回の洗浄につき5分間洗浄します。PBSをウェルから取り出し、組織が浮遊できるように1X PBSに十分な30%スクロースを加える。一晩4°Cでヌーテーターの上に置きます。顕微鏡の電源を入れ、イメージングソフトウェアを起動します。スライドをステージに固定します。任意のチャンネルを使用して、画像化する領域を識別します。イメージングソフトウェアで、各チャンネルのゲインと露光時間を調整します。各チャンネルの組織全体の画像を撮影し、個々のタイルをマージして、完全なTA断面の合成を作成します。開始する前に、RNaseフリーウォーターを摂氏45度に予熱し、新鮮な70%エタノールを準備します。1000マイクロリットルのチオシアン酸グアニジニウムを試料を含む各チューブに加える。ビーズビーター承認のチューブが使用されていることが重要です。3つのミディアムビーズ、または1つの大きなビーズと1つの小さなビーズを各チューブに追加します。ビーズビーターを使用して、組織を50ヘルツで2〜4分間均質化します。組織の種類とサンプルサイズによっては、最大10分かかる場合があります。200マイクロリットルのクロロホルムを加える。サンプルを15秒間振る。室温で2〜3分間インキュベートする。350マイクロリットルの透明な上清をG.Pipetteで12,000回G.ピペットで15分間遠心分離し、350マイクロリットルの70%エタノールを含む新しいマイクロ遠心管に加える。下のタンパク質および/またはDNA層を吸引しないように注意してください。この混合物の最大700マイクロリットルを、2ミリリットルの収集管に入れたミニスピンカラムに移す。製造元の指示に従って RNA 単離を続行します。期待される収量に応じて、30〜50マイクロリットルのRNase自由水で溶出する。RNAを氷上に保ち、分光光度計を使用して収率を測定します。RNAはマイナス80°Cに保管してください。メーカーの指示に従って、cDNA合成キットでcDNAを合成するには、最大1マイクログラムのRNAを使用してください。実行が完了したら、80マイクロリットルのRNase自由水を加えます。サンプルをマイナス 20 °C で保管します。384ウェルフォーマットを使用して、各ウェルの底に1マイクロリットルのプライマーを加える。遊離乾燥プライマーは、よりタイトな技術的複製をもたらす。プライマーが完全に蒸発するまで覆ったままにしておきます。4 ~ 8 回のテクニカル反復でサンプル反応を設定します。PCRの実行が完了したら、生サイクルの閾値をハウスキーピング遺伝子レベルに正規化し、デルタデルタCt.ペリリピンを計算することによってフォールドの変化を決定し、固定されていないTAからの陽性脂肪細胞は固定切片と比較して形態を有意に変化させ、それらの同定、可視化、およびその後の定量化をはるかに困難かつ潜在的に不正確にする。対照的に、PFA固定は脂肪細胞の形態を維持し、筋肉内脂肪の正確な検出を可能にする。損傷を受けていないTA筋肉と比較して、グリセロール損傷は、損傷後3日以内の早期にPPARガンマおよびCEBPアルファなどの早期脂肪生成マーカーの発現を誘導する。アディポネクチンやペリリピンなどの成熟マーカーは、グリセロール損傷の5日後にも検出できます。遺伝子系統追跡を用いて、PDGF受容体アルファFAPの大部分は、系統マーカーEYFPを発現する。グリセロール損傷から7日後、EYFP陽性FAPは脂肪細胞を発現するEYFP陽性ペリリピンに変わり、FAPが実際に筋肉内脂肪の細胞起源であることを実証した。このプロトコルはまた、筋原性コンパートメントを視覚化するように適合させることができる。PAX7およびMYOD1に対する抗体を用いて、筋肉幹細胞および筋芽細胞マーカーは、それぞれ、PFA固定筋肉組織切片においても、グリセロール損傷の5日後に容易に検出することができる。このプロトコルはまた、脂肪細胞および他の成体組織を視覚化および定量化するために適合させることができる。さらに、当社の組織保存技術は、さまざまなスタンディング技術と互換性があります。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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骨格筋中の脂肪滴含量の線維タイプおよび細胞下特異的分析

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新生仔マウスの肩甲間脂肪組織の間質血管画分からの褐色脂肪細胞の分化とイメージング

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脱細胞化による骨格筋脂肪浸潤の定量化

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Longissimus Muscleの探索:Bos indicusと交雑種の雄牛の肉質との相関関係を解き明かす

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ゼブラフィッシュは、筋肉の機能と病気を研究するための優れたモデルです。初期胚形成期には、ゼブラフィッシュは規則的な筋肉収縮を開始し、リズミカルな遊泳行動を生み出し、筋肉が乱れると遊泳行動が変化します。ここでは、筋肉機能の尺度として水泳パフォーマンスを調べるための、タッチ誘発反応と運動アッセイについて説明します。...

ゼブラフィッシュで筋肉のパフォーマンスと機能を評価するためにタッチ誘発応答と歩行アッセイを使用して

学ぶ筋肉内脂肪の可視化と定量化の手法。グリセロール損傷モデルを用いて骨格筋における脂肪細胞の形態を保存し、筋萎縮症などの疾患における脂肪形成メカニズムを解明するための実験プロトコルです。

骨格筋における筋肉内脂肪形成とその細胞起源を調べるためのガイド

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