Name: インビトロ 壊死性腸炎の頂端外腸炎モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぶ頂端外エンテロイドモデルを用いた壊死性腸炎のインビトロ解析法。小腸エンテロイドの極性反転により頂端表面へのアクセスを可能にし、経口治療薬の効果的な評価と上皮障害の免疫蛍光染色解析を実現します。

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このコンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。HCは、国立衛生研究所からの助成金P20GM134973によってサポートされています。KBは、小児病院財団(CHF)と長老派健康財団(PHF)の助成金によって支援されています。OUHSCの分子生物学・サイトメトリー研究研究所には、共焦点イメージングを提供するコア施設の使用に感謝します。

この研究におけるすべての動物処置は、オクラホマ大学健康科学センター施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された。早産非ヒト霊長類(NHP、妊娠90%、オリーブヒヒ、 パピオアヌビス)からの小腸便宜サンプルは、別の研究(プロトコル#101523-16-039-I)のために安楽死後に得られた。
1. 頂端外腸科NECインディッシュモデルの構築
<ol><li>培地およびエンエロイド治療の調製 注:標準的な無菌技術に従って調製されると、メディアは4°Cで最大1週間保存することができます。<ol><li>抗生物質非含有培地(AFM)は、50 mLのヒトオルガノイド増殖培地と50 mLのオルガノイドサプリメントを混合することによって調製する( 材料表を参照)。9,900 μL の PBS に 0.5 M EDTA を 100 μL 加えて、5 mM エチレンジアミン四酢酸/1x リン酸緩衝生理食塩水 (EDTA/PBS) を調製します。</li>
		<li>ダルベッコの改変イーグルの培地/栄養素ハムの混合物F12 + 15 mM HEPESバッファー(DMEM/F12)を2-8°Cでチルします。</li>
		<li>100μgのTNF-α粉末を1mLの1x PBSに懸濁してTNF-α原液を調製する。さらに、AFMを溶媒として用いて、TNF-αストックを20ng/mLおよび50ng/mL濃度に希釈する。1mLの1x PBSに2mgのLPSを懸濁してLPS原液を調製する。さらに、AFMを溶媒として使用して、LPSのストックを100μg/mLおよび200μg/mLに希釈する。</li>
	</ol></li>
	<li>3Dエンテロイドの極性を反転させる 注: 以下の手順は、単一の 24 ウェル平底組織培養プレートを 2 つの 24 ウェル超低付着組織培養プレートに反転させることを目的としています。組織培養プレートは、使用前に少なくとも30分間37°Cに加温する必要があります。側底アウト3Dエンテロイドの誘導は、多くのグループ35,36によって以前に説明したように、培地(上記で詳述)に対してわずかな修正を加えて達成された。一般的な腸突起誘導手順は、ヒトのそれと変わらない。簡単に言えば、摘出した組織は洗浄され、小さな断片に切断され、そして細胞破壊緩衝液中でインキュベートされる。次に、細胞溶液を70μMのセルストレーナーに通し、陰窩を高密度でメッキします。<ol><li>確立された3D側底外側エンテロイドの24ウェルプレートの各ウェルから培地を吸引する。</li>
		<li>500 μL の 5 mM 氷冷 EDTA/PBS を 24 ウェルプレートの各ウェルに加え、p200 ピペットで最低 5x-6x のピペッティングを行い、基底膜抽出液/ECM ドームを穏やかに機械的に破壊します。</li>
		<li>4つのウェルの内容物を15mLの円錐形チューブに移し、8mLの氷冷EDTA/PBSを円錐形チューブに加える。残りの20ウェルを同様に移す。</li>
		<li>15 mLの円錐形チューブを4°Cで330 rpmの回転プラットフォームまたはシェーカーで1時間インキュベートします。1時間のインキュベーションの後、円錐管を300 x g で4°Cで3分間遠心分離する。 各チューブから上清を取り出して廃棄します。</li>
		<li>細胞ペレットを5 mLのDMEM/F12で結合して洗浄し、細胞懸濁液を2本の15 mL円錐管に分配します。</li>
		<li>4°Cで3分間300 x g で遠心分離することにより細胞をペレット化する。 上清を除去し、各チューブに12mLのAFMを加え、細胞ペレットが再懸濁されていることを確認する。</li>
		<li>500 μLのエンテロイド懸濁液を2つの24ウェル超低付着プレートの各ウェルにピペットで入れる。</li>
		<li>プレートを37°Cおよび5%CO2で2 〜5日間、またはエンエロイドの極性が逆になるまでインキュベートする。</li>
		<li>腸溶性反転を確認するには、まず確認免疫蛍光染色と反転までの平均時間(〜3日)を確立し、次に基本的な光学顕微鏡可視化を用いて極性反転を確認する。頂端アウトエンテロイドは外観が非常に細胞的であるが、側底外側エンテロイドはしばしば大きな中央内腔の存在または出芽によって支配される( 補足図1を参照)。 注:手順が標準化されると、頂端アウトへの変換率は通常95%を超えます。頂端アウトエンテロイドの使用は終末実験として意図されているが、理論的にはアピカルアウトエンテロイドを少数の側底外側アウトエンテロイドに通過させることは可能である。</li>
	</ol></li>
	<li>アピカルアウトNECインディッシュ 注:エンテロイドの極性が逆になったら、頂端アウトコンフォメーションの寿命が3〜4日を超えて確認されていないため、その後の実験で培養物を素早く使用してください。以下のNECインディッシュモデルでは、エンテロイドを24時間処理し、その後すぐに回収し、下流の実験のために保存した。<ol><li>エンテロイドが少なくとも95%の効率で視覚的に極性が逆転したら、プレートをインキュベーターから取り出し、24ウェルプレートの8ウェルを15mL円錐管に集めます。頂端アウトエンテロイドは懸濁液中であるため、エンテロイド/培地溶液をピペットでピペットするだけです。15 mLチューブを300 x g で4°Cで5分間遠心分離する。</li>
		<li>細胞がペレット化されたら、上清を除去し、細胞ペレットを1x PBS(対照)の所望の容量(ここでは最大処理量と一致するように10μL)と混合した4mLのAFMに再懸濁する(ここでは10μLを加えた)。</li>
		<li>500 μL のエンテロイド/PBS/AFM 懸濁液を 24 ウェル超低付着プレートの 8 ウェルにピペットで入れ、プレートを 37 °Cおよび 5%CO2 で 24 時間インキュベートします。</li>
		<li>手順 1.3.1.-1.3.3 を繰り返します。正常酸素でのTNF-α(20 ng/mLおよび50 ng/mL)およびLPS(100 μg/mLおよび200 μg/mL)処理用。すべての低酸素治療について、ステップ1.3.1.-1.3.3を繰り返しますが、プレートを37°C、5%CO2、および1%O2の別のインキュベーターに24時間置きます。 メモ: ステップ 1.3.4.ステップ1.3.1.-1.3.3と同時に行うことができますが、わかりやすくするために、上記の手順は複雑さを軽減するために処理によって分離されています。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 免疫蛍光染色と共焦点顕微鏡
<ol><li>染色液の調製<ol><li>1 μL の Triton X-100 を 1x PBS 中で 7 mL の最終容量に混合して、0.1% Triton X-100 を調製します。PBST(PBS-Tween)を30 μLのTween-20を1x PBSに30 mLの最終容量に加えることによって調製する。</li>
		<li>6.3 mL の PBST に 700 μL の NDS を加えて、10% 正常ロバ血清 (NDS)/PBST を調製します。PBSTに70 μLのNDSを最終容量7 mL となるように添加して、1% NDS/PBST を調製します。 注:ロバ血清は、二次抗体宿主と相関させるためにここで使用された。しかしながら、ブロッキング血清種は、非特異的結合を適切にブロックするために二次抗体種と一致するべきである。</li>
	</ol></li>
	<li>染色(1日目)<ol><li>24ウェルプレートの4ウェルの内容物を1.5mL微量遠心チューブに移す。すべての所望のウェル/治療について、各処理を別々のチューブに入れて繰り返します。チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離します。 腸ロイドがペレット化されたら、上清を除去する。</li>
		<li>細胞ペレットを300 μLの4%ホルムアルデヒド固定液に室温(RT)で30分間再懸濁します。30分後、チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを500μLの滅菌RT 1x PBSで洗浄した。</li>
		<li>チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離します。 上清を除去し、0.1% Triton X-100 を 500 μL 加え、RT で 1 時間放置します。</li>
		<li>1時間後、チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離し、上清を除去する。500 μL の 1x PBS で洗浄し、チューブを回転子またはシェーカーに 200 rpm で 2 ~ 8 °C で 15 分間置きます。 これを合計4倍繰り返します。</li>
		<li>チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離し、上清を除去します。500 μL の 10% NDS/PBST を加え、RT で 45 分間インキュベートします。インキュベーション中、24ウェルプレートの8ウェルに、組換え抗ビリン抗体20 μL、E-カドヘリン抗体10 μL、および1% NDS/PBST1970 μLを組み合わせて一次抗体溶液を調製します。</li>
		<li>45分間のインキュベーションの後、チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離する。 チューブを氷の上に置きます。上清を除去し、250 μLの一次抗体溶液と交換する。チューブを2〜8°Cで一晩インキュベートする。</li>
	</ol></li>
	<li>染色(2日目)<ol><li>チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離し、上清を除去します。ペレットのサイズに応じて、PBSTを各チューブに250〜500μL加え、2〜8°Cで1時間200rpmで回転子またはシェーカーの上に置く。 PBST洗浄を4回繰り返します。</li>
		<li>50%グリセロールに52 μLのCy3ロバ抗ウサギIgG(H + L)を、5.2 μLのロバ抗マウス蛍光緑色488二次抗体を5142.8 μLの1% NDS/PBSTに添加して、二次抗体溶液を調製する。</li>
		<li>最後のPBST洗浄および遠心分離に続いて、上清をチューブから取り除いた。各チューブに200 μLの二次抗体溶液を分注し、暗所で2〜8°Cで一晩インキュベートする。</li>
	</ol></li>
	<li>染色された頂端アウトエンテロイドの取り付け(1日目)<ol><li>青色核色素を含むグリセロールベースのマウント剤を1時間かけてRTに持ち込みます。</li>
		<li>チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離します。 100 μLの上清を除去し、残りの〜100 μLの上清に細胞を再懸濁する。細胞懸濁液を0.5 mLチューブに移す。</li>
		<li>チューブをミニ遠心分離機で20秒間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を除去し、細胞ペレットを100 μLの遠赤色核酸染色剤に再懸濁した。チューブをRTで10分間インキュベートする。</li>
		<li>チューブをミニ遠心分離機で20秒間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を除去し、細胞ペレットを100 μLの1x PBSに再懸濁する。2回目の洗浄を繰り返します。</li>
		<li>チューブをミニ遠心分離機で20秒間遠心分離して細胞をペレット化し、上清70μLを除去する。PBSの残りの容量に細胞を再懸濁し、内容物をラベル付きカバースリップ(24 mm x 60 mm)に移します。</li>
		<li>75 μLのマウント剤を試料に直接塗布し、ピペットチップで気泡を除去します。カバースリップが暗闇の中でRTで一晩(18-24時間)硬化するのを待ちます。</li>
	</ol></li>
	<li>染色された頂端アウトエンテロイドの取り付け(2日目)<ol><li>一晩硬化させた後、グリセロールの薄い層(〜15μL)をカバースリップに塗布する。カバースリップをスライドガラスに取り付け、所定の位置に静かに押し込みます。カバースリップとスライドの間にある泡をタップして取り除きます。</li>
		<li>カバースリップを暗闇の中でRTに最低2時間セットしてから、共焦点顕微鏡で20倍の倍率でイメージングします。様々な共焦点取得法を用いたエンテロイドの顕微鏡的可視化については、Lallemantら37を参照されたい。</li>
	</ol></li>
	<li>免疫蛍光定量 注:この方法は、ImageJソフトウェア(https://imagej.nih.gov/ij/)を使用してバックグラウンドシグナルを除去することによって、補正された総蛍光を決定します。<ol><li>ImageJで共焦点画像を開き、関心領域(ROI)ツールを使用して目的の領域を概説します。</li>
		<li>ユーザー定義のパラメータを設定するには、[ 分析]>[測定値の設定]に移動します。[設定]タブで[ 面積>積分密度]>[平均グレー値 ]を選択します。</li>
		<li>[ 分析とメジャー] に移動>ます。測定値を含むポップアップウィンドウが表示されます。これらの測定値をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。</li>
		<li>背景信号を減算するには、画像の小さな非蛍光領域を選択します。その地域の [分析>メジャー] に移動します。測定値を含むポップアップウィンドウが表示されます。出力をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。</li>
		<li>選択した細胞の面積にバックグラウンド読み取り値の平均蛍光を乗算し、積分密度から合計を減算して、補正された総細胞蛍光(CTCF)を計算する。スプレッドシートまたは統計ソフトウェアパッケージに記録を保持しながら、関心のあるすべての画像について上記の手順を繰り返します( 材料表を参照)。</li>
	</ol></li>
</ol>3. アディッシュ内のNEC細胞生存率
<ol><li>腸科治療<ol><li>ステップ1のように、24時間にわたって頂端出力NECインディッシュモデルを確立します。</li>
		<li>細胞生存率測定試薬を4°Cで一晩解凍する。 アッセイ当日、使用の30分前に試薬をRTに持参してください。試薬を反転させて混合します。</li>
		<li>アッセイを実行する前に、各ウェルから100 μLの培地を除去し、残りの400 μLを残します。</li>
		<li>内容物をプレートシェーカー上でRTで200rpmで5分間激しくよく混合し、細胞溶解を誘導した。振盪後、プレートをRTでさらに25分間インキュベートする。</li>
		<li>25分間のインキュベーション後、ピペッティングを介して1ウェルの内容物を混合し、800μLの200μLを96ウェルの不透明なポリスチレン製透明底プレートのシングルウェルに移します。残りの600 μLについて繰り返し、ウェルあたり4回のテクニカルレプリケートを作成します。このようにして24ウェルプレートの各ウェルの残りの内容物を96ウェルプレートに移す。</li>
		<li>発光可能なプレートリーダーを使用して、0.25ミリ秒積分で値を記録し、治療間の相対値を比較します。あるいは、処理発光をアデノシン三リン酸(ATP)標準と比較する。</li>
	</ol></li>
</ol>

著者は開示するものは何もなく、利益相反もありません。

腸上皮陰窩に由来する腸様モデルの最近の開発は、壊死性腸炎の病因を研究するためのより生理学的に関連する in vitro 組織を可能にする。腸上皮のすべての主要な分化細胞型を含むにもかかわらず、3Dエンテロイドは依然としていくつかの重要な制限を受ける。従来の、側底外側エンテロイドは、3D ECMヒドロゲルドームに懸濁されており、その組成および密度は、組織培養環境39内での正常な拡散を制限し得る。重要なことに、これらのエンエロイドは、細胞の頂端表面への限られたアクセスを提供し、これは、 インビボで、LPSの腸細胞TLR4結合などの管腔細菌および抗原と相互作用する表面である。
NECの病態生理は不明のままであるが、早産腸上皮における頂端TLR4の発現増加および活性化が顕著な役割を果たすと考えられている40。TLR4活性化の下流では、腸透過性の増加、上皮修復の低下、および細菌転座が機能不全の腸障壁をもたらし、腸の壊死につながる<sup class="xref"...

壊死性腸炎(NEC)は、早産児の最大10%に発生する小腸の重篤な炎症性疾患であり、一般的に高い罹患率および死亡率と関連している1,2。外科的介入を必要とする超低出生体重(<1500g)乳児の死亡率が50%に近づくことは珍しくありません3。NECの正確な病因は現在解明されていませんが、フォーミュラフィーディングなどの危険因子は、この疾患の発症において、ジスバイオシス、未熟な腸上皮、機能不全の腸障壁などの生理学的異常と化合物化すると考えられています2,4。多大な努力にもかかわらず、NECの予防や治療は過去10年間にほとんど進展していません5。NECおよび関連する腸上皮バリア機能障害を研究するための新規なin vitro法は、動物モデルからの所見がこれまでのところベッドサイドにうまく翻訳されていないため、疾患の病因の理解を進めるために必要である6。
NEC中に作用するメカニズムを調査するために、多くのin vitroモデルが利用されている。ヒト腸管上皮細胞株であるCaco-2は、NEC 7,8の最も一般的に利用されているインビトロモデルの1つです。Caco-2細胞は、小腸のブラシボーダー形態学的特徴をエミュレートするが、細胞株として、高度に翻訳可能なモデルに必要な粘液産生杯細胞を含む多種多様なin vivo細胞型に分化しない。HT−29−MTXは、ヒト結腸腺癌細胞、混合腸細胞および杯細胞表現型を含むが、腸上皮の陰窩ベースの細胞型を依然として欠いている9。IEC-6およびIEC-18は、未熟な回腸陰窩様形態を有する非形質転換細胞株であるが、ヒト組織に由来するものではなく、それらの翻訳能力を制限する。FHs74-IntおよびH4腸細胞株は、ヒト胎児組織に由来し、タイトジャンクションまたは分極単層10,11を形成しないため、NECの影響を受けやすい最も未熟児と比較して未熟である。典型的には、NECインビトロモデルは、NEC12における腸の炎症を開始する主要な受容体であるtoll様受容体4(TLR4)を誘導するために、リポ多糖(LPS)治療を利用する。活性酸素種(ROS)処理を介して媒介される損傷は、典型的には過酸化水素を介して、NEC様酸化的損傷およびアポトーシスを誘導するためにしばしば使用される13、14。腸内炎症の主な駆動因子として、炎症性TLR4シグナル伝達の下流成分である腫瘍壊死因子−α(TNF−α)もまた、インビボ病因を模倣するためにこれらのインビトロモデルにおいて一般的に利用されている15。
誘導性多能性幹細胞(iPSC)から生成されたオルガノイドは、それらが由来する組織の複雑なin vivoアーキテクチャおよび細胞型組成を再現する能力のために、腸のin vitroモデルとして人気が高まっている16,17。関連するin vitro系であるエンテロイドは、切除された腸陰窩に由来するオルガノイドであり、iPSC由来オルガノイドよりも容易に確立および維持される。エンエロイドは、典型的には、基底側細胞表面への実験的アクセスが制限された三次元(3D)細胞外マトリックス(ECM)中で増殖される。マイクロインジェクション18,19などの方法は、頂端表面に対するこの障壁を克服するために開発されてきたが、内腔内のスラウド細胞破片および粘液の蓄積は、マイクロインジェクションを技術的に困難かつ一貫性のないものにする。カスタムロボットマイクロインジェクションプラットフォームは広くアクセスできないため、技術能力と一般的な技術におけるラボ間のばらつきは、マイクロインジェクションプロトコルで克服すべき重要な変数になります。解離した3D腸突起に由来する2次元(2D)単層は、依然として腸上皮のすべての主要な細胞型を含み、頂端表面へのアクセスを可能にするが、間葉系筋線維芽細胞21のフィーダー層なしで維持することは伝統的に困難であった。細胞培養透過性支持体は、根底にある筋線維芽細胞を使用せずにエンテロイド単層の頂端側および基底側の両方にアクセスするために使用することができるが、これらの挿入物は、共焦点顕微鏡法などのモダリティで使用する前に膜の切除および取り付けを必要とし、従来の顕微鏡法22を使用する場合、より技術的に要求の厳しい困難なプロセスをもたらす。NECは、従来の3Dエンテロイド23,24,25および透過性サポート26,27を使用してインビトロでモデル化されており、腸の炎症は最近、腸内オンチップモデル28,29で再現されている。マイクロフルイディクスを組み込んだガット・オン・ア・チップ・モデルは、群を抜いて最も先進的で翻訳可能なモデルですが、この技術は高価で複雑で、ほとんどの研究者にとってアクセスできません30。
頂端アウト腸突起技術の最近の進歩は、in vitro上皮の構造的完全性への損傷を危険にさらすことなく、3D腸ロイドの頂端表面への容易なアクセスを可能にした31,32,33。頂端外腸ロイドは、in vivo腸上皮の細胞型組成およびバリア機能を共有するが、典型的な3D腸状腸炎とは異なり、これらの細胞の頂端表面は培養培地に面しており、栄養素の吸収、微生物感染、および管腔分泌に関するより生理学的に関連性のある研究を可能にする31。頂端アウトエンテロイドのさらなる利点は、実験薬剤をエンテロイドに均質に分配する能力である。マイクロインジェクションの場合のように、エンテロイドサイズに基づいて治療量を変えることは必要なく、浮遊培養においてこれらのエンテロイドを維持する能力は、実験薬剤拡散32に対するECM干渉を否定する。
壊死性腸炎は、複数の腸上皮細胞型および様々な環境的および病態生理学的因子を含む多因子疾患である34。腸管腸薬の多様な細胞組成は、NECなどの複雑な疾患をモデル化する上での単一培養に対する明らかな改善である。興味深いことに、単一の炎症性曝露がin vitro単培養において損傷を誘発するのに十分であることが多いが、エンテロイドは、マウスモデル23と同様に、NEC様損傷を誘発するために少なくとも2つの炎症性成分を必要とするようである6。ここでは、NEC様炎症に対する上皮応答を研究し、潜在的に治療標的を特定するための改良された生理学的関連性の高いin vitroモデルとして、頂端アウト腸ロイドを低酸素症(NEC6の重要な臨床的特徴)およびLPSまたはTNF-αと組み合わせて使用する頂端アウトNECインディッシュモデルを提示する。我々は、小腸3Dエンテロイドの極性を逆転させるためのプロトコル、ならびに上皮バリア破壊および接合タンパク質発現変化を同定するための免疫蛍光染色プロトコルについて記載する。最後に、我々はさらに、我々のデュアルヒット、アディッシュ内のNECインディッシュモデルの影響を決定するために、単純な腸突起生存率アッセイを実証した。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス 24 mm x 60</td><td>mm Thermo Scientific</td><td>102460</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗マウスIgG(H+L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488</td>、<td>Thermo Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギIgG抗体、Cy3標識Sigma-Aldrich</td><td></td><td>AP182C</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>E-cadherin 抗体 (7H12)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-19051</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液 4%、緩衝液、pH 6.9</td><td>ミリポア シグ</td>マ <td>1004960700</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>フィジー</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult オルガノイド 増殖培地 (ヒト)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>06010</td><td></td></tr><tr><td>ライカ SP8 共焦点顕微鏡</td><td>ライカバイオシステム</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td>大腸菌由来のリポ多糖類 O111:B4, 精製 ゲルろ過クロマトグラフィー</td><td>ミリポア シグマ</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>ノーマル ドンキー セラム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>566460</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96 ウェル、Nunclon デルタ処理、平底マイクロプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS (リン酸緩衝生理食塩水)、1x [-] カルシウム、マグネシウム、pH 7.4</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Glass 退色防止剤、NucBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36983</td><td></td></tr><tr><td>組換え抗ビリン抗体 [SP145]</td><td>Abcam</td><td>ab130751</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトTNF-&α;タンパク質100 &micro;g</td><td>Bio-Techne</td><td>210-TA-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3 マルチモードマイクロプレートリーダー</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Series II ウォータージャケット付きトライガスインキュベーター、184L</td><td>Fisher Scientific</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 ヨウ化物 (642/661)</td><td>Thermo Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>チューブ、0.5 mL、フラットキャップ</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

インビトロ 壊死性腸炎の頂端外腸炎モデル

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

壊死性腸炎(NEC)は、腸の炎症および壊死を特徴とする早産児に影響を及ぼす壊滅的な疾患である。エンテロイドは最近、胃腸病理をモデル化する有望なシステムとして浮上している。しかし、腸内障操作のために現在利用されている方法は、上皮の頂端表面へのアクセスを欠いているか(3次元[3D])、または時間がかかり、リソースを大量に消費する(2次元[2D]単分子層)。これらの方法は、モデルが生理学的に翻訳可能になるために、マイクロインジェクションなどの追加のステップを必要とすることが多い。ここでは、腸突起極性を反転させることによってNECを in vitroで 研究するための生理学的関連性のある安価なプロトコルを記載し、頂端表面が外側を向く(apical-out)。正常酸素または低酸素条件下での腫瘍壊死因子アルファ(TNF−α)またはリポ多糖(LPS)への曝露後のエンテロイドバリア完全性および接合タンパク質発現を調べるための免疫蛍光染色プロトコルも提供される。正常酸素性または低酸素性のLPSまたはTNF-αに24時間曝露された3D頂端アウト腸ロイドの生存率も評価される。LPSまたはTNF-αのいずれかに曝露されたエンテロイドは、低酸素症と組み合わせて、上皮構造の破壊、接着接合タンパク質発現の喪失、および細胞生存率の低下を示した。このプロトコルは、NEC療法の潜在的な上皮標的を特定し、治療薬に対する早産腸応答を研究するための生理学的関連性と費用対効果の高いプラットフォームを提示する新しい頂端アウトNECインディッシュモデルを記述しています。

腸の炎症をモデル化するための腸溶の使用は、壊死性腸炎の文脈の中でも、現在一般的である。しかしながら、現在利用されているほとんどの方法は、エンテロイドの頂端表面へのアクセスを欠いているか、経口治療薬としての最終的な使用を意図した化合物の生理学的関連性を否定するか、またはエンテロイド由来単分子層と同様に技術的に困難で時間がかかる。NECの現在のin vitroエンテロイドモデルの有用性を高めるために、我々はエンテロイドの極性を逆転させ、24時間低酸素症およびLPSまたはTNF-αと組み合わせて、頂端アウトNECインディッシュモデルを生成した。免疫蛍光染色により、内腔に向かう核(青色)の頂端局在と、上皮の外縁における絨毛32(赤色、頂端マーカー)の検出が確認された(図1A)。200μg/mL LPS、50ng/mL TNF-α、または低酸素症のみへの曝露は、総細胞形態、E-カドヘリン38(緑色)、または対照と比較してビリン局在または蛍光強度の明白な変化を誘導しなかった(<...

このプロトコルは、極性が逆の小腸炎を利用し、頂端表面へのアクセスを可能にする頂端外壊死性腸炎(NEC)-in-a-dishモデルを記述する。NEC関連上皮破壊を検出するための免疫蛍光染色プロトコールと、NECインディッシュプロトコルに供するアピカルアウトエンテロイドの生存率を決定する方法を提供します。

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

このプロトコルは、最初の頂端アウトインアディッシュモデルについて説明し、経口投与を目的とした潜在的な治療法のin vitroモデリングを確立する際の基底側外側アウト腸内ディッシュモデルよりも重要な改善です。この方法は、エンテロイドの頂端表面へのアクセスを可能にする。化合物は細胞培地に添加することができ、化合物はin vivoの場合と同様に頂端に取り込まれます。潜在的な経口治療薬をテストするために腸の炎症のin vitroシステムを確立することに関心のある研究者は、この技術が特に有用であると判断するかもしれません。異なる年齢や種から供給された組織は、さらなる標準化を必要とするかもしれません。したがって、極性反転時間を確立しながら患者が必要になる場合があります。3Dエンテロイドの極性を逆転させるために、確立された3D基底外側外側エンテロイドの24ウェルプレートの各ウェルから培地を吸引する。500マイクロリットルの5ミリモルの氷冷、EDTA、またはPBSを24ウェルプレートの各ウェルに加え、P 200ピペットで5〜6回上下にピペッティングすることにより、基底膜抽出物または細胞外マトリックスドームを穏やかに機械的に破壊します。4つのウェルの内容物を15ミリリットルの記録チューブに移します。次に、8ミリリットルの氷冷EDTAスラッシュPBSをチューブに追加します。残りの20ウェルを同様に移す。チューブを摂氏4度で330RPMの回転プラットフォームまたはシェーカーで1時間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを遠心分離し、各チューブから上清を廃棄する。ペレットを5ミリリットルのDMEM F12と組み合わせて洗浄します。次に、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去してから、12ミリリットルの抗生物質を含まない培地をチューブに追加し、細胞ペレットが再懸濁されるようにします。500マイクロリットルの腸内懸濁液を24ウェル超低アタッチメントプレートの各ウェルにピペットする。プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素で2〜5日間、またはエンテロイドが極性が逆になるまでインキュベートします。棄権初日目に、24ウェルプレートの4つのウェルの内容物を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。別々のチューブで各処理を行い、すべての所望のウェルについて繰り返します。チューブを遠心分離し、室温でアルデヒド固定液から4%の300マイクロリットルにペレットを再懸濁します。30分後、ペレットを500マイクロリットルのPBSで洗浄する。500マイクロリットルの0.1%トリトンX 100をチューブに追加します。チューブを室温で1時間インキュベートします。次に、チューブをローテーターまたはシェーカーに200 RPMで2〜8°Cで15分間置きます。最後のインキュベーションの後、PBS Tに500マイクロリットルの10%NDSを加え、室温で45分間インキュベートします。インキュベーション中に、一次抗体溶液を調製します。翌日、ペレットのサイズに応じて250〜500マイクロリットルのPBS Tをチューブに加え、摂氏2〜8度で1時間、200RPMでローテーターまたはシェーカーに置きます。200マイクロリットルの二次抗体溶液を加え、暗所で摂氏2〜8度でチューブをインキュベートします。翌日、チューブを回転させ、100マイクロリットルの上清を除去して、染色された頂端アウトエンテロイドの取り付けに進みます。残りの100マイクロリットルの上清に細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を500マイクロリットルのチューブに移します。チューブをミニ遠心分離機で20秒間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを100マイクロリットルの室温遠赤色核酸染色剤に再懸濁する。20分間のインキュベーション後、細胞を遠心分離し、ペレットを100マイクロリットルのPBSに再懸濁します。2回目の洗浄および遠心分離の後、70マイクロリットルの上清を除去し、ペレットをPBSの残量に再懸濁する。次に、セル懸濁液をラベルの付いた24 x 60ミリメートルのカバースリップに移します。75マイクロリットルの封入剤を試料に直接塗布し、ピペットチップで気泡を取り除きます。暗闇で一晩硬化させた後、グリセロールの薄層をカバースリップに塗布し、カバースリップをスライドガラスに取り付けて、所定の位置にそっと押し込みます。タップして、カバースリップとスライドの間の気泡を取り除きます。カバースリップを室温で暗所で2時間セットしてから、共焦点顕微鏡で20倍の倍率でエンテロイドをイメージングします。腸管治療の場合、本文に記載されているように、皿モデルで24時間根尖性壊死性腸炎を確立します。アッセイを実行する前に、各ウェルから100マイクロリットルの培地を取り除き、残りの400マイクロリットルを残します。400マイクロリットルの細胞生存率アッセイ試薬を各ウェルに加えます。内容物をプレートシェーカーで200 RPMで5分間激しく混合し、細胞溶解を誘導します。次に、200マイクロリットルを96ウェルクリアボトムプレートの単一ウェルに移します。残りの600マイクロリットルについても繰り返し、ウェルごとに4つのテクニカルレプリケートを作成します。発光が可能なプレートリーダーを使用して、0.25ミリ秒積分で値を記録し、処理間の相対値を比較します。コントロールの代表的な免疫蛍光染色により、内腔に向かう核の頂端部局在と上皮の外縁での悪役の検出が確認されました。対照と比較して、リポ多糖、腫瘍壊死アルファ、または低酸素症単独への曝露は、総細胞形態E-カドヘリンまたは悪役局在または蛍光強度の明白な変化を誘発しなかった。低酸素症と組み合わせたリポ多糖または腫瘍壊死アルファによる治療は、上皮構造を破壊し、ECA聴覚の喪失および悪役染色によって明らかにされた接着接合部およびブラシ境界タンパク質発現の有意な喪失を示した。頂端アウト細胞生存率は、正常酸素または低酸素条件下で決定した。対照と比較して正常酸素条件下では、リポ多糖または腫瘍壊死αはエンテロイドの細胞生存率に有意に影響しなかった。しかし、低酸素症単独と比較して、低酸素症と組み合わせたリポ多糖または腫瘍壊死アルファでは、生存率の有意な低下が観察されました。.アピカルアウトインアディッシュモデルを確立しながら。EDTAをセル懸濁液の氷冷状態に保つことを忘れないでください。これにより、極性反転が強化され、すべてのECMが適切に液化および除去されます。QPCR、RNA-seq、ウェスタンブロッティング、バリア透過性の機能評価などの他のダウンストリームアプリケーションは、低酸素状態における炎症性シグナル伝達に対する応答を特徴付けるためにさらに実行できます。

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Research

JoVE Journal

Medicine

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このビデオは、リポ多糖類治療によって誘発されるヒト由来の新生児腸内モデルにおける壊死性腸炎疾患の発症を示しています。このモデルは、腸の病態生理学を研究するのに役立ちます。...

ヒト上皮腸質モデルにおける壊死性腸炎の誘発

Enteroids 人間の病気の研究に新たなモデルとして浮上しています。プロトコルでは、新生児の組織から生成された enteroids のリポ多糖 (LPS) 治療を使用して人間の壊死性腸炎の enteroid モデルをシミュレートする方法について説明します。収集した enteroids...

壊死性腸炎新規ヒト上皮 Enteroid モデル

壊死性腸炎(NEC)は、未熟児、特に超低出生体重児にしばしば発生する最も重篤な胃腸(GI)疾患であり、死亡率が高く、病因が不明である。NECの原因は、炎症性免疫調節系の異常に関係している可能性があります。NECの動物モデルは、NECの疾患免疫研究に欠かせないツールです。NECの動物モデルは通常、C57BL/6J新生児マウスを使用します。BALB/c新生児マウスはめったに使用されません。関連する研究は、マウスが感染すると、C57BL/6Jマウスと比較して、THB細胞分化がBALB/cマウスにおいて優勢であることを示した。研究によると、NECの発生と発達はTヘルパー2型(Th2)細胞の増加と関連しており、一般に感染を伴うことが示唆されています。そこで本研究では、新生児BALB/cマウスを用いて、NEC小児と同様の臨床特性と腸管病理学的変化を有するNECモデルを誘導した。この動物モデルがNECにおけるTh2細胞応答を研究するために使用できるかどうかを判断するために、さらなる研究が保証されている。...

壊死性腸炎の新生児BALB/cマウスモデル

このプロトコルは、非ヒト霊長類回腸から単離された3次元(3D)エンテロイドに由来する2次元(2D)単層上で引っかき傷アッセイを確立して実行する方法を記載する。...

エンテロイド由来単分子膜を用いた早産小腸障害および治癒の in vitro モデルに対するヒアルロン酸35 kDaの効果

このプロトコルは、胎児の腸組織からの3次元腸モデルであるエンテロイドの確立を詳述しています。上皮バイオマーカーの免疫蛍光イメージングをモデルの特性評価に使用しました。細菌性エンドトキシンであるリポ多糖の頂端曝露は、マイクロインジェクション技術を用いて、蛍光デキストランの漏出によって測定される用量依存的に上皮透過性を誘導した。...

胎児組織由来エンテロイドの上皮透過性の試験

本プロトコルは、腸透過性を決定するために頂端外腸介様モデルにおいてルシファーイエローを利用する方法を概説する。この方法は、壊死性腸炎などの炎症性腸疾患をモデル化するエンテロイドにおける傍細胞透過性を決定するために使用することができる。...

根尖腸管モデルにおけるルシファーイエローを用いた腸透過性の決定

大腸菌は、出生前後に細菌を摂取した新生児に敗血症を引き起こします。大腸菌が腸管から血流に移動する能力に関与するプロセスは、よく理解されていません。このin...

新生児大腸 菌 分離株の腸管トランスサイトーシスの評価

このプロトコルは病気の病因に機構の調査に使用することができる壊死性腸炎(NEC)の 生体外の モデルを記述する。ヒト新生児の腸、内皮細胞、および重度のNECの新生児の腸内細菌叢に由来する腸内エンテロイドをシードしたマイクロ流体チップを特徴としています。...

ヒト新生児腸管内腸内細菌叢と腸内細菌叢異常体を組み込んだ壊死性腸炎のマイクロ流体モデル

このプロトコルは、壊死性腸炎(NEC)の新生児マウスモデルと、その後の新生児マウス小腸からの固有層免疫細胞の単離の概要を説明します。...

壊死性小腸炎の新生児マウスモデルと免疫細胞プロファイリングのためのLamina Propria分離

我々は、セットアップする方法を示しています...

における幹細胞移植 in vitroで模擬虚血/再灌流モデル

学ぶ頂端外エンテロイドモデルを用いた壊死性腸炎のインビトロ解析法。小腸エンテロイドの極性反転により頂端表面へのアクセスを可能にし、経口治療薬の効果的な評価と上皮障害の免疫蛍光染色解析を実現します。

インビトロ壊死性腸炎の頂端外腸炎モデル

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インビトロ 壊死性腸炎の頂端外腸炎モデル

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