Name: ナノフローサイトメトリーによる単一細胞外小胞膜貫通タンパク質の特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 学ぶナノフローサイトメトリーによる単一細胞外小胞のラベルフリー解析法。14ナノメートル以上の粒子を個別計測し、偽陽性を除去して高精度データを取得します。プラズマや培養液由来のEV解析に応用可能です。

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オーウェン・デイビスとニック・ピークのグループが資料と専門知識を提供し続けてくれたことに感謝します。

1. nFCM装置のセットアップとnFCM規格の測定
注:nFCM機器の正しいアライメントを検証し、機器間の強力な比較を提供するために、サンプルのデータ取得を開始する前に3回の測定が行われます。これらは、濃度標準/品質管理(QC)、サイズ標準、およびブランクです。
<ol><li>QCビーズを蒸留水で1:100に希釈し、適切な0.6 μLチューブに入れ、ローディングベイに入れます。</li>
	<li>サンプルフロードロップダウンメニューからブーストを選択してQCサンプルをシステムに45秒間導入し、以前のサンプル/洗浄液を完全に置き換えます。<ol><li>ブースト中は、レーザー出力をQCビーズのプリセットテンプレート「250 nm FL QC標準」に設定します(例:青色レーザーの場合は10 / 40 mW、赤色レーザーの場合は20 / 50 mW、SS減衰率は0.2%)。</li>
	</ol></li>
	<li>同じダウンメニューから サンプリング 圧力を選択して、システム圧力を下げます。</li>
	<li>自動サンプリング圧力を1.0kPaに設定して、一定の圧力を維持します。</li>
	<li>1分間の解析を開始するには、集録コントロールから [記録までの時間 ]を選択します。データは、SS強度と選択したFL強度の対数スケールを示すドットプロットにプロットされます。</li>
	<li>ファイルを保存する前に、ファイル名とサンプル希釈液を挿入してください。</li>
	<li>アンロードを選択して、ローディングベイからチューブを取り外します。150 μLの洗浄液と交換し、[ ブースト ]を選択して>30秒間洗浄してから、[ アンロード]を選択して洗浄液を取り除きます。<ol><li>150 μLの水を含むチューブを使用して、キャピラリーチップから余分な洗浄液を取り除きます。</li>
	</ol></li>
	<li>サイズ標準ビーズを水で1:100に希釈し、100 μLをローディングベイにロードしてから、サンプルを45秒間 ブーストします 。</li>
	<li>レーザー出力をプリセットテンプレート「S16 exo 68-155 nm」に設定します。この設定は、サイズ標準と200nm<EVを含むサンプルの両方を対象としています。たとえば、青色レーザーの場合は15 / 40 mW、赤色レーザーの場合は20 / 50 mWで、SS減衰率は0.2%です。</li>
	<li>[サンプリング]を選択し、前と同じように1分間サンプルの記録に進みます。</li>
	<li>水またはPBSサンプルを使用して3回目の測定を行い、溶離液のブランク測定値を作成し、ソフトウェアによる除去のために偽陽性を特定します。標準測定値の入力については、次のセクションで説明します。</li>
</ol>2. 非標識サンプルの粒子濃度の測定とPDFレポートの生成
<ol><li>非標識EVサンプルをPBSでnFCM分析に適した粒子濃度範囲(1 x 10 8- 5 x 108粒子/mL)に希釈します。希釈したサンプル10〜100 μLをローディングベイにロードします。</li>
	<li>粒子濃度が不明な場合は、EVサンプルを1:100に希釈することから始めます。サンプル濃度は、ブースト中のCCDカメラのレーザースポットのサイズ、またはサンプリング中のイベントバーストトレースの観察によって迅速に近似できます。</li>
	<li>サンプリング を選択する前に 、ロードされたサンプルを45秒間ブーストし、1分間記録して、前述のように保存します。</li>
	<li>このデータの分析を開始するには、[ 集録] タブから[ 解析 ]タブに切り替えます。保存した nfa ファイルを開きます。</li>
	<li>正確なサンプル測定を可能にするには、サンプル測定の前に行われた2つの標準測定を使用して、サンプル比較の値とブランクを設定します。</li>
	<li>SSから直径への変換のために、最初にサイズ標準ファイルを選択し、しきい値設定ツール(自動しきい値とも呼ばれる)を使用して、サイズ標準曲線を作成します。イベントバーストトレースに表示されるしきい値は、イベントが有意と見なされるために必要な最小信号強度を識別します。</li>
	<li>しきい値を設定した状態で、ドットプロットのxパラメータとyパラメータがx軸がSS-HまたはSS-A、y軸がFITC-Aであることを確認します。</li>
	<li>検量線生成ツールを開き、サイジングテンプレートとして S16 exo 68-155 nm を選択します。[ピーク の検索] をクリックして、ピークSS強度を直径68、91、113、または155 nmの粒子として特定します。</li>
	<li>ウィンドウを閉じる前に、SSから直径への曲線が1に近いr値で生成されているかどうかを確認してください。</li>
	<li>保存したファイルを選択し、[ STDのカウント]をクリックして、濃度基準を設定します。標準の粒子濃度を入力します。</li>
	<li>標準情報を設定したら、EVサンプルファイルを選択し、しきい値を設定します。</li>
	<li>空のファイルを選択し、[ 空白に設定 ]をクリックして、サンプル数から削除する誤検知の数を特定します。これは、サンプルと同じしきい値で実行する必要があります。EV サンプル ファイルに戻ります。</li>
	<li>PDF 生成ツールを開き 、[サイズと濃度] を選択します。サンプルの希釈液を入力します。試料の濃度と粒子のサイズ分布が示されています。</li>
</ol>3. サンプルラベリング
注:懸濁液中の粒子の包括的な分析には、2つの染色戦略を同時に使用できます。ラベリングプロトコルでは、多くの場合、新しい抗体またはサンプルソースの最適化が必要です。
<ol><li>EVサンプルの一部をPBSで1.25 x 1010粒子/ mLの濃度に希釈します。希釈したEVサンプル8 μLを抗体1 μLおよび色素1 μLでインキュベートし、粒子濃度を1 x 10 10 10 粒子/mLにします(全粒子は1 x 108を10 μLに懸濁します)。この場合、抗体のインキュベーション比は1:50(1:5抗体1 μL)です。<ol><li>最適化中に3種類以上の異なる濃度の抗体または色素を使用して、選択した標識を過飽和にすることなく最大のエピトープ結合を可能にすることを示すデータを提供し、低強度蛍光イベントの同定を損なう可能性があります。メンブレン色素のインキュベーション濃度は40 nM(400 nMの1 μL)です。</li>
	</ol></li>
	<li>10 μLのサンプルを5秒間ボルテックスして混合し、暗所でRTで30分間インキュベートします。 注: コントロールに関する推奨事項は、ディスカッションに含まれています。</li>
	<li>インキュベーション後、標識サンプル1 μLを取り、0.6 mLチューブでPBSで1:50に希釈します。</li>
	<li>サンプルをローディングベイにロードし、45秒間ブースト圧力をかけます。レーザー設定が正しく、適切なレンズがロードされていることを確認します。</li>
	<li>サンプリング圧力に切り替えて 、[記録する時間]を選択します。1分間の集録後、データファイルに名前を付けて保存します。</li>
	<li>サンプルをアンロードし、洗浄液と交換します。次のラベル付きサンプルをロードする前に、これを>30秒間ブーストします。</li>
</ol>4. nFCM分析-亜母集団分析のためのPDF生成
<ol><li>PDF の生成には、以前と同じ標準を適用します。空白の測定値のみが異なって設定されます。</li>
	<li>サンプル ファイルを選択し、しきい値を設定します。ドットプロットで、y軸を変更して、緑または赤のチャンネルからのFL測定値を表示します。</li>
	<li>正方形のゲーティングツールを選択し、左クリックしてFL +母集団の周りに正方形を描画します。</li>
	<li>空の測定ファイルを開き、[ 空白に設定 ]をクリックしてから、サンプルファイルに戻します。</li>
	<li>前と同じようにPDF生成ツールを開くと、FL+部分母集団のサイズ分布、濃度、およびパーセンテージ(すべてのSS+イベントと比較)が識別されます。<ol><li>「合計、P1、P2など」として識別された関心のある部分母集団ごとに繰り返します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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A.L.、B.P.、D.A.、R.L、R.TはNanoFCMの従業員であり、この論文への貢献は彼らの雇用の一部として行われました。

サンプルと試薬の詳細 別々の細胞株からの2つのEV分離株を、蛍光標識とその後のnFCM分析のデモンストレーションのために選択しました。両方のEVセットをPBSに懸濁し、-80°Cで<3か月間保存しましたが、他のほとんどの条件は分離株間で異なっていました。C2C12マウス筋芽細胞株は、骨格筋細胞の胚前駆体を表し、2D培養で増殖させ、超遠心分離によるEV単離の72時間前に増殖培地をコンディショニングしました。SW620はヒト結腸腺癌細胞株であり、初歩的なバイオリアクターで増殖し、培地を7週間にわたって濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)およびセファロースCL-2Bカラムから溶出した画分7〜9を単一のサンプルに結合してEV単離しました。
CCMから分離および濃縮されたEVは最も扱いやすいサンプルタイプですが、nFCMは、血清、血漿、尿、CSFなどの生体液を含むほとんどのEV分離株に適用できます。これらのサンプル分析は、すべての粒子のnFCM SS検出の恩恵を受け、NTA、TRPS、およびその他の粒子分析との裏付けを可能にしながら、蛍光標識されたEV亜集団を定量的および全体の割合で記述し、マルチパラメータ粒子分析の公平なアプローチを実現します。未清澄尿やEV濃縮CCMなど、低処理サンプルの分析も可能ですが、低汚染タンパク質が必要であるという警告があります。
ここで用いられる膜色素は、脂質二重層に一体化するものであり、膜装填のための親油性部分と、原形質膜25中に残存するための親水性色素とを有する。現在、完璧なEVラベリング色素はなく、EVへの特異性、固定または透過処理への適合性、EVラベリングの効率など、いくつかの基準を考慮する必要があります26。
表面露出エピトープの蛍光標識抗体標識は、EV亜集団を同定するための有効な方法であることが証明されています27。プロトコル最適化の重要な側面は、周囲のバッファーを蛍光未結合抗体で満たすことを可能にすることにより、低蛍光粒子の検出を阻害することなく、利用可能なすべてのエピトープに結合する標識飽和点を満たし、超えないことです28。さらに、抗体標識のための露出した結合部位の利用可能性は、いくつかの要因の影響を受ける可能性があります。EVの保管条件は、EVの濃度およびサイズプロファイルに影響を与えることが示されており、 観察結果は抗体標識30への影響も示しています。表面コロナタンパク質の存在、タンパク質修飾、および分離技術の影響も、場合によっては抗体標識に影響を与える可能性があります。最終的に、EV研究で蛍光標識の利用が普及するにつれて、複数の分析技術の実験デザインと最適化がより洗練されるでしょう。
結果の精度を高めるために、(1)PBS +色素コントロール、nFCM分析でSS +粒子として現れる可能性のある一部の色素におけるミセルまたは凝集体形成を評価する、(2)PBS +抗体コントロール、凝集体が発生する可能性がありますが、SS検出に十分な光を散乱させるのに十分な大きさではないことがよくあります。 (3)EVサンプル+ IgG抗体コントロール、 フローサイトメトリーで一般的で、非特異的結合の同定に使用される、(4)非EV粒子サンプル+抗体/色素コントロール-複雑な粒子サンプル、精製低密度リポタンパク質(LDL)粒子やEV枯渇/アブレーションサンプルなどのコントロールは、選択的標識を検証するためのネガティブコントロールとして機能する可能性がある、(5)ポジティブコントロールは設計が難しいが、細胞上の抗体の検証は有用なインクルージョンです。
EVでのテトラスパニンのプレゼンテーション この実験の抗体およびメンブレン標識は、nFCM分析によって短い時間枠で取得できる高レベルの定量データを実証しています。粒子径/濃度の主要な物理的特性を膜および/またはタンパク質の存在の表現型測定と同時に測定することで、粒子分離内の亜集団の高レベルの記述が可能になります。
重要なことに、これら2つのEVサンプルでは、3つの「重要な」EV関連テトラスパニン、CD9、CD63、CD81のさまざまなレベルが同定されました。CD9は、C2C12由来のEVとSW620の両方でEVの最大の割合で提示され、CD81とCD63はそれぞれ2番目と最も提示されていないタンパク質でした。
2つの非常に異なる細胞源からのEVのテトラスパニンプロファイルでここで観察されたいくつかの類似性にもかかわらず、CD9、CD63、およびCD81のレベルは、細胞株と患者由来のEVの間で非常に異なる可能性があります31。
2つのEVサンプル間のCD63発現の違いは、「EVらしさ」の主要な識別子に関する進行中の議論に特に関連しています。SW620 EVのわずか~8%にCD63が発現することは予想外かもしれませんが、CD63はサイズまたは密度によって分離された異なるタイプのEVの識別不良として示唆されており32、テトラスパニン陰性EVは、エキソソーム様と記載されている場合でも同定されています33。
複合粒子分離におけるEVの同定 細胞株EVと患者由来EVの両方におけるEVテトラスパニンプロファイルの不均一性は、テトラスパニンベースのEV捕捉への依存に対する警告であり、新しいEV同定方法の将来の必要性を強調しています31。特定のタンパク質に依存しないEV標識は、EV特異性が非常に高いことが証明されれば、同様のサイズの非EV粒子からEVを同定するのに非常に有益であることが証明される可能性があります。これは、ヒト血漿中のEVの濃度が1010粒子/ mLの範囲にあるのに対し、リポタンパク質は1016 / mL 14,34で測定されることが示唆されているため、生体流体EV分離物に特に当てはまります。EV濃縮時でさえ、テトラスパニンマーカーおよび/またはLDLマーカーApoBの粒子陽性を比較する研究は、EV35と比較して、無血小板血漿(PFP)サンプル中のLDLの存在量が~50~100倍多いことを示唆しています。
使用される単離技術は、超低密度リポタンパク質(VLDL)、中密度リポタンパク質(IDL)、LDL36などの共単離された非EV粒子の範囲に大きく影響します。EVに結合したリポタンパク質共単離物の説明もあり、重要な生物学的役割を果たす可能性がある一方で、EVの純粋なサンプルを達成することは困難な目標35です。
したがって、純粋ではあるが限られたEVの選択を分離することよりも、サンプルを構成する粒子の記述に重点を置くべきであると主張することができます。テトラスパニンの存在量をバルクで測定し、粒子数を別々に測定することによって粒子の包括的な記述を達成することは、特に生体流体源からのEV濃度を正確に決定するには不十分である可能性があります36,37。この実験で実証されているように、層ベースのアプローチで亜集団を特定し、特定のタンパク質を提示する全粒子、EV、およびEVを示すことは、ナノ粒子の特性評価に対する堅牢なソリューションを提供する可能性があります。これは、将来の治療用途20の設計を伴うEV搭載や、ミトコンドリア38などの管腔貨物によるCD63+ EVの同定を含むプロジェクトに当てはまります。
EV分析のレパートリー内のnFCM nFCM EV分析の強みは、データが最も一般的なEV分析を裏付けて構築し、物理データセットと表現型データセットの間にブリッジを形成する方法です。ただし、これは正確な標識プロトコルに基づいており、多くの場合、色素や抗体などの独自の標識試薬用に最適化する必要があります。正確な分析のための重要な基準は、標識粒子を非蛍光バッファーに懸濁させることであり、これは過剰な未結合蛍光色素の除去またはエピトープ飽和を超えないようにプロトコルを改良することに依存します。
比較研究では、EVのnFCMサイジングは、EVサイズ分析においてNTAよりも正確であると説明されているTRPSおよびクライオTEMに沿ったデータを提供することが示されています10,39。しかし、他の光学ベースの方法と同様に、データを解釈する際には、EVに見られる不均一な光学特性の影響、および標準物質とEVの光学特性の違いを認める必要があります10。
ウェスタンブロッティングは、EVマーカー40の同定を通じてEV濃縮を示すための重要な方法である。しかし、粒子上のそのようなマーカーの存在を実証したいという願望は、EVベースのフローサイトメトリー分析の進歩を推進しました17。ただし、堅牢なデータを提供するために必要な解像度は、現在、散乱光と蛍光灯の両方に関して専用の機器によって最もよく達成されています19。
nFCMは、側方散乱測定を使用して、特定のマーカーに関係のないすべての粒子を最初に記述する公平なアプローチを提供し、NTA、RPS、およびTEM1の最も一般的な手法による裏付けを可能にすると同時に、WBまたはElisaと同様の表現型測定を定量的に追加します。

EVとは? 細胞外小胞(EV)は、多くの正常な細胞および組織活動に不可欠な一連の細胞由来の膜状粒子の総称です。幅広い科学分野への影響と潜在的な臨床的関連性により、EV研究と産業への関心が高まっています1。小型EV(sEV)の研究は、主に、成熟前に初期エンドソームで形成を開始し、多胞体(MVB)を原形質膜に融合させて放出する40〜100 nmの粒子であるエキソソームと、原形質膜から直接芽を出して80〜1,000 nmの粒子を形成するマイクロベシクルに焦点を当てています2。3番目のEV集団はアポトーシス小体であり、細胞死中に形成される50〜1,500 nmの粒子は、他のEVとの相対的な割合が大きく変動することを意味します3。
EVの特性は、起源の細胞/組織に生じる変化を表す可能性があるため、診断に使用できる可能性があります。さまざまな「オミクス」解析により、細胞起源と病状のマーカーが特定され始めており、血漿/血清、尿、唾液、脳脊髄液(CSF)などのEV源を使用する患者の非侵襲的評価が可能になる可能性があります4,5。これらのEV関連のイノベーションの背後にある原動力は、以前の制限を克服する新しい特性評価技術です。
単一EVの特性評価の必要性と課題 単一EVの特性評価は、EV分離株の検証と記述の両方、およびEVベースの治療と診断の進行のためのこれらのナノ粒子の重要な特徴の解明にとってますます重要になっています6。EVの供給源および使用目的に応じて、純度の分析は、EVと非EV粒子の比率、またはEVと遊離タンパク質の比率として説明されることが多く、複数の分析からの大量のデータを必要とする場合があります7。
EVの出版物における粒子計数およびサイジング測定は、以前はナノ粒子追跡(NTA)、抵抗パルスセンシング(RPS)、および電子顕微鏡(EM)2に大きく依存していました。標準のNTAおよびRPSには、EVと非EV粒子を区別する機能がなく、スループットが遅い8やNTA9、10、11で見られる検出の不適切な下限などの独自の注意点があります。
テトラスパニンCD9、CD63、およびCD81は、歴史的にEVの分離/調製物におけるEVの存在の重要な識別子でした。一般的に、ウェスタンブロッティング(WB)およびドットブロッティング技術を使用して、細胞ライセートと比較したEV分離株中のこれらのタンパク質の濃縮を示します12。しかし、これらの方法に対する定量の欠如と、EV亜集団内の表示と細胞、組織、または患者関連の変動の両方に関するこれらのEVマーカーの不均一性は、物理的および表現型の特徴付けを統合する高度な分析技術を促進します13。
包括的なEV分析技術としてのナノフローサイトメトリー 真のEV濃度を決定するには、特に複雑な粒子分離物において、無傷の粒子とユニバーサルマーカーを識別し、すべてのEVを検出しながら非EV粒子と区別できる分解能が必要です14。
ナノフローサイトメトリー(nFCM)は、45〜1,000 nmのサイズの粒子の非標識分析を可能にすると同時に、蛍光標識と検出を利用して粒子亜集団を特定する技術です。従来のフローサイトメトリーとの主な違いは、ナノ粒子分析専用の機器を使用していることであり、最大の分解能を実現しています15。小粒子分析に転用された従来のフロー計装を使用するEV分析は改善されていますが、<100nmのEVを検出および分析するための分解能を達成するのにまだ苦労しています16,17。ビーズベースのフローサイトメトリーは、EV分析によく使用されるさらなる適応ですが、これにより単一粒子検出の可能性がなくなり、キャプチャベースのバイアスが導入されます18。
nFCMは、EV分析用の側方散乱(SS)チャネルの検出下限が~45nmであるため、SSトリガーを利用します。これは、イベントがSSシグナルを提供し、蛍光強度の分析前に設定されたしきい値を超える必要があることを意味するため、「粒子優先」分析と考えることができます。これにより、膜の劣化や蛍光色素の凝集などの偽陽性が排除され、分析はインタクトなEVに集中します15。SS測定は、4モーダルシリカナノスフィア標準19と比較して個々の粒子のサイズを決定するためにも使用されます。蛍光測定はさらに2つの検出器で行われ、EV亜集団を識別するために粒子濃度、サイズ、マーカーまたは他のターゲットの存在を記述するために、各粒子について3つの同時測定が可能になります20。
以下の実験では、SSおよび蛍光(FL)測定を使用して、>45 nm粒子を測定し、膜陽性EVのサブセットを示し、EV亜集団に関するCD9、CD63、CD81の提示を特定します。これらの亜集団の濃度と、SSによって測定された全粒子の一部としてのそれらの比率の両方が、それらのサイズプロファイルと同様に説明されています。

<table><tbody><tr><td>APC 抗 CD81 抗体 (M38)</td><td>abcam</td><td>ab233259</td><td>抗ヒト CD81 APC 標識抗体</td></tr><tr><td>APC 抗 CD9 抗体 (EM-04)</td><td>アブカム</td><td>ab82392</td><td>抗マウス CD9 APC 標識抗体</td></tr><tr><td>APC 抗CD9 抗体 (MEM-61), 希釈済み</td><td>abcam</td><td>ab82389</td><td>抗ヒト CD9 APC 標識抗体</td></tr><tr><td>APC 抗マウス CD63 抗体</td><td>バイオレジェン</td>ド <td>143905</td><td>抗マウス CD63 APC 標識抗体</td></tr><tr><td>APC 抗マウス/ラット CD81 抗体</td><td>バイオレジェン</td>ド <td>104909</td><td>抗マウス CD81 APC 標識抗体</td></tr><tr><td>CD63 モノクローナル抗体 (MEM-259), APC</td><td>invitrogen Via フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A15712</td><td>抗ヒト CD63 APC 標識抗体</td></tr><tr><td>セリーヌ AD1000 バイオリアクター</td><td>メルク</td><td>Z688037-5EA</td><td></td></tr><tr><td>洗浄液</td><td>NanoFCM</td><td>17159</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>Gifted</td><td></td><td>Mouse line</td></tr><tr><td>EVSs from SW620</td><td>Gifted</td><td></td><td>Human line</td></tr><tr><td>Memglow - Fluorogenic Membrane Probe</td><td>Cytoskeleton</td><td>MG01</td><td>non toxic cell membrane dye</td></tr><tr><td>NanoAnalyzer</td><td>NanoFCM</td><td></td><td>単一粒子の測定用ナノフローサイトメーター</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.2</td><td>Gibco Via Fisherscientific</td><td>12549079</td><td>サンプルと抗体の希釈用塩溶液</td></tr><tr><td>スナップロック マイクロチューブ, 0.60mL</td><td>Axygen Via フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11371944</td><td>サンプルをナノアナライザーにロードするために必要なチューブ</td></tr></tbody></table>

ナノフローサイトメトリーによる単一細胞外小胞膜貫通タンパク質の特性評価

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

単一粒子の特性評価は、バルク分析技術や第1世代の粒子分析から、ナノフローサイトメトリー(nFCM)などの包括的なマルチパラメーター測定へと進歩し、細胞外小胞の研究にとってますます重要になっています。nFCMは、ナノ粒子分析用に特別に設計された機器を利用するフローサイトメトリーの一種であり、染色技術の使用の有無にかかわらず、毎分数千のEVの特性評価を可能にします。高分解能側方散乱(SS)検出により、45 nmを超えるすべての生物学的粒子のサイズと濃度を測定でき、同時蛍光(FL)検出により、標識マーカーと目的のターゲットの存在を特定できます。標識された亜集団は、粒子の量単位/ mLで、または側方散乱によって識別される全粒子のパーセンテージとして記述できます。
ここでは、馴化細胞培養培地(CCM)由来のEVは、脂質色素、膜を有する粒子を同定すること、およびCD9、CD63、およびCD81に特異的な抗体を一般的なEVマーカーとして標識する。比較材料、シリカナノスフィアの濃度標準、サイズ標準、および標識されたサンプル材料の測定値を1分間の分析で分析します。次に、ソフトウェアを使用して、標識に関係なく、すべての粒子の濃度とサイズ分布プロファイルを測定してから、各標識に対して陽性の粒子を決定します。
SSとFLの同時検出は、外部と内部の両方の多くの異なるEVソースとラベリングターゲットで柔軟に利用でき、EVサンプルを包括的かつ定量的に記述します。

SW620由来のEVおよびC2C12由来のEVに関するテトラスパニンのプレゼンテーション さまざまなソースからのEV上の主要なテトラスパニンCD9、CD63、およびCD81の存在量の最新の分析により、バルク分析とEV亜集団に関するプレゼンテーションの分析の両方で、それらの存在の極端な変動性が浮き彫りになりました21。これは、ESCRT依存性および独立性経路などの異なる生合成経路の利用可能性に関連している可能性が高い22。
図1では、CD9はC2C12 EVの最大の割合が~50%で、CD63は~30%でしか提示されていません。1回のインキュベーションで3つの抗テトラスパニンすべてで標識を行った場合、~70%の粒子が少なくとも1つのEVマーカーを提示することが示されました。繰り返し測定では、C2C12 EVのCD9/63/81ラベルの標準偏差は~3.8%と最も低く、CD81ラベルのC2C12 EVでは~8.1%でした。
SW620由来のEVは、異なるテトラスパニンプロファイルを示し、最も提示されたCD9の差が~40%と最も提示されていないCD63の差が~7%ではるかに大きかった。C2C12 EVと同様に、CD9はテトラスパニン陽性集団の大部分に存在し、CD9/63/81複合標識により、粒子の~42%が3つのマーカーのうち少なくとも1つを有することが特定されました。
C2C12由来の粒子の大部分、つまりSS+集団全体は、サイズが45〜120 nmの範囲で、直径の中央値は~65 nmでした。 図1に示す単一のテトラスパニン標識EV亜集団のそれぞれのサイズプロファイルは互いに類似しており、粒子集団全体と比較して、~75-85 nmの中央値が大きく、&lt;65 nmのEVが少ないことを示しています。
SW620由来の粒子は45-160 nmの範囲で、中央値は~65 nmで、歪んだ分布を示しました。テトラスパニン標識EVは、90〜110 nmの間でより正規分布とより大きな中央径を示し、個々のテトラスパニン陽性亜集団間で同様の分布を示します。
最も多く提示されたテトラスパニンと最も提示されないテトラスパニンはこれら2つの細胞株で同じですが、それらの比例表現は大きく異なり、CD9陽性とCD9/63/81陽性の違いから観察できるテトラスパニンの潜在的な共提示の間には興味深い違いがあります。
EVメンブレン標識と抗体標識の組み合わせ EVの二層膜は、より一般的な標識標的を提供し、タンパク質凝集体および脂質単分子膜を有するLDLのいくつかの形態などの類似サイズの非EV粒子との区別を可能にし得る23。EV研究で使用されるいくつかの一般的な膜色素が非EV粒子にも結合することが示されているため、このタイプの標識の特異性を検証する必要があります24。
メンブレン標識は、C2C12由来のEVおよびSW620EVの~80%の陽性を繰り返し示しました。SS強度(SS-H)は、 図2に示すC2C12とSW620の両方の結果のドットプロットでFITC強度と良好な相関を示しています。これは、SS強度が粒子サイズ、したがって膜表面積に関連しているため、予想されます。
抗体標識されたEVの大部分は、テトラスパニン陽性の割合と非常によく似た二重陽性パーセンテージ(FITC+およびAPC+)を示すメンブレン標識に対しても陽性でした。FITCとAPCのドットプロットは、メンブレン標識とテトラスパニン標識の間にわずかな相関関係を示しており、CD63標識はメンブレン標識と最も弱い相関関係を示しているようです。抗体標識には陽性であるが、メンブレン標識には陰性のイベントはほとんど検出されなかった。
再現性、二重ラベリング効率、および代替データ出力 nFCM実験を設計する際の重要な考慮事項は、蛍光色素または標識の相互作用です。 図3aは 、追加のメンブレン標識の有無にかかわらず抗体標識を繰り返すと、非常に類似した%陽性率測定が得られることを示しています。特に、SW620ラベルは、2つの測定セット間の変動をほとんど示しません。これは、色素と抗体結合の間の干渉が限られていることを示し、EV標識を繰り返す際の良好な再現性も強調しています。
側方散乱と蛍光の両方の強度測定は、測定された個々の粒子ごとに優れたものにエクスポートできます。これにより、平均蛍光強度(MFI)測定値を生成して、標識されたターゲットの存在量の比較近似値を提供できます。C2C12由来のEVの蛍光集団のMFIは、CD9+ EVで見られる~850のMFIと比較して、それぞれ~550および~600のMFI測定値でCD63およびCD81の提示がわずかに低いことを示唆している。この場合のMFIの測定単位はFL-Aであり、蛍光キャリブレーションに対して標準化されていません。3つの抗体すべてを使用しても、CD9標識よりもはるかに大きな蛍光は発生しません。これはSW620 MFI測定とは大きく異なり、3つの抗体すべてのカクテルを使用すると、個々の抗体標識を使用するよりも、標識されたEVに対してより大きな蛍光シグナルが得られることが示唆されます。
NanoFCMソフトウェアによって生成されたサイズ分布ヒストグラムは、3つのデータセットをオーバーレイできるようにExcelにエクスポートすることもできます。図 3 のサイズ分布プロファイルは 図 1 のサイズ分布プロファイルと似ていますが、誤差範囲が含まれています。C2C12由来のEVにおけるテトラスパニン陽性亜集団のEVサイズの中央値は、約70nmの中央値を示し、全粒子集団の60nmの平均よりわずかに大きい。テトラスパニンマーカー陽性のSW620 EVは大きく、~100 nmにピークを示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64020/64020fig01.jpg"> 図1:抗体標識により同定されたCD9、CD63、CD81陽性EV亜集団 。 (A)C2C12由来のEVについてSSによって観察された全粒子と比較した標識EVの割合を示す棒グラフ。(B)SW620由来のEVについてSSによって観察された全粒子に対する標識EVの割合を示す棒グラフ。(C)C2C12派生EVの代表的なサイズ分布プロファイル。各ヒストグラムは、3 つのデータセットの最初の測定用に生成された PDF から取得されます。(D) SW620派生EVの代表的なサイズ分布プロファイル。各ヒストグラムは、3 つのデータセットの最初の測定用に生成された PDF から取得されます。エラーバーは、同じラベル付きサンプルの三重測定値の標準偏差を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64020/64020fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64020/64020fig02.jpg"> 図2:EV亜集団を提示するCD9、CD63、CD81の膜標識および抗体標識 。 (A)C2C12EVのメンブレン+%、テトラスパニン+%、ダブル+%を示す棒グラフ。(B)SW620 EVのメンブレン+%、テトラスパニン+%、ダブル+%を示す棒グラフ。(C)膜陽性集団のゲーティングを示す代表的なSS対FITCドットプロット。(D)C2C12からのEVの二重陽性集団のゲーティングを示す代表的なFITC対APCドットプロット。(E)SW620からのEVの二重陽性集団のゲーティングを示す代表的なFITC対APCドットプロット。エラーバーは、同じラベル付きサンプルの三重測定値の標準偏差を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64020/64020fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64020/64020fig03.jpg"> 図3:繰り返し測定の変動の評価 。 (A)追加のメンブレン標識の有無にかかわらず、抗体標識陽性率を示す棒グラフ。(B)ゲート付きEVサブセットの平均蛍光強度測定。(C) C2C12 EVの三重データセットの平均サイズ分布ヒストグラム。(D) SW620 EVの3連データセットの平均サイズ分布ヒストグラム。エラーバーは、同じラベル付きサンプルの三重測定値の標準偏差を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64020/64020fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

最新世代のEV特性評価ツールは、複数のパラメータにわたる単一のEV解析を同時に行うことができます。ナノフローサイトメトリーは、標識なしで45 nmを超えるすべての生物学的粒子を測定し、さまざまな蛍光標識技術によって亜集団の特定の特性を識別します。

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

EVの詳細な特性評価は困難な場合があり、個々のパラメータを記述するために複数の機器が必要になります。ナノフローサイトメトリーのような単一の技術でこれらの重要な基準を測定すると、複数のEV亜集団が同時に記述されます。したがって、各EVは、蛍光を決定する前に、直径14ナノメートルを超える粒子をラベルフリーで識別して個別に測定されます。これにより、誤検知を排除することで堅牢なデータセットを作成できます。ナノフローサイトメトリーは、血漿、CSF、培地から濃縮されたものなど、さまざまなソースからEVに適用できます。この技術は、ウイルス、脂質ナノ粒子、およびナノ材料の分析にも使用されます。ラベル付けプロトコルを最適化することが重要です。これにより、バッファーに残っている残留蛍光と比較して、粒子に関連する蛍光が最大化されます。開始するには、機器の電源を入れ、ナノフロープロフェッショナルをロードして、[シースフロー]ドロップダウンメニューから[スタートアップ]を選択し、ローディングベイに水をロードし、[シースフロー]ドロップダウンメニューから[ブースト]を選択します。QCビーズを0.6マイクロリットルのチューブ内の蒸留水で1〜100に希釈し、ローディングベイに入れてサンプルをシステムに導入します。次に、前に示したようにサンプルを45秒間ブーストして、前のサンプル、水、または洗浄液を完全に置き換えます。ブースト中に、QCビーズのプリセットテンプレートへのレーザー出力を250ナノメートルFLQC標準に設定します。後でシステム圧力を下げるには、同じドロップダウンメニューからサンプリング圧力を選択し、自動サンプリング圧力を1キロパスカルに設定して一定の圧力を維持します。次に、集録コントロールから[記録までの時間]を選択して、1分間の分析を開始します。データは、側方散乱強度の対数スケール、および選択された蛍光強度を示すドットプロット上にプロットされます。ファイルを保存する前に、ファイル名とサンプル希釈液を挿入してください。次に、アンロードを選択して、ローディングベイからチューブを取り外します。QCビーズを150マイクロリットルの洗浄液と交換し、[ブースト]を選択して30秒以上洗浄します。150マイクロリットルの水を入れたチューブを使用して、キャピラリーチップを水に浸して、キャピラリーチップから余分な洗浄液を取り除きます。次に、サイズ標準ビーズを水で1〜100に希釈し、100マイクロリットルをローディングベイにロードします。次に、レーザー出力をプリセットテンプレートであるS16 EXO 68〜155ナノメートルに設定します。この設定は、サイズ標準と 200 ナノメートル未満の EV を含むサンプルの両方に適用されます。サンプリングを選択し、サンプルを1分間記録します。水またはPBSサンプルのいずれかを使用して3回目の測定を実行し、ブランク測定値下げを作成し、ソフトウェアによる除去のために誤検知を特定します。nFCM分析のために、非標識EVサンプルをPBSで1ミリリットルあたり10〜8〜5倍の10〜8番目の粒子の適切な粒子濃度範囲に希釈します。そして、10〜100マイクロリットルの希釈サンプルをローディングベイにロードします。粒子濃度が不明な場合は、EVサンプルを1〜100に希釈することから始めます。サンプル濃度は、ブースト中のCCDカメラのレーザースポットのサイズ、またはサンプリング中のイベントバーストトレースの観察によって迅速に近似できます。ロードされたサンプルが45秒間ブーストされたら、1分間記録し、前に示したようにファイルを保存します。記録後、このデータの分析を開始し、[取得]タブから[分析]タブに切り替えて、保存したNFAファイルを開きます。正確なサンプル測定を行うには、サンプリング測定の前に行われた2つの標準測定値を使用して、サンプル比較の値とブランクを設定します。サイズ標準ファイルを選択し、[しきい値の設定]ツールを使用して、側面散布図から直径への変換のサイズ標準曲線を作成します。イベントバーストトレースに表示されるしきい値は、イベントが有意と見なされるために必要な最小信号強度を識別します。しきい値を設定したら、ドットプロットパラメータ、X軸のSS-HまたはSS-A、Y軸のFITC-Aを確認します。[標準曲線生成]ツールを開き、サイズ設定テンプレートとしてS16 EXO 68〜155ナノメートルを選択します。[Find Peaks] をクリックして、ピーク側の散乱強度を直径 68、91、113、または 155 ナノメートルの粒子として特定します。ウィンドウを閉じる前に、直径に散乱した辺の曲線が1に近いR値で生成されているかどうかを確認してください。濃度基準を設定します。保存したファイルを選択し、カウント標準をクリックして、標準の粒子濃度を入力します。標準情報を設定します。EV サンプル ファイルを選択し、しきい値を設定します。空のファイルを選択し、[空白に設定]をクリックして、サンプル数から削除する誤検知の数を特定します。PDF生成ツールを開いたら、サンプルのサイズ、濃度、希釈を確認します。次に、サンプルの濃度と粒子のサイズ分布を示します。原稿に記載されているようにEVサンプルを標識した後、標識サンプルを1マイクロリットル取り、0.6ミリリットルのチューブでPBSで1〜50に希釈します。サンプルをローディングベイにロードし、45秒間ブースト圧力をかけます。また、正しいレーザー設定と適切なレンズがロードされていることを確認してください。次に、サンプリング圧力に切り替えて、記録する時間を選択します。1分間の集録後、データファイルに名前を付けて保存します。サンプルをアンロードし、洗浄液と交換し、洗浄液を30秒以上ブーストしてから、前述のように次のラベル付きサンプルをロードします。PDF の生成には、前に示したのと同じ標準を適用します。空白の測定値のみが異なって設定されます。サンプル ファイルを選択し、しきい値を設定します。ゲーティングツールを選択し、左クリックして蛍光陽性集団を区切る線を引きます。リプレゼンテーションの名前と色を設定します。空のファイルを設定し、[空白に設定]をクリックして、異なる母集団ごとに削除する誤検知の数を特定します。PDF 生成ツールを開き、蛍光陽性亜集団のサイズ分布、濃度、およびパーセンテージを特定します。ドットプロットで、Y軸を変更して、緑または赤のチャンネルからの蛍光測定値を表示します。空白を設定し、前述のように PDF を生成します。ドットプロットで、X軸をFITCに、Y軸をAPCに設定します。象限ツールを使用して、二重蛍光陽性集団を特定します。名前と色を代表的になるように設定し、PDFファイルを開いて蛍光亜集団を選択します。C2C12由来のEVは、約50%のCD9、30%のCD63の提示を示し、70%の集団が3つのEVマーカーのうちの少なくとも1つを提示した。単一のテトラスパニン標識EV亜集団のサイズプロファイルは、全粒子集団と比較して、約75〜85ナノメートルの大きな中央値サイズと65ナノメートル未満のEVを示しました。SW620由来のEVは、約40%のCD9、7%のCD63の提示、および42%の粒子が3つのマーカーの少なくとも1つを有することを示した。SW620由来のテトラスパニン標識EVは、より正規分布と90〜110ナノメートルの大きな中央径を示し、個々のテトラスパニン陽性亜集団間で同様の分布を示しました。膜標識は、C2C12およびSW620由来のEVの80%の陽性性を繰り返し示しました。側方散乱強度は、C2C12とSW620の両方のドットプロット上のFITC強度と相関していました。二重陽性の割合は、テトラスパニン陽性の割合と非常によく似ています。そして、CD63標識はメンブレン標識と最も弱い相関を示すようです。陽性率の測定は、追加のメンブレン標識の有無にかかわらず抗体標識の間で類似していた。C2C12由来のEVの蛍光集団の平均蛍光強度は、CD9 EVと比較してCD63およびCD81の提示が低いことを示唆したが、SW620は、3つの抗体すべてを使用することが個々の抗体標識よりも大きな蛍光シグナルを提供することを示した。 このプロトコルでは、一般的なEVマーカーが蛍光標識されていますが、抗体標的の多くはEV起源を示すように選択することができます。 EV機能、または病状。

single-extracellular-vesicle-transmembrane-protein-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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