1分子研究のためのデュアル光ピンセットとマイクロ流体工学の使用
November 18th, 2022
マイクロ流体チャンバーを介して研究される視覚的な単一分子生化学は、ガラスバレル、気密シリンジ、チューブとフローセルへのチューブの安定した接続、およびシリンジとチューブの間に切り替えバルブを配置することによる気泡の除去を使用して大幅に促進されます。このプロトコルは、DNAトランザクションと分子間相互作用の視覚化を可能にするデュアルオプティカルトラップを記述します。
チューブ付きのシリンジに嵌合するためのポートの取り付けは、正しく行われれば漏れがなく、フローセル内に気泡がなく、慎重に使用すれば、同じフローセルを使用して1年間にわたって繰り返し実験できるため、非常に重要です。ここでは、コネクタをフローセルに取り付けるための2つの簡単な方法を紹介します。これらは簡単で再現性があり、研究者はそれほど問題なくフローセルをニーズに簡単に適応させることができます。
これらのフローセルの使用は、単一分子実験を念頭に置いて行われました。特に、私たちが視覚生化学と呼んでいるものですが、マイクロフルイディクスが必要なあらゆる研究や、薄層流体の流れが使用される状況で使用できます。したがって、間違いを避けるために、貴重なフローセルを使用してテクニックを確立する代わりに、最初にスライドガラスまたはカバースリップで練習することをお勧めします。
これにより、ガラスやPDMS材料の感触をつかみ、それらの取り扱い方法や、チューブを挿入したりコネクタを接着したりするときにどれだけの力を加えるかを知ることができます。これにはいくつかのコネクタを犠牲にする必要がありますが、フローセルよりもはるかに安価です。フローセルをきれいな平らな面に置くことから始めます。
PTFEチューブを自由端から3ミリメートル離して鉗子で持ち、チューブをポートに押し込みます。残りの各ポートについて、この手順を繰り返します。入口ポートをシリンジポンプに接続し、出口を廃棄物ボトルに接続します。
各ガラスシリンジに1ミリリットルの分光測光、等級付けメタノールを充填し、それらをスイッチングバルブに取り付けます。バルブに廃棄物に向けられた出口があることを確認し、各ラインを50マイクロリットルのメタノールでパージします。出口位置をフローセルに切り替え、800マイクロリットルのメタノールをフローセルに毎時100マイクロリットルの流量で送り込み、表面を濡らして気泡を除去します。
翌日、800マイクロリットルの超純水を使用してこのプロセスを繰り返します。これで、フローセルを使用する準備が整いました。圧入チューブコネクタを使用する場合は、コネクタの片側から粘着テープを慎重にはがし、顕微鏡スライドの穴の上に置きます。
数秒間押し下げます。残りのコネクタについてもこのプロセスを繰り返します。次に、フローセルをきれいな平らな面に置きます。
PTFEチューブを自由端から3ミリメートル保持し、チューブをポートの穴に押し込みます。残りの各ポートについて、この手順を繰り返します。入口からスイッチングバルブにチューブを取り付けます。
アタッチメントを清潔で平らな面または特注のマニホールドに配置して、ボンディング中にフローセルとコネクタを所定の位置に保持します。フローセルをマニホールドの凹んだ部分に置き、アセンブリの底に少量のガラス接着剤を置き、シールを挿入します。ナノポートを顕微鏡スライドの入口穴の1つに配置します。
ゆっくりと押し下げ、横方向に動かさずに所定の位置に保持します。残りのポートについてもこのプロセスを繰り返します。マニホールド内の所定の位置に乾燥またはクランプします。
フローセルをマニホールドからそっと取り外し、アセンブリがフローセルの入力ポートとうまく位置合わせされていることを確認します。顕微鏡ステージにフローセルを置き、フィンガータイトコネクタを使用してチューブを取り付けます。各ガラスシリンジに1ミリリットルの分光測光グレードのメタノールを充填します。
各シリンジをスイッチングバルブに取り付けます。バルブに廃棄物に向けられた出口があることを確認し、各ラインを50マイクロリットルのメタノールでパージします。出口位置をフローセルに切り替え、800マイクロリットルのメタノールをフローセルに100マイクロリットルの流量で送り込みます。
翌日、800マイクロリットルの超純水を使用してこのプロセスを繰り返します。電力出力の測定値をここに示します。レーザーからのパワー出力は、レーザーヘッドを光学レイアウトに取り付ける前に測定されます。
トラップアライメントが完了すると、各トラップの対物レンズの100倍の後にビームパワーが測定されます。画像は、1マイクロメートルの蛍光ビーズの安定した光学トラップを示しています。ここで、Fは固定トラップであり、Mはモバイルトラップです。
スキャンモードのモバイルトラップが30ヘルツで大小の円を移動します。フローセル内の流体の流れは層流です。回路図は、フローセルを上から示し、チャネル間拡散が隣接する流体ストリーム間の混合の主な原因であることを示しています。
青色の矢印はフロー方向を示し、個々の河川は白、ライト グレー、および白で色分けされています。チャネル間の横方向の拡散領域の拡大領域は赤で示されています。挿入図は、下流に蛍光標識DNAビーズ複合体、上流に緩衝液のみを使用した10倍の倍率での隣接する流体流の蛍光画像を示しています。
上流の白い斑点はCCDカメラからのショットノイズです。フロープロファイルセルと層流セルは放物線状です。フローセルは側面から見て、フローの方向は各セルの上に示されます。
線形ビーズ速度は、ポンプ速度とスクロース濃度の影響を受けます。ビードにかかる反対力は、溶液の粘度の影響を受けます。ビードの直径は、流れ中のビードにかかる力に影響します。
この手順を試みるときは、作業している領域がきれいで、分光グレードのメタノールまたはアセトンでガラス表面をきれいにしていることを確認してください。この段階で、シリンジポンプにフローセルができ、ソリューションを導入して光ピンセットの実験を開始する準備が整いました。長期間使用できるフローセルを使用することで、研究者は、力を測定するか、反応を蛍光または両方の組み合わせで視覚化するさまざまな単一分子反応を調査することができました。
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概要
この記事では、視覚的単分子生化学におけるマイクロ流体チャンバーの使用について説明します。漏れや気泡なしで実験を成功させるための適切な接続と技術の重要性を強調しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- マイクロ流体工学
- 単分子生化学
- 光学トラップ
背景
- マイクロ流体チャンバーは、単分子レベルでの生化学的相互作用を研究するために不可欠です。
- ポートをシリンジに適切に取り付けることが、漏れと気泡を避けるために重要です。
- フローセルは慎重な取り扱いにより、長期間再利用できます。
- ガラススライド上で技術を練習することで、貴重なフローセルの損失を防ぐことができます。
研究の目的
- フローセルへのコネクタ取り付け方法を提示すること。
- 視覚的生化学実験を促進すること。
- 様々な実験ニーズに適応できる再現可能な技術を提供すること。
使用した方法
- チューブを用いたポートのシリンジへの取り付け。
- 気泡を排除するための切り替えバルブの使用。
- 可視化のためのデュアル光学トラップの実装。
- フローセルを使用する前に、ガラススライド上で技術を練習すること。
主要な結果
- 適切な取り付け方法により、漏れのない実験が可能になります。
- フローセルは最大1年間再利用できます。
- これらのセットアップで視覚的生化学を効果的に行うことができます。
- 方法の再現性により実験の信頼性が向上します。
結論
- マイクロ流体セットアップの適切な技術は、実験の成功に不可欠です。
- 価値の低い表面で練習することでリソースを節約できます。
- これらの方法は様々なマイクロ流体応用に適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Single-molecule visualization using dual optical tweezers and microfluidics enables direct interrogation of biomolecular mechanisms that are masked in bulk assays. This approach supports high-resolution target validation and mechanistic de-risking at early discovery inflection points. Robust microfluidic integration ensures reproducibility and operational continuity for enterprise-scale R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Direct observation of enzyme or complex stochasticity clarifies mechanistic hypotheses.
- Single-molecule manipulation enables functional target validation and pathway deconvolution.
- Controlled microfluidic environments reduce biological ambiguity and support predictive confidence.
Screening & Assay Development
- Validated flow cells provide standardized platforms for reproducible single-molecule assays.
- Laminar flow and precise fluid switching enable quantitative, high-fidelity measurements.
- Reusable microfluidic setups facilitate scalable assay development and screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Single-molecule readouts inform translational biomarker strategies when disease-relevant systems are modeled.
- Continuity from discovery to preclinical validation is supported by robust, long-term flow cell use.
- Mechanistic insights from visual biochemistry reduce risk in advancing candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and assay development, supporting hypothesis testing, mechanistic de-risking, and quantitative analytics for lead identification.
- Discovery Biology: Enables direct testing of molecular hypotheses and pathway mapping at the single-molecule level.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for comparing experimental conditions.
- Analytics: Supports measurement of force, reaction kinetics, and molecular interactions with high precision.
- Translational Research: Facilitates alignment of mechanistic findings with preclinical models when relevant.
- Enterprise Reuse: Durable flow cells and adaptable connectors allow repeated, standardized use across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and long-term usability of microfluidic platforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, optical trapping, and fluorescence microscopy.
- Demands precise instrumentation and cleanroom-level preparation to avoid contamination and bubbles.
- Standardized connector and tubing protocols are essential for reproducibility across teams.
- Adaptation to different biomolecular systems may require protocol optimization.
- Flow cell longevity depends on careful handling and regular maintenance as demonstrated.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:16
Flow Cell Connections Using a PDMS Flow Cell
2:13
Attachment of Press Fit Tubing Connectors
2:50
Attachment of Permanent Assemblies
3:39
Flow Cell Connections and Preparation
4:19
Results: The Power Output of the Laser, Fluid Flow Characteristics through a Glass Flow Cell, and Effects on Bead Motion and Opposing Force by Fluid Flow
5:59
Conclusion
