Name: 長さスケール全体で染色体コンフォメーションをキャプチャする (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 学ぶ Hi-C 3.0プロトコルによる染色体コンフォメーション解析法。ホルムアルデヒドとDSG架橋剤、制限酵素を用いてクロマチン相互作用を高感度に検出し、プロモーター・エンハンサー相互作用や染色体コンパートメントを正確に解析します。

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プロトコル開発のDenis LafontaineとBioinformaticの支援をしてくれたSergey Venevに感謝します。この研究は、国立衛生研究所共通基金4D Nucleome ProgramからJ.D.への助成金(U54-DK107980、UM1-HG011536)によって支援されました。JDはハワードヒューズ医学研究所の研究者です。
この記事は、HHMIの出版物へのオープンアクセスポリシーの対象となります。HHMIラボの責任者は以前、研究論文で非独占的なCC BY 4.0ライセンスを一般に付与し、HHMIにサブライセンス可能なライセンスを付与しています。これらのライセンスに従い、この記事の著者が承認した原稿は、公開後すぐにCC BY 4.0ライセンスの下で自由に利用することができます。

1.架橋による固定
<ol><li>ホルムアルデヒド固定:単層の細胞から出発<ol><li>細胞を適切な培地に播種して、150mmプレートあたり5×106 細胞を回収する。 注:ユーザーは、任意の哺乳類細胞株の最適な増殖を保証する任意の好ましい容器を選択することができます。さらに、細胞は組織から単離することができる。</li>
		<li>150 mmプレートから真空トラップに結合したパスツールピペットで培地を吸引し、~10 mL HBSSで2回洗浄します。</li>
		<li> </li><li><li><li><li><li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li><li></li><li></li><li> </li><li><li><li><li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li><li> </li><li> </li><li> </li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li> </li><li><li> </li><li></li><li><li> </li><li><li><li> </li><li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li></li><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li> </li><li><li></li><li> </li><li></li><li><li><li> </li><li> </li><li><li><li> </li><li><li></li><li><li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li><li><li><li> </li><li> </li></ol></li></ol><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/20220527_table01.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/20220527_table02.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/20220527_table03.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/20220527_table04.xlsx" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig02large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><ol><li> </li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li><li> </li><li><li><li> </li><li><li> </li><li> </li><li> </li><li><li><li><li> </li><li><li><li> </li><li> </li><li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li></li><li><li><li><li></li><li><li><li><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li> </li><li></li><li><li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li><li><li><li></li><li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li><li><li> </li><li><li><li><li> </li></ol></li></ol><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/20220527_table05.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/20220527_table06.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/20220527_table07.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/20220527_table08.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/20220527_table09.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/20220527_table10.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/20220527_table11.xlsx" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig04large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig05large.jpg" target="_blank"></a>

<ol><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li>
<li>Simonis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+%284C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C).</a> Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).</li>
<li>Dostie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Conformation+Capture+Carbon+Copy+%285C%29%3A+a+massively+parallel+solution+for+mapping+interactions+between+genomic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements.</a> Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li>
<li>Stadhouders, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+chromosome+conformation+capture+sequencing+for+rapid+genome-scale+high-resolution+detection+of+long-range+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions.</a> Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).</li>
<li>Kalhor, R., Tjong, H., Jayathilaka, N., Alber, F., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+architectures+revealed+by+tethered+chromosome+conformation+capture+and+population-based+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome architectures revealed by tethered chromosome conformation capture and population-based modeling.</a> Nature Biotechnology. 30 (1), 90-98 (2012).</li>
<li>Hsieh, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nucleosome+resolution+chromosome+folding+in+yeast+by+micro-C%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by micro-C.</a> Cell. 162 (1), 108-119 (2015).</li>
<li>Hsieh, T. -H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-C+XL%3A+assaying+chromosome+conformation+from+the+nucleosome+to+the+entire+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Micro-C XL: assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome.</a> Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).</li>
<li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+decade+of+3C+technologies%3A+detailed+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li>
<li>Rodley, C. D., Bertels, F., Jones, B., O’Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+identification+of+yeast+chromosome+interactions+using+Genome+conformation+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Global identification of yeast chromosome interactions using Genome conformation capture.</a> Fungal Genetics and Biology. 46 (11), 879-886 (2009).</li>
<li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Alipour, E., Marko, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+domain+structures+by+DNA-loop-extruding+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Self-organization of domain structures by DNA-loop-extruding enzymes.</a> Nucleic Acids Research. 40 (22), 11202-11212 (2012).</li>
<li>Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hitchhiker%E2%80%99s+guide+to+Hi-C+analysis%3A+Practical+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Hitchhiker’s guide to Hi-C analysis: Practical guidelines.</a> Methods. 72, 65-75 (2015).</li>
<li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C+2.0%3A+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods. 123, 56-65 (2017).</li>
<li>Golloshi, R., Sanders, J. T., McCord, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iteratively+improving+Hi-C+experiments+one+step+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Iteratively improving Hi-C experiments one step at a time.</a> Methods. 142, 47-58 (2018).</li>
<li>Darrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+DXZ4+on+the+human+inactive+X+chromosome+alters+higher-order+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Deletion of DXZ4 on the human inactive X chromosome alters higher-order genome architecture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (31), 4504-4512 (2016).</li>
<li>Akgol Oksuz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+chromosome+conformation+capture+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays.</a> Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).</li>
<li>Ghuryeid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+Hi-C+links+with+assembly+graphs+for+chromosome-scale+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrating Hi-C links with assembly graphs for chromosome-scale assembly.</a> PLoS Computational Biology. 15 (8), 1007273(2019).</li>
<li>Gu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-mapping+of+nuclear+compartments+using+ultra-deep+Hi-C+shows+that+active+promoter+and+enhancer+elements+localize+in+the+active+A+compartment+even+when+adjacent+sequences+do+not%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Fine-mapping of nuclear compartments using ultra-deep Hi-C shows that active promoter and enhancer elements localize in the active A compartment even when adjacent sequences do not.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+3D+genome+architecture+through+in+situ+DNase+Hi-C%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mapping 3D genome architecture through in situ DNase Hi-C.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2104-2121 (2016).</li>
<li>Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C+3.0%3A+Improved+Protocol+for+Genome-Wide+Chromosome+Conformation+Capture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hi-C 3.0: Improved Protocol for Genome-Wide Chromosome Conformation Capture.</a> Current Protocols. 1 (7), 198(2021).</li>
<li>Belton, J. -M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+A+comprehensive+technique+to+capture+the+conformation+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes.</a> Methods. 58 (3), 268-276 (2012).</li>
<li>Truch, J., Telenius, J., Higgs, D. R., Gibbons, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+tackle+challenging+ChIP-Seq%2C+with+long-range+cross-linking%2C+Using+ATRX+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">How to tackle challenging ChIP-Seq, with long-range cross-linking, Using ATRX as an example.</a> Methods in Molecular Biology. 1832, Clifton, N.J. 105-130 (2018).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">In situ chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Current Protocols. 1 (8), 174(2021).</li>
<li>Tjong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-based+3D+genome+structure+analysis+reveals+driving+forces+in+spatial+genome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Population-based 3D genome structure analysis reveals driving forces in spatial genome organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1663-1672 (2016).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+dynamics+of+chromosomal+organization+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle dynamics of chromosomal organization at single-cell resolution.</a> Nature. 547 (7661), 61-67 (2017).</li>
<li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+multiplex+single-cell+Hi-C%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively multiplex single-cell Hi-C.</a> Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).</li>
<li>Meng, L., Wang, C., Shi, Y., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Si-C+is+a+method+for+inferring+super-resolution+intact+genome+structure+from+single-cell+Hi-C+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Si-C is a method for inferring super-resolution intact genome structure from single-cell Hi-C data.</a> Nature Communications. 12 (1), 4369(2021).</li>
<li>Tavares-Cadete, F., Norouzi, D., Dekker, B., Liu, Y., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-contact+3C+reveals+that+the+human+genome+during+interphase+is+largely+not+entangled%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multi-contact 3C reveals that the human genome during interphase is largely not entangled.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1105-1114 (2020).</li>
<li>Vermeulen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-contact+4C%3A+long-molecule+sequencing+of+complex+proximity+ligation+products+to+uncover+local+cooperative+and+competitive+chromatin+topologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multi-contact 4C: long-molecule sequencing of complex proximity ligation products to uncover local cooperative and competitive chromatin topologies.</a> Nature Protocols. 15 (2), 364-397 (2020).</li>
<li>Oomen, M. E., Hedger, A. K., Watts, J. K., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+chromatin+interactions+between+and+along+sister+chromatids+with+SisterC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting chromatin interactions between and along sister chromatids with SisterC.</a> Nature Methods. 17 (10), 1002-1009 (2020).</li>
<li>Mitter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+sister+chromatids+in+the+replicated+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformation of sister chromatids in the replicated human genome.</a> Nature. 586 (7827), 139-144 (2020).</li>
<li>Krietenstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+Details+of+Mammalian+Chromosome+Architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural Details of Mammalian Chromosome Architecture.</a> Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).</li>
<li>Hughes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+hundreds+of+cis-regulatory+landscapes+at+high+resolution+in+a+single%2C+high-throughput+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment.</a> Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).</li>
<li>Fullwood, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).</li>
<li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li>
<li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiChIP%3A+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li>
</ol>

著者は開示する利益相反を持っていません。

セル処理の重要なステップ より少ない数のインプットセルを使用することも可能ですが、このプロトコルは、シーケンシングレーンあたり~5×106セル(~400 Mリード)に最適化されており、ディープシーケンシング後の適切な複雑さを確保しています。細胞は固定前に最もよく数えられます。超深度ライブラリの生成では、通常、目的の読み取り深度に達するまでレーン(およびセル)の数を乗算します。最適な固定のためには、FA固定の前に血清含有培地をPBSに交換し、固定液を濃度勾配なしで直ちに添加する必要があります15,22。細胞回収では、トリプシン処理後の平坦形状から球形への遷移が核立体構造に影響を与える可能性があるため、トリプシン処理よりも掻き取りが好まれます。DSGの添加後、ゆるくて塊状の細胞ペレットは容易に失われる。この段階で細胞を取り扱うときは注意し、凝集を減らすために最大0.05%のBSAを追加します。
メソッドの変更 このプロトコルは、ヒト細胞17を用いて開発された。それでも、染色体立体配座捕捉の経験に基づいて、このプロトコルはほとんどの真核細胞で機能するはずです。入力量が著しく低い場合(~1 ×10 6 細胞)、溶解および立体構造捕捉手順に半分の体積を使用することをお勧めします[ステップ2.1-2.4]。これにより、1.7 mLチューブを備えた卓上遠心分離機でDNA単離[ステップ2.5]を行うことができ、低DNA濃度のペレット化を改善することができます。DNAの定量(ステップ2.6.6)は、進め方を示します。単離されたDNA(1-5 μg)の量が少ない場合は、サイズ選択をスキップし(ステップ3.3)、CFUで容量を130 μLから~45 μLに減らした後、ビオチン除去を進めることをお勧めします。
このプロトコルは、その後のFAおよびDSGによる架橋およびDpnIIおよびDdeIによる消化後の高品質のデータを確保するために特別に開発されました。ただし、ChIP-seq23 およびChIA-PET24でも使用されているFAとそれに続くEGS(エチレングリコールビス(スクシンイミジルコハク酸塩))などの代替架橋戦略も同様にうまく機能する可能性があります17。同様に、DpnIIとHinfI18 またはMboI、MseI、およびNlaIII19 などの異なる酵素の組み合わせを消化に使用できます。酵素の組み合わせを適応させるときは、特定の5'オーバーハングを埋めることができるビオチン化ヌクレオチドを使用し、各カクテルに最適なバッファーを使用してください。DpnIIには独自のバッファーが付属しており、酵素メーカーはDdeI消化用の特定のバッファーを推奨しています。ただし、このプロトコルのDpnIIとDdeIによる二重消化には、両方の酵素で100%の活性が評価されているため、制限バッファーが推奨されます。
コンフォメーションキャプチャのトラブルシューティング 染色体コンフォメーションキャプチャの3つの重要なステップである架橋、消化、ライゲーションはすべて、結果をゲルで視覚化する前に実行されました。これら3つのステップのそれぞれの品質を判断し、問題が発生した可能性のある場所を識別するために、消化前(CI)と消化後(DC)のアリコートを採取し、ライゲーションされたHi-Cサンプルとともにゲルにロードします(図2)。このゲルは、Hi-Cサンプルの品質を判断し、プロトコルを継続する価値があるかどうかを判断するために使用されます。CIとDCがなければ、潜在的な次善のステップを特定することは困難です。次善のライゲーションは、ライゲーション自体の問題、フィルイン、または架橋の問題が原因である可能性があることは注目に値します。架橋のトラブルシューティングを行うには、ライブラリあたり1×107 細胞以上を使用せず、新しい架橋試薬とクリーンな細胞(PBSですすいで)から始めてください。ライゲーションでは、細胞とライゲーション混合物が氷上に保たれていることを確認してください。16°Cで4時間インキュベートする直前にT4 DNAリガーゼを加え、よく混ぜます。
ライブラリ準備のトラブルシューティング 10回を超えるPCRサイクルが必要な場合、またはPCR滴定後にゲルにPCR産物が見られない場合(図4)、Hi-Cサンプルを保存するためのいくつかのオプションがあります。PCR滴定からさかのぼって、最初のオプションはPCRを再試行することです。それでも十分な製品がない場合は、1x TLEバッファーでビーズを2回洗浄した後、Aテーリングとアダプターライゲーション(ステップ3.6)の別のラウンドを試みることができます。この追加のAテーリングとアダプターライゲーションの後、以前と同様にPCR滴定に進むことができます。それでも製品がない場合、最後のオプションは、ステップ3.3の0.8倍フラクションを再超音波処理し、そこから続行することです。
Hi-C3.0の制限事項と利点 Hi-Cは、細胞集団内の遺伝子座のペア間の相互作用の平均頻度をキャプチャする集団ベースの方法であることを認識することが重要です。いくつかの計算解析は、集団25から立体構造の組み合わせを解きほぐすように設計されていますが、原則として、Hi-Cは細胞間の違いを知らされません。シングルセルHi−C26,27を行うことは可能であり、計算推論28を行うことができるが、シングルセルHi−Cは超高分解能3C情報を得るのには適していない。Hi-Cの追加の制限は、ペアワイズ相互作用のみを検出することです。マルチコンタクト相互作用を検出するには、ショートリードシーケンシング(Illumina)16と組み合わせて頻繁なカッターを使用するか、PacBioまたはOxford Nanoporeプラットフォームのロングリードシーケンシングを使用してマルチコンタクト3C29または4C30を実行することができます。姉妹染色分体間および姉妹染色分体に沿った接触を特異的に検出するためのHi−C誘導体も開発されている31,32。
Hi-C19とMicro-C33は、サブキロベースの解像度でコンタクトマップを生成するために使用できますが、どちらも大量のシーケンシングリードを必要とし、これはコストのかかる作業になる可能性があります。コストをかけずに同等またはさらに高い分解能を得るために、特定のゲノム領域(キャプチャーC 34)または特定のタンパク質相互作用(ChiA-PET 35、PLAC-seq36、Hi-ChIP37)の濃縮を適用できます。これらのエンリッチメント アプリケーションの長所と欠点は、サンプリングされる相互作用の数が限られていることです。このようなエンリッチメントにより、Hi-C のグローバルな側面 (およびグローバル正規化のオプション) が失われます。
Hi-C3.0の重要性と応用の可能性 このプロトコルは、TADやコンパートメント17などの大規模な折り畳み機能を同時に検出しながら、高解像度の超深度3Cを可能にするように設計されています(図6)。このプロトコルは、Hi-Cライブラリごとにチューブあたり5セル×10セルから始まり、フローセルで1レーンまたは2レーンをシーケンスして最大10億のペアエンドリードを取得するのに十分な材料である必要があります。超ディープシーケンシングでは、マッピングされたリードとPCRの重複の数に応じて、5×106細胞の複数のチューブを準備する必要があります。最高分解能(<1 kb)では、CTCF部位間でループ相互作用が主に見られますが、プロモーター-エンハンサー相互作用も検出できます。読者は、データ分析の詳細な説明について、Akgol Oksuz et al.17を参照することができます。

染色体コンフォメーションキャプチャーは、2002年から使用されています1。基本的に、すべてのコンフォメーションキャプチャバリアントは、3Dクロマチン組織を維持するためにDNA-タンパク質およびタンパク質-タンパク質相互作用の固定に依存しています。これに続いて、通常は制限酵素処理によるDNA断片化が行われ、最後に、近くのDNA末端がライゲーションされて、空間的に近位の遺伝子座が固有の共有DNA配列に変換されます。初期の3Cプロトコルでは、PCRを使用して特定の「1対1」の相互作用をサンプリングしていました。その後の4Cアッセイでは、「1対すべて」の相互作用2の検出が可能になり、5Cは「多対多」の相互作用3を検出できました。染色体コンフォメーションキャプチャは、ゲノムワイドなHi-C4および3C-seq5、TCC6、Micro-C 7,8などの同等の技術を使用して「オールツーオール」ゲノム相互作用の検出を可能にする次世代のハイスループットシーケンシング(NGS)を実装した後に完全に実を結びました(DenkerとDe Laat9によるレビューも参照)。
Hi-Cでは、ビオチン化ヌクレオチドを使用して、消化後およびライゲーション前に5'オーバーハングをマークします(図1)。これにより、ストレプトアビジンコーティングビーズを使用して適切に消化およびライゲーションされたフラグメントを選択でき、GCC10とは一線を画しています。Hi-Cプロトコルの重要な更新は、スプリアスライゲーション生成物を減らすために無傷の核(すなわち、in situ)で消化とライゲーションを行ったRaoら11によって実装されました。さらに、HindIII消化をMboI(またはDpnII)消化に置き換えると、フラグメントサイズが小さくなり、Hi-Cの分解能の可能性が高まりました。この増加により、比較的小規模な構造の検出が可能になり、小さなシスエレメント間のDNAループ、例えばループ押出によって生成されたCTCF結合部位間のループなど、接触点のより正確なゲノム局在が可能になりました11,12。ただし、この可能性にはコストがかかります。まず、分解能を2倍に向上させるには、シーケンシングリードを4倍(22)に増やす必要があります13。第2に、断片サイズが小さいと、未消化の隣接断片を消化断片およびライゲーション断片と間違える可能性が高まります14。前述のように、Hi-Cでは、消化された断片およびライゲーションされた断片は、ライゲーション接合部におけるビオチンの存在によって未消化断片とは異なる。しかしながら、ライゲーション接合部のみが引き下げられることを保証するために、結紮されていない末端からの適切なビオチン除去が必要である14、15。
NGSのコストが下がるにつれて、染色体折り畳みをより詳細に研究することが可能になります。DNA断片のサイズを減少させ、それによって分離能を増加させるために、Hi−Cプロトコルは、より頻繁に切断制限酵素16を使用するか、または制限酵素17、18、19の組み合わせを使用するように適合させることができる。あるいは、マイクロC中のMNase 7,8およびDNase Hi-C20中のDNaseを滴定して、最適な消化を達成することができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig01large.jpg" target="_blank"></a>

<table><tbody><tr><td>1 kb Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500100</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 磁気ビーズ、60 mL</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 遠心フィルターユニット (CFU)</td><td>EMD ミリポア</td><td>UFC500396</td><td></td></tr><tr><td>アニーリングバッファー (5x)</td><td>補足資料</td><td></td>のレシピを参照してください<td></td></tr><tr><td>ATP 10 mM</td><td>ThermoFisher</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-25i 高速冷蔵超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベックマン超遠心チューブ 35 mL</td><td>ベックマン・コールター</td><td>357002</td><td></td></tr><tr><td>結合バッファー (2x)</td><td>ビ</td>オチン-14-dATP 0.4 mM Invitrogen 19524-016 のレシピ<td></td><td></td>を参照</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA 10 mg/mL</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>B9000S</td><td>20 mg/mL から希釈</td></tr><tr><td>セル スクレーパー</td><td>ファルコン</td><td>353089</td><td></td></tr><tr><td>セル スクレーパー</td><td>コーニング</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>コニカル ポリプロピレン チューブ 50 mL</td><td>デンビル</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>コニカル チューブ 15 mL</td><td>デンビル</td><td>C1017-P</td><td></td></tr><tr><td>コバリス マイクロ チューブ AFA ファイバースナップキャップ 130 & マイクロ;L</td><td>Covaris</td><td>520045/520077</td><td></td></tr><tr><td>Covaris Sonicator</td><td>Covaris</td><td>E220/E220evolution/M220</td><td></td></tr><tr><td>培養フラスコ 175 cm2</td><td>Falcon</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>培養プレート 150 mm x 25 mm</td><td>コーニング</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>dATP 1 mM 1 mM</td><td>Invitrogen</td><td>56172</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dCTP 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>56173</td><td></td></tr><tr><td>DdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0175L</td><td></td></tr><tr><td>dGTP 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>56174</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-5x10ML</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix 25 mM</td><td>Invitrogen</td><td>10297117</td><td></td></tr><tr><td>Dounce ホモジナイザー</td><td>DWK Life Sciences</td><td>8853010002/8853030002</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DpnII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543M</td><td></td></tr><tr><td>DSG</td><td>ThermoScientific</td><td>20593</td><td></td></tr><tr><td>dTTP 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>56175</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 70%</td><td>Fisher</td><td>A409-4</td><td>100%</td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド</td>から希釈 <td>Fisher</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド (37%)</td> <td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディング色素 (6x )</td> <td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>超純水中のグリシン 2.5 M</td><td>Sigma</td><td>G8898-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630 洗剤</td><td>MP Biomedicals</td><td>198596</td><td></td></tr><tr><td>Klenow DNA ポリメラーゼ 5 U/&micro;L</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment 3-->5' exo-, 5 U/&micro;L</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>ライゲーションバッファー (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LoBind 微量遠心チューブ 1.7 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3233L</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer</td><td>サプリメントのレシピを参照してください。材料</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁性粒子セパレーター</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ 1.7 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>MyOne ストレプトアビジン C1 ビーズ</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1 (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1 (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70013-032</td><td></td></tr><tr><td>PCR (ストリップ) チューブ</td><td>Biorad</td><td>TBS0201/ TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>PCR サーモサイクラー</td><td>Biorad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Pfu Ultra II バッファー (10x)</td><td>Agilent</td><td></td><td>には Pfu Ultra</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA ポリメラーゼが付属しています&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>600674</td><td></td></tr><tr><td>Phase lock tube 15 mL</td><td>Qiagen</td><td>129065</td><td></td></tr><tr><td>Phase lock tubes 2 mL</td><td>Qiagen</td><td>129056</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td><td>Invitrogen</td><td>15593-049</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>ThermoFisher</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>25530-031</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>RNase A、DNase およびプロテアーゼフリー 10 mg/mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Argos technologies</td><td>EW-04397-40 またはロッキングプラットフォーム</td><td></td></tr><tr><td>SDS 1%</td><td>フィッシャー</td><td>BP13111</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム pH = 5.2、3 M</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td><td>Biorad</td><td>1704401</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase 1 U/&micro;L</td><td>Invitrogen</td><td>100004817</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAポリメラーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAポリメラーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAポリメラーゼ 3 U/&micro;L</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 ライゲーションバッファー (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>Y90001</td><td></td></tr><tr><td>T4 polynucleotide kinase 10 U/&micro;L</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>TBEバッファー</td><td>サプリメントの</td><td></td><td></td>レシピを見る</tr><tr><td>トリス低EDTAバッファー (TLE)</td><td>サプリメントの</td><td></td><td></td>レシピを見る</tr><tr><td>トリトンX-100 (10%)</td><td>シグマ</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>トルセックアダプター オリゴ</td><td>DNA内蔵テクノロジー(IDT))</td><td></td><td>https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry 250 nmoleおよびHPLC精製</td></tr><tr><td>Tween 20洗剤</td><td>Fisher</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween Wash Buffer</td> 補足<td>資料</td><td></td><td></td>のレシピを参照してください</tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>(G560)SI-0236</td><td></td></tr></tbody></table>

長さスケール全体で染色体コンフォメーションをキャプチャする

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

染色体コンフォメーションキャプチャ(3C)は、3次元クロマチン相互作用を検出するために使用されます。通常、ホルムアルデヒド(FA)による化学架橋は、クロマチン相互作用を固定するために使用されます。次に、制限酵素によるクロマチン消化とそれに続くフラグメント末端のライゲーションにより、3次元(3D)近接性が独自のライゲーション産物に変換されます。最後に、架橋の逆転、タンパク質除去、およびDNA単離の後、DNAをせん断し、ハイスループットシーケンシング用に準備します。遺伝子座の対の近接ライゲーションの頻度は、細胞集団における三次元空間におけるそれらの共局在の頻度の尺度である。
配列決定されたHi-Cライブラリは、遺伝子座のすべてのペア間の相互作用頻度に関するゲノム全体の情報を提供します。Hi-Cの分解能と精度は、クロマチンの接触とクロマチンの頻繁で均一な断片化を維持する効率的な架橋に依存しています。この論文では、2つの架橋剤(ホルムアルデヒド[FA]とジスクシンイミジルグルタル酸[DSG])を組み合わせることで架橋効率を高め、2つの制限酵素(DpnIIとDdeI)を使用してより細かい消化を行うことで、改良された in situHi-C プロトコルHi-C 3.0について説明します。Hi-C 3.0は、ループやトポロジー関連ドメイン(TAD)などの小さなスケールでのゲノムフォールディングの特徴、およびコンパートメントなどの大きな核全体のスケールでの特徴を正確に定量化するための単一のプロトコルです。

この原稿の図は、Lafontaineらによって以前に発表されたものの別の複製実験から生成されました21。ハイスループットシーケンシングデータを取得した後、 オープンクロマチンコレクティブ (Open2C:https://github.com/open2c)を使用してHi-Cデータを処理しました。同様のパイプラインは、4D Nucleomeプロジェクト(https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline)のデータポータルにあります。簡単に言うと、Nextflowパイプライン蒸留器(https://github.com/open2c/distiller-nf)は、(1)Hi-C分子の配列をリファレンスゲノムにアラインメントし、(2).samアライメントを解析し、Hi-Cペアでファイルを形成し、(3)PCR重複をフィルタリングし、(4)ペアをHi-C相互作用のビン化マトリックスに集約するために実装されました。クーラーと呼ばれるこれらのHDF5フォーマットのマトリックスは、(1)HiGlassサーバーで表示し(https://higlass.io/)、(2)Open Chromatin Collective(https://github.com/open2c/cooltools)によって維持されている「cooltools」コレクションに存在するオープンソースの計算ツールの大規模なセットを使用して分析し、コンパートメント、TAD、ループなどの折り畳みの特徴を抽出および定量化できます。
Hi-C3.0ライブラリのいくつかの品質指標は、いくつかの簡単な指標/指標を使用して、リードペアをリファレンスゲノムにマッピングした直後に評価できます。まず、通常、配列決定されたリードペアの~50%をヒト細胞に対して一意にマッピングできます。染色体のポリマー性により、これらのマッピングされたリード(~60%-90%)のほとんどは染色体内の相互作用(シス)を表し、相互作用の頻度はゲノム距離の増加とともに急速に減衰します(距離依存性崩壊)。距離依存の減衰は、ゲノム距離の関数として接触確率(染色体アームごと)を示す「スケーリングプロット」で最もよく視覚化できます。異なる架橋剤と酵素を使用すると、長距離距離と短距離での距離依存的な崩壊が変化する可能性があることがわかりました17。DSG架橋の添加は、Mnaseなどの酵素や、より小さな断片を生成するDpnII-DdeIの組み合わせと組み合わせると、短距離での相互作用の検出可能性を高めます(図6A)。
距離依存の減衰は、2D相互作用行列から直接観察することもできます:中心対角線から離れると、相互作用はよりまれになります(図6B)。さらに、コンパートメント、TAD、ループなどのゲノムフォールディングの特徴は、Hi-Cマトリックスとスケーリングプロットから、一般的なゲノム全体の平均距離依存減衰からの偏差として識別できます。重要なことに、FAに加えてDSGによる架橋は、染色体のポリマー特性のために制限されないランダムライゲーションを減少させ、したがって染色体間(トランス)で発生する可能性が高くなります(図6C)。ランダムライゲーションを減らすと、特に染色体間および非常に長い範囲(&gt;10〜50 Mb)の染色体内相互作用において、シグナル対ノイズ比が増加します。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2.jpg"> 図6:マッピングおよびフィルタリングされたHi-Cライブラリの代表的な結果 。 (A)さまざまな酵素の接触確率とその誘導体を、フラグメントの長さ(上)とFAまたはFA + DSGのいずれかで架橋(下)で並べたスケーリングプロット。MNAse(マイクロC)またはDpnII-DdeI(Hi-C 3.0)による消化は、DSGをFAに追加する場合(下)と同様に、短距離接触(上)を大幅に増加させます。(B)カラムは、FA架橋直後のDpnII消化とFA+DSG架橋後のDpnIIまたはDdeI消化のHi-Cヒートマップを示しています。白い矢印は、DSG架橋およびDdeI消化後の「ドット」の強度の増加を示しており、DNAループの検出が優れていることを意味します。行は、パネルCと整列して、解像度を上げた3番染色体のさまざまな部分を示しています:一番上の行:3番染色体全体(0-198,295,559 Mb);中段:186〜196メガバイト;下段:191.0-191.5 Mb。 (C) Aに描かれている地域のカバレッジグラフ。黒い矢印は、FAのみの架橋のカバレッジ(%cisリード)が低いことを示しています。略語:FA =ホルムアルデヒド;DSG =ジスクシンイミジルグルタル酸;CHR =染色体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
すべてのマップされた読み取りが役立つわけではありません。2番目の品質指標は、PCRの重複数です。正確な重複読み取りは、結紮および超音波処理後に偶然に発生する可能性は非常に低いです。したがって、このようなリードはPCR増幅に起因する可能性が高く、除外する必要があります。重複は、複雑度の低いライブラリを増幅するために必要なPCRサイクルが多すぎる場合によく発生します。一般に、Hi-Cの場合、ほとんどのライブラリは、滴定PCRによって決定されるように、5〜8サイクルの最終PCR増幅のみを必要とします(ステップ3.9; 図4)。ただし、14サイクルのPCR増幅後でも十分な複雑さのライブラリを取得できます。
重複リードの別のカテゴリ、いわゆる光学的重複は、パターン化されたフローセル(HiSeq4000など)を使用するIlluminaシーケンシングプラットフォームでの増幅プロセスから発生する可能性があります。光学的重複は、フローセルに過負荷がかかり、(大きな)クラスターが2つの別々のクラスターと呼ばれるようになるか、または最初のPCRラウンド後の元のペア末端分子の局所的な再クラスター化から見られます。どちらのタイプの光学重複も局所的であるため、フローセル上の位置によってPCR重複と識別および区別できます。PCR重複が&gt;15%のライブラリは再生成が必要ですが、光学重複のあるライブラリはロードプロセスを最適化した後にリロードできます。
補足表S1:バッファーと溶液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Hi-C 3.0は、ホルムアルデヒドおよびジスクシンイミジルグルタル酸架橋剤をDpnIIおよびDdeI制限酵素のカクテルと組み合わせて、クロマチン相互作用検出のS/N比と分解能を高める改良されたHi-Cプロトコルです。

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

このプロトコルは、低バックグラウンドシグナルで複数の長さスケールにわたる染色体折り畳みの特徴を正確に検出します。例えば、プロモーターエンハンサー相互作用は、染色体コンパートメントの文脈で分析することができる。制限エンドヌクレアーゼの使用は、投入材料の消化レベルの最適化を回避します。ライゲーション産物を捕捉するためにゲル単離による選択は必要ありません。最も一般的な問題は、DSG固定後の細胞の喪失であり、高品質のライブラリを生成するのに十分なDNAを捕捉します。まず、5 x 10を含む150ミリメートルのプレートから6番目のセルまで真空トラップに結合されたパスツールピペットで培地を吸引します。10ミリリットルのHBSSで細胞を2回洗浄します。細胞を架橋するには、23.125ミリリットルの1%ホルムアルデヒド溶液を15センチメートルのプレートに注ぎます。室温で10分間インキュベートし、2分ごとに手でプレートを静かに揺らします。次に、1.25ミリリットルの2.5モルグリシンを加え、プレートを静かに回転させて架橋反応を消光してから、室温で5分間インキュベートします。氷上で15分間インキュベーションを続け、架橋を停止します。セルスクレーパーまたはゴム製の警官でプレートから細胞をこすり落とし、細胞懸濁液をピペット付きの50ミリリットルの円錐形チューブに移します。懸濁液を室温で1, 000倍Gで10分間遠心分離し、吸引により上清を廃棄する。ペレットを10ミリリットルのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で1回洗浄します。その後、DSG架橋に進む前に再度遠心分離する。DSGとの架橋のために、ペレット化された細胞を9.9ミリリットルのDPBSに再懸濁します。次に、100マイクロリットルの300ミリモルDSGを追加します。チューブを反転させて混合し、ローテーター上で室温で40分間細胞を架橋します。架橋後、1.925ミリリットルの2.5モルグリシンを加え、転倒させて混合し、室温で5分間インキュベートします。次に、細胞を2, 000倍Gで15分間遠心分離し、ペレットを1ミリリットルの0.05%ウシ血清アルブミンDPBSに再懸濁してから、1.7ミリリットルのチューブに移します。細胞を摂氏4度で15分間2, 000倍Gで遠心分離し、上清を廃棄します。ペレットを液体窒素でスナップ凍結してから、染色体確認キャプチャに進みます。架橋細胞アリコートを10マイクロリットルのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む1ミリリットルの氷冷溶解バッファーに再懸濁し、Dounceホモジナイザーに移して氷上で15分間インキュベートします。乳棒Aをゆっくりと上下に30回動かして細胞を均質化し、1分間インキュベートして細胞を冷ましてからさらに30ストロークします。最後のストロークの後、ライセートを1.7ミリリットルのチューブに移します。溶解した懸濁液を2, 500倍Gで5分間遠心分離する。上清を廃棄し、フリックまたはボルテックスして湿ったペレットを再懸濁します。できるだけ多くの上清を取り除き、塊を最小限に抑えたヨーグルト様物質を得る。遠心分離前に、ペレットを500マイクロリットルの氷冷制限バッファーに再懸濁します。2回目の洗浄後、セルサイズに応じてペレットのキャリーオーバー量に約340マイクロリットルを加えた後、ピペッティングによりペレットを360マイクロリットルの制限バッファーに再懸濁します。クロマチンの完全性をテストするために18マイクロリットルのライセートを確保するか、残りのライセート CI.To、38マイクロリットルの1%ドデシル硫酸ナトリウムをhi-Cチューブに加えて総容量380マイクロリットルを作り、気泡を導入せずにピペッティングで慎重に混合します。サンプルを摂氏65度で10分間振とうせずにインキュベートし、クロマチンを開きます。次に、すぐにチューブを氷の上に置きます。Triton X-100で消化混合物を調製した後、この混合物を107マイクロリットルをhi-Cチューブに加えて総容量487マイクロリットルを作り、インターバル振とうしながらサーモミキサーで摂氏37度でクロマチンを一晩消化します。翌日、サンプルを摂氏65度に20分間移し、残りのエンドヌクレアーゼ活性を失活させます。サンプルを氷上に置いた後、10マイクロリットルの消化制御(DC)を取っておき、摂氏4度で保管します。ピペットまたは回転させて蓋から結露を取り除きます。次に、58マイクロリットルのビオチンフィルインミックスを加えて、総容量を535マイクロリットルにします。泡を形成せずに穏やかにピペットしてから、サーモミキサーで摂氏23度で4時間インキュベートします。インキュベーション後、665マイクロリットルのライゲーションミックスを加え、サンプル量を1, 200マイクロリットルにします。ピペッティングでサンプルを混合し、サーモミキサーで摂氏16度で4時間インキュベートします。次に、2つの画分で50マイクロリットルのプロテイナーゼ-Kをhi-Cサンプルチューブに加え、インターバル振とうしながら摂氏65度で一晩インキュベートします。DNA 精製のために、 100% 氷冷エタノールを加え、摂氏 4 度で 30 分間 18 、 000 倍の G でチューブを遠心分離します。非ペレット側から上清を完全に除去し、サンプルを10分間、またはペレットが目に見えて乾くまで風乾します。ペレットが乾いたら、ピペッティングまたは旋回によって450マイクロリットルのTris低EDTAに可溶化します。可溶化した懸濁液を、分子量3キロダルトンのカットオフで0.5ミリメートル遠心フィルターユニット(CFU)に移します。CFUを最高速度で10分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。2回目の洗浄後、80マイクロリットルのTris低EDTAをカラムに加えます。カラムを新しい収集チューブに変えて、最高速度で2分間遠心分離します。最後に、サンプルを0.8%アガロースゲルにロードします。PCR滴定結果を含むアガロースゲルは、ほとんどのライブラリが5〜8サイクルの最終PCR増幅を必要とすることを示しました。最終的な増幅PCRライブラリの細胞消化は、アガロースゲル上の小さなフラグメントによって観察され、適切なライゲーションジャンクションの存在を確認し、シーケンシング前の品質チェックとして機能します。シーケンシング後、マッピングされたデータは、DpnIIとDdeIの組み合わせが、従来のホルムアルデヒド架橋にDSGを追加するにつれて、短距離接触を有意に増加させることを示しました。改善された信号は、2D相互作用行列から直接長距離および短距離で観測することもできます。コンパートメント信号は長距離ではCRISPRであり、クロマチンループによって形成されるドットは短距離でより顕著です。ホルムアルデヒドに加えて、DSGとの架橋はランダムライゲーションを減少させ、シスの相対被覆率を改善します。架橋中および架橋後に細胞を失わないことが重要です。細胞ペレットは緩んでいたり見えなくなったりすることがあり、細胞は一部のバッファーのピペットチップに付着する可能性があります。

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Genetics

遺伝学

のHi - Cのメソッドは、クロマチンの相互作用（1）の公平な、ゲノムワイドな同定が可能になります。のHi -...

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

関連する染色体のトラップ（ACT）アッセイは、長距離DNA相互作用を同定するための新たな方法です。長い範囲のDNAの相互作用の特徴付けは、私たちは両方の通常の生理機能と疾患状態における遺伝子発現への核アーキテクチャの関係を判別することができます。...

ロングレンジDNAの相互作用を識別するための関連する染色体のトラップ

この作品は、高解像度その場でハイ C...

しっかりと段階的な初期のショウジョウバエの胚からゲノムワイドなクロマチン構造キャプチャ ライブラリの生成

遺伝子発現制御に重要な役割を果たしているクロマチンのループただし、クロマチンのループの選択的かつ可逆的な変更を可能にする技術の進歩はいません。ここでクロマチンのループの再編成のための強力なシステムを記述対象遺伝子座に CRISPR dCas9 (CLOuD9)...

クロマチンのループ構造の再編を CRISPR 媒介

遺伝子および調節配列の物理的な相互作用の同定が困難な染色体構造をキャプチャする方法によって促進されています。これは 4 C seq プロトコルを修正は PCR テンプレートが過大に増幅を最小限に抑えることによって PCR バイアスを軽減、追加制限の酵素のダイジェスト ステップを組み込むことによって読み取りの mappability...

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

我々は、胚性幹細胞から生成された胚体における高スループットシーケンシングに続く定量染色体立体構造捕捉の適用を報告する。この技術は、胚性幹細胞分化中に所定の遺伝子の推定エンハンサーとプロモーター領域との接触を同定し、定量することを可能にする。...

定量染色体立体構造捕捉による胚体におけるエンハンサー・プロモーター接触の同定(4C)

ゲノムは核空間内で異なる構造に編成され、染色体立体構造の捕捉技術によって明らかにすることができる。核内Hi-C法は、ショウジョウバエ細胞株におけるクロマチン相互作用のゲノム全体のコレクションを提供し、制限フラグメントレベルでメガベース解像度で探索できる接触マップを生成する。...

ショウジョウバエ細胞におけるイン核Hi-C

このプロトコルは、トポロジー的会合ドメイン(TAD)の境界や、調節と他のDNA配列要素との間の長距離クロマチン相互作用など、メガベースサイズの標的ゲノム領域の3D組織を高解像度で特徴付けるために使用されるCapture Hi-C法について説明しています。...

キャプチャHi-C による 高分解能3Dクロマチン構成の解読

ゲノムワイド染色体コンフォメーションキャプチャー法Micro-C-XLを使用して、ヌクレオソーム分解能で三次元ゲノム構成をマッピングするためのプロトコルがここに示されます。...

Micro-C-XLによる哺乳類3Dゲノム相互作用のマッピング

ここでは、染色体立体構造捕捉(3C)技術の適応を、学部生の関与と学習に重点を置いて詳細に紹介します。...

3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

私たちは、ユークロマチン、ヘテロクロマチン、RNAP...

高密度核環境下のクロマチン調査のための多ラベル単分子局在顕微鏡プロトコル

学ぶ Hi-C 3.0プロトコルによる染色体コンフォメーション解析法。ホルムアルデヒドとDSG架橋剤、制限酵素を用いてクロマチン相互作用を高感度に検出し、プロモーター・エンハンサー相互作用や染色体コンパートメントを正確に解析します。

長さスケール全体で染色体コンフォメーションをキャプチャする

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