Name: 下流アプリケーションのための異なる脂肪デポからの血管内皮細胞の分離と同定(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学ぶマウスの脂肪デポから血管内皮細胞を分離・同定する手法。フローサイトメトリーでCD31陽性CD45陰性細胞を特定し、血管細胞生物学と機能異常のメカニズム解明に活用できます。

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優秀な科学者、同僚、そして親愛なる友人であるリッチウェストの愛情のこもった思い出の中で。デラウェア大学フローサイトメトリーおよびバイオイメージングコアは、デラウェアバイオテクノロジー研究所の一部として、私たちの研究への継続的な貢献に感謝します。また、原稿の慎重なレビューと編集をしてくれたエマ・ハジンズにも感謝します。私たちの研究は、国立総合医学研究所P20GM113125-6564(I.S.ファンチャー)によってサポートされています。このプロジェクトは、国立衛生研究所とデラウェア州(I.S.ファンチャー)からのNIGMS(P20GM103446)からの助成金、およびデラウェア大学総合大学研究助成金(I.S.ファンチャー)によるデラウェアINBREプログラムによってもサポートされました。この内容は著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。

これらの研究における動物の使用は、デラウェア大学、施設動物管理および使用委員会(#1372)によって承認されました。
1.組織の解剖と洗浄
注:ビデオプロトコルでは、10〜12週齢のC57BL / 6Jマウスが使用されます。組織解剖と動脈洗浄の概略図と望ましい結果については 図1 を、消耗品のリストとメーカー情報については 材料表 を参照してください。
<ol><li>マウスをCO2 窒息とそれに続く頸部脱臼によって安楽死させる。</li>
	<li>解剖ピンを使用してマウスを固定し、腹面に70%エタノールをスプレーします。</li>
	<li>各後肢に位置する皮下脂肪組織の分離 注:必要な解剖ツール:まっすぐなボンはさみ(9 cm)と鈍い湾曲したグレーフェ鉗子。<ol><li>鉗子を使用して、性器の真上に皮膚を持ち上げ、皮膚を小さく(2 mm)切開します。</li>
		<li>はさみの先端を切開部位に挿入し、最初の切開から始めて胸骨の基部まで頭蓋状に解剖して、4〜5 cmの正中線切開を行います。腹腔内に侵入しないように注意してください。</li>
		<li>前肢のすぐ下の正中線から横方向に伸びる1 cmの横切開を行います。</li>
		<li>後肢と性器の間に斜めに1cmの切開を行います。</li>
		<li>正中線の皮膚切開に沿って小さな切り込みを入れて、関連する結合組織を剥がし、皮下脂肪デポを露出させます。皮膚をピンで留めます。</li>
		<li>腹腔に垂直に走る「C字型」の皮下脂肪組織と動脈/静脈を特定します。</li>
		<li>性器近くのC字型の下から始めて、脂肪組織をそっとつかんで結合組織を露出させます。結合組織に小さな切り込みを入れて、脂肪を皮膚から分離します。露出した血管系を乱さないでください。</li>
		<li>皮下脂肪組織が無傷で除去できるようになるまで、結合組織を解剖し続けます。露出した動脈を周囲の結合組織から慎重に分離します。</li>
		<li>単離した皮下脂肪を、目的の血管床を単離する準備ができるまで氷上のHEPESバッファーに保存します。</li>
		<li>手順 1.3.3.-1.3.5 を繰り返します。残りの後部皮下脂肪デポ用。</li>
	</ol></li>
	<li>腸間膜脂肪デポーの分離 注意: 必要な解剖ツール:ストレートボンはさみ(9 cm)、Graefe鉗子、#5鉗子のペア、ストレートアイリスハサミ、および湾曲したボンハサミ(9 cm)。<ol><li>Graefe鉗子を使用して、膀胱の上の薄い腹膜腔壁を持ち上げ、まっすぐなハサミを使用して小さな切開を行います。</li>
		<li>貫通した腹膜腔壁をゆっくりと持ち上げ、まっすぐな虹彩はさみを切開部位に慎重に挿入し、膀胱から胸骨まで4〜5 cmの切開を行います。</li>
		<li>まっすぐな虹彩はさみで長さ1 cmの水平切開を2回行い、正中線から後肢のすぐ上、前肢の下まで横方向に伸びます。Graefe鉗子を使用して腹部の筋肉組織を剥がし、腹膜内臓を露出させます。</li>
		<li>手順 1.4.3 を繰り返します。反対側に。</li>
		<li>#5鉗子のペアを使用して腸を内臓腔から持ち上げ、腸間膜脂肪を明らかにします。</li>
		<li>湾曲したはさみと#5鉗子を使用して、盲腸から結腸が視界から下降する場所まで、結腸に沿って脂肪を分離します。</li>
		<li>盲腸に戻り、湾曲したハサミと#5鉗子を使用して、小腸に沿って脂肪を膵臓に分離します。膵臓のごく一部を取り除き、腸間膜脂肪を完全に分離します。 注意: 腸間膜脂肪と一緒に膵臓のごく一部を取り除くと、洗浄中の安定性が得られるため、動脈の洗浄に役立つ場合があります。</li>
		<li>分離された腸間膜脂肪を、腸間膜動脈を分離する準備ができるまで氷上のHEPESバッファーに保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>皮下および腸間膜脂肪組織からのそれぞれの動脈の分離 注意: 必要な解剖ツール:光源付きの解剖皿とステレオスコープ、#55鉗子のペア、および#5鉗子のペア。<ol><li>~10 mLの冷たいHEPESバッファーを解剖皿に入れ、#5鉗子を使用して脂肪組織を皿に移します。</li>
		<li>ステレオスコープを1倍の倍率で使用して脂肪組織を表示および配置し、動脈と静脈のペアを露出させます(図2)。</li>
		<li>#55鉗子を使用して、実質脂肪を動脈から慎重に取り除きます。一度に脂肪の小片を取り除き、ステレオスコープの下で動脈/静脈のペアを注意深く観察して、目的の血管系を特定して損傷しないようにします。 手記： それに応じて倍率と光源を調整して、動脈をきれいにします。倍率と光の強度を上げて、脂肪が除去されるときに動脈をよりよく見ます。動脈の細かい洗浄は、4x〜5xの倍率で行う必要があります。結合組織(コラーゲン)、静脈、動脈を区別することが重要です。結合組織およびコラーゲン繊維は、枝のない紐状の外観を有し、縞模様であり、そして白っぽい色を有する。コラーゲン繊維や結合組織とは異なり、動脈や静脈は透明で、内腔が定義された複数の枝があります。小動脈と静脈は、実質組織がない場合、外観が似ているように見える場合があります。内腔内の血液の存在は、静脈から動脈を識別するのにさらに役立ちます。静脈は血管壁が薄く、内腔が大きく、同等のサイズの動脈と比較してより多くの血液を含んでいます。</li>
		<li>手順 1.5.3 を繰り返します。動脈から実質脂肪組織が完全になくなるまで。</li>
		<li>#5鉗子を使用して、洗浄した動脈を新鮮なHEPESバッファーを含む新しいチューブに移し、消化の準備ができるまで氷上に保ちます。</li>
	</ol></li>
</ol>2.内皮細胞の単離のための単離動脈の消化
注:内皮細胞の組織消化と分離の概略図については 図2 を、プロトコルに必要な消耗品の完全なリストについては 材料表 を参照してください。
<ol><li>ディスパーゼとエラスターゼを各2 mLの微量遠心チューブにそれぞれ1 mg加えます。.各チューブに2 mLの解離溶液を追加します。ボルテックスし、完全に溶解するまで37°Cでインキュベートします。#5鉗子を使用して、洗浄した動脈をそれぞれのサンプルチューブに移します(ステップ1.5.5.)。各酵素の最終濃度は0.5 mg/mLです。</li>
	<li>酵素と動脈の間の一貫した均一な接触を維持するために、動脈が溶液に懸濁されるように、10〜15分ごとに反転による穏やかな攪拌を行いながら、37°Cで1時間インキュベートします。</li>
	<li>サンプルあたり1 mgのコラゲナーゼI型を計量し、新しいチューブに追加します。</li>
	<li>動脈がチューブの底に落ち着くようにします。動脈を乱さずに500 μLのバッファーを上部から取り除き、コラゲナーゼを含む指定チューブに移します。ボルテックスし、溶液を元のサンプルチューブ内のそれぞれのサンプルに戻します。I型のコラゲナーゼの最終濃度は0.5 mg/mLです。</li>
	<li>37°Cで15分間インキュベートします。サンプルチューブを短時間振った後、動脈が細かくなることを確認します。摂動後に動脈が断片に分離しない場合は、動脈の破壊が見えるまで5分刻みでインキュベートします。.</li>
	<li>ガラスピペットを使用して、消化された組織を10x〜15x激しく粉砕し、細胞を機械的に解離させる。</li>
	<li>溶液と消化組織を70 μmのセルストレーナーまたはフローサイトメトリーチューブストレーナーに通して、単一細胞懸濁液を取得します。</li>
</ol>3. フローサイトメトリー前の内皮細胞の染色
注:内皮細胞の染色と処理は、指示がない限り、細胞の生存率を改善するために氷上で行われます。5 mLポリスチレン丸底チューブを1,163 x g で室温(RT)で3分間遠心分離します。
<ol><li>単一細胞懸濁液を1,163 x gでRTで3分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を除去し、細胞ペレットを1 mLのPBS + 5%BSAにRTで30分間再懸濁します。 注:研究者は、細胞の種類、目的のターゲット、および使用する抗体に応じてFC受容体をブロックすることを検討する必要があります18,19。</li>
	<li>1 μLの細胞生存率染色剤(405 nm励起)(材料表)を加え、暗所でRTで30分間インキュベートします。</li>
	<li>細胞懸濁液を1,163 x g でRTで3分間遠心分離し、細胞ペレットを200 μLのPBS + 1%BSAに再懸濁します。</li>
	<li>サンプルに、CD31(CD31-PE、0.75 μg/サンプル)およびCD45(CD45-FITC、2.5 μg/サンプル)に結合した一次抗体を加え、サンプルをアルミホイルで覆った後、冷蔵庫のロッカーで15分間インキュベートします。 注:内皮細胞の純粋な集団を同定および/または取得するには、明確な励起/発光蛍光を有するCD31およびCD45結合一次抗体およびCD31+CD45−発現プロファイルを有するゲート/ソート細胞を使用して、CD31およびCD45の両方をプローブします。使用する蛍光色素によっては補正が必要な場合があります18,20,21。</li>
	<li>1 mLのPBS + 1%BSAを細胞懸濁液に直接加えて細胞を洗浄します。</li>
	<li>細胞懸濁液を1,163 x g でRTで3分間遠心分離し、上清を除去し、0.1%BSAを含む1%ホルムアルデヒド200 μLに再懸濁します。フローサイトメトリーの準備ができるまで、アルミホイルで覆われた冷蔵庫に保管してください。 注:洗浄と遠心分離のステップを減らすことで、細胞収率が向上します。これらは、結果のアプローチに応じて変更する必要があるかもしれません。固定液中のサンプルは24時間以内に分析する必要があります。</li>
</ol>

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</ol>

著者には利益相反はありません。

内皮機能障害は重篤な疾患状態の前兆であり、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脳卒中の発症を促進する可能性があります3,23。所与の病的状態における内皮機能障害の根底にある同定されたメカニズムは多数あるが、別個の血管床は病的状態によって異なる影響を受ける可能性が高い4,24。さらに、異なる心血管危険因子(例えば、肥満、高血圧、脂質異常症、喫煙、糖尿病)は、様々な異なるメカニズムを通じて機能障害を誘発する23,25。したがって、疾患の確立された動物モデルまたはアクセス可能なヒト組織から内皮細胞集団を分離し、in vivo環境から直ちに除去された細胞に対してアッセイを実行することが重要です。この方法で細胞を単離することは、培養中の細胞を研究するよりも、培養によって誘発される表現型の変化がないという点で独自の利点があります5,6。さらに、不均一な内皮細胞集団を含む、インビボ26、27で観察されるように(フローアシスト細胞ソーティングを用いてさらに分離することができることと)、生きている生物からインビボ環境によりよく知らせる。最後に、この方法は、多数の動物モデルおよび潜在的にヒト組織の調査に適用可能であり、そのような必要性が正当化される場合、初代細胞培養株を生成するために使用することができる。
このプロトコルの重要なステップ、およびここに提示されていないさまざまな血管床または細胞タイプに対して最も調整する必要があるステップは、血管組織の消化です。このステップは、細胞収量を低下させることなく、細胞の健康状態に合わせて最適化する必要があります。使用する特定の酵素と消化期間は、細胞の健康状態と収量を最適化してダウンストリームアッセイを適切に実行できるようにするために重要です。皮下および腸間膜内皮細胞におけるフローサイトメトリーによって検出されるように、CD36の膜発現の同定のために(図4)、パッチクランプ電気生理学28 のために最初に設計された消化プロトコルの修正バージョンが開発されました。これには、パッチクランプ研究に必要なフローサイトメトリーの要求をよりよく満たすために細胞収量を増やすために、コラゲナーゼIの消化時間を30分に延長することが含まれていました。この改変は細胞の健康にある程度影響を与える可能性があるため、フローサイトメトリー解析では細胞生存率染色剤を使用し、このプロトコルに従って生存可能な内皮細胞のみが評価されるようにしました(図3)。血管組織から細胞を単離することを目的とした研究では、望ましいアプローチを評価する前に、細胞生存率のマーカーを含めることをお勧めします。
記載されたプロトコルは、マウス由来の≤1mgの動脈サンプルから分析および下流アプリケーションのための生存可能な内皮細胞を遊離するのに十分である。ただし、目的の動脈を異なる組織または生物(ヒトなど)から分離し、動脈質量を大幅に異なる場合、目的の細胞集団を効率的に分離するために、消化酵素含有量とインキュベーション期間を最適化する必要があります。ここで提示された皮下および腸間膜床よりもさらに少量の開始組織で始まるいくつかの血管床(例えば、冠状動脈)では、サンプルごとに数匹のマウスからの動脈のプールが必要な場合があります。.実際、これは、アウトカムアプローチが比較的高い細胞収量を必要とすることを考えると、任意の血管床にとって必要なステップであり得る。主な制限は、サンプル消化ごとのばらつきの性質上、同じ血管床からの場合でも、細胞収量がバッチ間で大幅に異なる場合があることです。これは、データの分析時に問題を引き起こす可能性があるため、必要に応じて正規化を使用して考慮する必要があります。たとえば、CD36の発現は、皮下脂肪動脈と腸間膜脂肪動脈の個々のサンプルにわたる細胞収量の変化により、生データで非常に変動しました。したがって、生データは、この方法がバッチの違いを補正すると仮定して、CD31+CD45-平均蛍光強度に正規化されました(図4)。もちろん、アプローチによっては、より高度な統計分析と正規化方法が必要になる場合があります。
要約すると、この論文は、マウスの皮下動脈と腸間膜動脈を解剖、分離、消化して、目的の内皮標的の発現および/または機能を調べる方法を提示します。提示されたプロトコルを変更することで、異なる血管床および細胞型(例えば、平滑筋細胞)を調査することができる。このプロトコルは、利用可能な多数の実験的アプローチの基礎として、血管細胞生物学および血管機能障害のメカニズムの理解を前進させる可能性を秘めています。

内皮細胞は、バリア機能、血管新生、血管緊張調節など、さまざまな生理学的プロセスにおける重要な役割でよく認識されています1,2。内皮細胞機能障害は、アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病などの促進において十分に文書化されているが、内皮機能障害を引き起こす根本的なメカニズムは十分に理解されていないままであり、異なる血管床間で異なる可能性が高い2、3、4。内皮細胞機能不全のこれらの病理学的メカニズムを解明する努力は、組織からの内皮細胞の純粋な集団へのアクセスが制限されていること、および/または培養中の内皮細胞の表現型変化によって挑戦されています5,6。したがって、さまざまな血管床から内皮細胞を天然の形で分離して分析を実行できることで、心血管疾患のプロセスに関する洞察が得られます。
このプロトコルは、マウスから皮下脂肪組織および腸間膜脂肪組織を解剖し、続いてそれぞれの動脈血管系を分離する手順を示しています。動脈壁を覆う機能的に生存可能な内皮細胞は、酵素の特定のカクテルを使用して遊離されます。分析のために生体分子マーカーを無傷に保ちながら、<1 mgの出発組織から内皮細胞の十分な収量を得るために、消化プロトコルの条件を最適化するために特別な注意が払われました。単離された内皮細胞は、次にフローサイトメトリーを用いて同定されます。CD31(PECAM)の存在は、主に内皮細胞を同定するために使用されます。CD45も発現する造血起源のいくつかを含む他の細胞型におけるCD31の発現に起因して、単離された内皮細胞の純度は、CD31およびCD45の両方を発現する細胞の排除によってさらに増強された5、6、7、8。さらに、研究課題と採用するダウンストリームアプリケーションに応じて、研究者は、目的の細胞集団の純度を最適化するために、ポジティブおよびネガティブの選択マーカーの広範なパネルを選択することを検討する必要があります。
脂肪デポー動脈を解剖して単離する技術は、以前の出版物9,10,11,12,13で使用されてきたが、埋め込まれた動脈の単離を記述する詳細なプロトコルはまだ提示されていない。特定の対象種の異なる血管床からの動脈の単離および消化の技術を実証することは、研究者が関心のある動脈から新たに分離された血管細胞を評価し、特定の細胞タイプに対して幅広い機能試験を実行することを可能にするオプションを提供します。検査には、細胞選別および膜タンパク質発現のためのフローサイトメトリー5,8、イオンチャネル活性のための電気生理学9、分子プロファイリング(プロテオミクス/ゲノム解析など)が含まれますが、これらに限定されません。14、15、およびインビトロでの薬物スクリーニングのための初代細胞株の作製16、17。

<table><tbody><tr><td>組織解剖ツール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5鉗子 (2)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-00</td>腸<td>間膜脂肪デポと動脈の分離用</td></tr><tr><td>55鉗子移植 (2)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11295-51</td>実<td>質脂肪除去用</td></tr><tr><td>カーブボンハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14061-10</td><td>の分離用腸間膜脂肪デポ</td></tr><tr><td>Graefe鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11051-10</td><td>皮下脂肪デポの一般的な解剖ステップと分離用</td></tr><tr><td>ストレートボンシザー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14060-09</td><td>一般的な解剖ステップと皮下脂肪デポの分離</td></tr><tr><td>光源付きステレオスコープ</td><td>Laxco</td><td>Z230PT40</td><td>実質脂肪の除去と動脈の分離用</td></tr><tr><td> 動脈消化のための消化酵素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼI型</td><td>Wothington-BioChem</td><td>LS004194</td><td></td></tr><tr><td>Dispase(中性プロテアーゼ)</td><td>Wothington-BioChem</td><td>LS02110</td><td></td></tr><tr><td>Elastase</td><td>Wothington-BioChem</td><td>LS002292</td><td></td></tr><tr><td>Solutions Recipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES緩衝液、pH 7.4</td><td></td><td></td><td>最終濃度</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>J.T.Baker</td><td>1332-1</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>デキストロース(D-グルコース)無水</td><td>フィッシャー</td><td>D16-500</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td> フィ<td>ッシャー</td><td>BP310-500</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td> フィ<td>ッシャー</td><td>M33-500</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャー</td><td>P217-500</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>オキソイド</td><td>LP0005</td><td>145 mM</td></tr><tr><td>解離液、pH 7.30-7.40</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>デキストロース (D-グルコース) 無水</td><td>フィッシャー</td><td>D16-500</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td> フィ<td>ッシャー</td><td>BP310-500</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>塩化</td><td>マグネシウムFisher</td><td>M33-500</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>56 mM</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Oxoid</td><td>LP0005</td><td>55 mM</td></tr><tr><td>L-グルタミン酸ナトリウム 一水和物</td><td>TCI</td><td>G0188</td><td>80 mM</td></tr><tr><td>Flow Cytometry Analyses</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL ポリスチレン丸底チューブ、セルストレーナーキャップ</td><td>付きファルコン</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>CD31-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-119-653</td><td>0.75&micro;g/sample</td></tr><tr><td>CD36-APC</td><td>R&Dシステムズ</td><td>AF2519</td><td>2.5&micro;g/サンプル</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>BioLegend</td><td>103108</td><td>2.5&micro;g/ sample</td></tr><tr><td>Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain)</td><td>Invitrogen</td><td>L34955</td><td>1&micro;L /サンプル</td></tr></tbody></table>

下流アプリケーションのための異なる脂肪デポからの血管内皮細胞の分離と同定(英語)

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

血管系の壁を覆う血管内皮細胞は、血管緊張調節、バリア機能、血管新生など、さまざまな生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。内皮細胞機能障害は、重篤な心血管疾患の進行の特徴的な予測因子および主要な推進力ですが、根本的なメカニズムは十分に理解されていません。さまざまな血管床から内皮細胞を天然の形で分離して分析する機能により、心血管疾患のプロセスに関する洞察が得られます。このプロトコルは、マウスの皮下脂肪組織および腸間膜脂肪組織の解剖の手順を示し、続いてそれぞれの動脈血管系を分離します。次に、単離された動脈は、機能的に生存可能な内皮細胞の遊離に焦点を当てた消化酵素の特定のカクテルを使用して消化されます。消化された組織は、内皮細胞同定の陽性のマーカーとしてCD31+/CD45−細胞を用いたフローサイトメトリー分析によって評価されます。細胞は、即時下流の機能アッセイのために選別することも、初代細胞株の生成に使用することもできます。異なる血管床から動脈を分離および消化する技術は、研究者が関心のある動脈から新たに分離された血管細胞を評価するためのオプションを提供し、特定の細胞タイプに対して幅広い機能試験を実行できるようにします。

ワークフローの概略図を図 1 に示します。回路図は、プロトコルテキストでより詳細に説明されているプロトコルステップを強調しています。図2は、実質組織の解剖後の皮下脂肪(図2A、左)と皮下動脈アーケード(図2A、右)の写真を示しています。図2は、解剖後の腸間膜脂肪(図2B、左)および実質組織の洗浄後の腸間膜動脈アーケード(図2B、右)も示しています。
ここで紹介するプロトコルは、a)基礎科学アプローチおよび/または疾患モデルにおける異なる脂肪デポー血管系ベッドの比較、b)ダウンストリームアプリケーション用の目的の血管細胞の単離前の血管床の消化、およびc)目的の血管細胞を特定するためのフローサイトメトリーの使用に関心のある研究者を支援するように設計されています(図3)は、ここで実行されるタンパク質発現解析を含むがこれらに限定されないさまざまなアプリケーションに対応します(図4)。図3は、フローサイトメトリーを用いて消化されたマウス動脈から内皮細胞を同定する我々のアプローチの例を詳述しています。消化された皮下(図3A)または腸間膜(図3B)脂肪動脈から得られた細胞調製物を、他の場所で同様に行われたように、フローサイトメトリーを使用して生存可能なCD31+CD45-内皮細胞の固定および同定の前に、CD31-PE、CD45-FITC、および細胞生存率色素で染色しました8。細胞生存率染色により、固定前に単離および消化プロトコルを生き延びた生存細胞のみを同定することができました。この方法を使用すると、研究者は目的の生細胞または機能を評価できます。
異なる脂肪デポー血管系から単離された内皮細胞が膜タンパク質発現に違いを示すかどうかを判断するために、単離された細胞を脂肪酸トランスロカーゼCD36(図4)について調べました。.したがって、例えば、異なる血管床における膜CD36間の相対的な発現差を決定することは、a)異なる組織間の脂肪酸利用の異なる選好に関する既存のデータを支持し、および/またはb)健康および疾患における脂肪酸の組織分布における潜在的な新規差異を明らかにする可能性がある。図3に例示した消化血管細胞の同じ調製物から、皮下脂肪(図4A)および腸間膜(図4B)脂肪においてCD31+CD45−CD36+内皮細胞を同定し、各血管床におけるこの集団におけるCD36発現を定量化した。図4Cおよび図4Dは、CD36を発現する内皮細胞の割合およびCD36発現の強度の両方が、腸間膜内皮細胞で観察されたものと比較して皮下内皮細胞において大きいことを明らかにしている。これらの予備的な知見は、血管床間の明確な違いを特定するための我々の方法論の使用を裏付けるものである。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63999/63999fig01.jpg"> 図1:下流アプリケーションのために皮下脂肪組織および内臓脂肪組織から内皮細胞を単離するための作業スキーム 。 (A)10-12週齢のC57BL/6Jマウスを安楽死させ、この手順を実証するために使用した。(バイ)まず、皮下脂肪を取り除きます。(ビイ)その後、腸間膜(内臓)脂肪組織が除去されます。白い破線は、解剖および除去後の皮下(左)および腸間膜(右)脂肪蓄積の位置を示しています。それぞれの動脈は、下流のアプリケーションのために分離されています。(C)このプロトコルでは、単離された動脈は、機能的に生存可能な内皮細胞を遊離する最初のステップとして、特定の酵素カクテルを使用して次に消化されます。(D)単離された内皮細胞は、フローサイトメトリー分析の前に、結合抗体を使用してCD31+およびCD45-細胞をプロービングすることによって同定されます。発現プロファイルがCD31+/CD45− の細胞は、追加の解析に関心のある内皮細胞です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63999/63999fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63999/63999fig02.jpg"> 図2:単離された皮下脂肪組織と内臓脂肪組織、およびそれぞれの動脈 。 (A)左:後肢から単離された「C字型」皮下脂肪組織。実質脂肪を除去すると、矢印(1)で示される皮下脂肪動脈の主要な枝が明らかになります。右:孤立した皮下脂肪動脈。(B)左:腸間膜(内臓)脂肪組織は腸から分離されています。右:実質組織を除去することにより、それぞれの動脈アーケードを分離する。脂肪(5 mm)と動脈(1 mm)の写真の間で異なるスケールが使用されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63999/63999fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63999/63999fig03.jpg"> 図3:フローサイトメトリーによる動脈組織消化後の内皮細胞の同定。 単離された(A)皮下または(B)腸間膜脂肪動脈から遊離した細胞を示す代表的なプロット。細胞は、固定前にCD31(PE)およびCD45(FITC)の細胞外エピトープを標的とする結合抗体に曝露された。フローサイトメトリーを使用して、CD31+CD45−内皮細胞集団を同定しました。細胞生存率染色を使用して、その後の分析のために単離および消化プロトコルを生き残った細胞のみを選択しました。さらに、この段階での適切なゲーティングは、目的の細胞タイプのサイズがわかっている場合、意図した細胞集団を汚染細胞からさらに分離します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63999/63999fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63999/63999fig04.jpg"> 図4:フローサイトメトリーによる皮下脂肪細胞と腸間膜脂肪動脈内皮細胞におけるCD36膜発現の分析。 代表的な集団プロットおよび(A)皮下または(B)腸間膜脂肪動脈における内皮CD36(APC)膜発現を示すヒストグラム。(C)皮下ECと腸間膜ECでCD36を発現する内皮細胞(EC)の割合(n = 5、男性3人、女性2人、*p &lt; 0.05 スチューデントのt検定後)。(D)皮下脂肪動脈と腸間膜脂肪動脈における正規化されたEC膜CD36発現(n = 5、男性3人、女性2人、* p &lt; 0.05 スチューデントのt検定後)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63999/63999fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、マウス脂肪デポーの解剖および内皮細胞集団を遊離させてから同定するためのそれぞれの動脈の単離および消化のための方法を詳述する。ダウンストリームアプリケーションで使用される新たに単離された細胞は、血管細胞生物学と血管機能障害のメカニズムの理解を促進します。

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

このプロトコルにより、研究者は目的の動脈を解剖し、血管細胞を分離して幅広い機能テストを実行できます。研究者は、さまざまな血管床と細胞タイプを調査して、血管細胞生物学と血管機能障害のメカニズムの知識を広げることができます。この方法は、基本的な血管細胞生物学、および疾患の動物モデルにおける血管細胞機能障害を調査する研究者に最も適しています。消化プロトコルを最適化するために特別な注意を払う必要があります, 特に関心のある血管床がここに示されているものと異なる場合.まず、解剖ピンを使用してマウスを固定し、腹面に70%エタノールをスプレーします。鉗子を使用して性器の真上に皮膚を持ち上げ、皮膚を約2ミリメートルの小さな切開を行います。ハサミの先端を切開部位に挿入し、最初の切開から始まり、胸骨の付け根まで頭蓋状に解剖する4〜5センチの長さの正中線切開を行います。前肢のすぐ下の正中線から横方向に伸びる1センチメートルの切開を行います。後肢と性器の間に斜めの1センチの切開を行います。正中線の皮膚切開に沿って小さな切り込みを入れて、関連する結合組織を剥がし、皮下脂肪デポを露出させます。C字型の皮下脂肪組織と腹腔に垂直に走る動脈または静脈を特定します。性器近くのC字型の底から始めて、脂肪組織をそっとつかんで結合組織を露出させます。結合組織に小さな切り込みを入れて脂肪を皮膚から分離し、露出した血管系を乱さないようにします。皮下脂肪組織が無傷で除去できるようになるまで、結合組織を解剖し続けます。露出した動脈を周囲の結合組織から慎重に分離します。単離した皮下脂肪を氷上のHEPESバッファーに保存する。残りの後部皮下脂肪デポについて解剖を繰り返します。腸間膜脂肪デポを隔離するには、Graefe鉗子を使用して膀胱の上の薄い腹膜腔壁を持ち上げ、まっすぐなハサミを使用して小さな切開を行います。腹膜腔壁をゆっくりと持ち上げ、まっすぐな虹彩はさみを切開部位に挿入します。膀胱から胸骨まで4〜5センチの切開を行います。次に、正中線から後肢のすぐ上、前肢の下まで横方向に伸びるまっすぐな虹彩はさみで、1センチメートルの水平切開を2回行います。Graefe鉗子を使用して腹部の筋肉組織を剥がし、腹膜内臓を露出させます。5番の鉗子のペアを使用して腸を内臓腔から持ち上げ、腸間膜脂肪を明らかにします。湾曲したハサミと5番の鉗子を使用して、盲腸から結腸が視界から下降する場所まで、結腸に沿って脂肪を分離します。次に、小腸に沿って脂肪を膵臓に分離します。膵臓のごく一部を取り除き、腸間膜脂肪を完全に分離します。単離された腸間膜脂肪を氷上のHEPESバッファーに保管します。動脈を単離するには、まず脂肪組織を10ミリリットルの冷たいHEPESバッファーを含む解剖皿に移します。実体顕微鏡下で、皮下脂肪組織を配置して動脈静脈対を露出させます。内臓脂肪組織を配置して、カリフラワーの形状とそれぞれの動脈静脈のペアを露出させます。55番の鉗子を使用して、実質脂肪を動脈から慎重に取り除きます。目的の血管系を損傷することなく、一度に脂肪の小片を取り除きます。動脈から実質脂肪組織が完全になくなるまで続けます。5番の鉗子を使用して、洗浄した動脈を新鮮なHEPESバッファーを含む新しいチューブに移し、消化の準備ができるまで氷上に保ちます。まず、ディスパーゼとエラスターゼをそれぞれ1ミリグラムずつ2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに加えます。2ミリリットルの解離溶液、ボルテックスを加え、完全に溶解するまで摂氏37度でインキュベートします。5番の鉗子を使用して、洗浄した動脈をそれぞれのサンプルチューブに移します。チューブを摂氏37度で1時間インキュベートし、10〜15分ごとに反転させて穏やかに攪拌します。それまでの間、サンプルごとに1ミリグラムのコラゲナーゼタイプを新しいチューブに追加します。インキュベーション後、動脈をチューブの下部に定着させ、500マイクロリットルのバッファーを上部からコラゲナーゼを含むチューブに移します。ボルテックスし、この溶液をそれぞれのサンプルチューブに戻します。サンプルを摂氏37度で15分間インキュベートします。サンプルチューブを振ると、動脈がバラバラに分離することを確認してください。ガラスピペットを使用して、消化された組織を10〜15回激しく粉砕し、細胞を機械的に解離させる。消化したサンプルを70ミクロンのセルストレーナーまたはフローサイトメトリーチューブストレーナーに通して、シングルセル懸濁液を取得します。単一細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去する。細胞ペレットを5%BSAを含む1ミリリットルのPBSに30分間再懸濁します。1マイクロリットルの細胞生存率染色剤を加え、暗所で30分間インキュベートします。細胞懸濁液を遠心分離し、細胞ペレットを1%BSAを含む200マイクロリットルのPBSに再懸濁します。CD31およびCD45に結合した一次抗体を加え、冷蔵庫のロッカーで15分間インキュベートします。1%BSAを含む1ミリリットルのPBSを細胞懸濁液に直接加えて細胞を洗浄する。細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを0.1%BSAを含む200マイクロリットルの1%ホルムアルデヒドに再懸濁します。チューブをアルミホイルで覆い、フローサイトメトリーの準備ができるまで冷蔵庫に保管します。消化された皮下脂肪動脈から得られた細胞調製物を使用して、フローサイトメトリーを用いて内皮細胞集団を同定した。CD31陽性CD45陰性細胞は内皮細胞として同定された。細胞生存率染色により、固定前に単離および消化プロトコルを生き延びた生存細胞のみを同定することができました。異なる脂肪デポー血管系からの膜タンパク質発現および内皮細胞の違いを同定するために、単離された細胞を脂肪酸トランスロカーゼCD36についてプローブした。CD36陽性内皮細胞は、皮下脂肪および腸間膜脂肪において同定された。CD36発現と皮下および腸間膜内皮細胞の定量により、CD36を発現する内皮細胞の割合とCD36発現の強度の両方が皮下内皮細胞で大きいことが明らかになりました。動脈を注意深く解剖し、特定し、きれいにすることが重要です。最も重要なことは、消化プロトコルは、ダウンストリームアプリケーションのために十分な収量の生細胞を生成する必要があります。この手順に続いて、単離された細胞集団は、電気生理学、分子プロファイリング、およびインビトロでの薬物スクリーニングのための初代細胞株の生成を含むがこれらに限定されない用途に使用することができる。

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Research

JoVE Journal

Biology

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