Name: 1分子研究のためのデュアル光ピンセットとマイクロ流体工学の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学ぶデュアル光ピンセットとマイクロ流体工学を用いた1分子研究の手法。フローセルの接続技術と気泡除去法により、視覚的バイオ化学実験を再現性高く実施できます。

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ビアンコ研究所での研究は、NIHがGM100156およびGM144414をPRBに付与することによってサポートされています。

1.ポリスチレンビーズによるレーザートラップの位置合わせとテスト
メモ: セットアップについては、 図1A、Bを参照してください。
注意: 実験者は、レーザービームの位置合わせ中に適切な保護眼鏡またはレーザー安全メガネを着用する必要があります。本明細書で説明する光ピンセットシステムはHeNeビームとIRビームの両方を使用するため、2セットのレーザー安全ガラス器具が必要です。
<ol><li>HeNeビームアライメント<ol><li>すべての光学部品をブレッドボードに配置します。ブレッドボードを、顕微鏡に対してできるだけ90°の角度に近づけるように位置合わせします。</li>
		<li>対物レンズとテランレンズが入った相手チューブを顕微鏡に取り付けます(図1A-11,12)。 注意: テランレンズは、接眼レンズの中間像面に画像を焦点合わせるために使用されるレンズシステムです。</li>
		<li>HeNeレーザーをオンにしてシャッターを開きます(図1A-18)。ビームは、光の50%をミラー5(図1A-5)に反射する54mmの高さでフィルター(図1A-5)に当たるはずです。ビームの残りの50%は、ミラー3と同じ高さでミラー4(図1A-4)に当たります。</li>
		<li>ミラー4(図1A-4)を調整して、ビームが51mmの高さでミラー6(図1A-6)に当たるようにします。</li>
		<li>ビームが51mmの高さで下部ガルバニックミラーに向けられるようにミラー6(図1A-6)を調整します。上部ガルバニックミラーから出るビームは57.5mmになります。</li>
		<li>このビームが57.5mmの高さでミラー5(図1A-5)に当たるように、ミラー3(図1A-3)を調整します。ミラー5で反射されると、ビームは同じ高さでミラー9(図1A-9)に当たるはずです。ビームはミラー9で効果的に再結合され、対物レンズとテランレンズシステムを通過してミラー21(図1A-21)に反射し、対物レンズに反射します。</li>
		<li>きれいな顕微鏡スライドを顕微鏡のステージに置きます。カメラの電源を入れ、固定ビームとスキャンビームのビームを画面上で個別に画像化します。ミラー3から始めて、次に5と9、最後に21で、固定ビームを画面の中央に配置するために小さな調整を実行します。</li>
		<li>ビーム出射ミラー21の角度が90°になるようにするには、顕微鏡のZ高さを変更し、スライドの上面と下面に結像したビームを配置します。それらが同一である場合、ビームはステージに垂直な正しい位置にあります。シャッター19を使用してこのビームをシャッターします(図1A-19)。</li>
		<li>ミラー4と6から始めて、固定ビームを画面の中央に配置するために小さな調整を実行します。このビームをシャッターします。</li>
	</ol></li>
	<li>赤外線(IR)ビームアライメント 注意: 安全上の理由から、すべての手順を低レーザー出力で実行してください。<ol><li>波長板14(図1A-14)を調整して、ビームスプリッタ2で分割される透過ビームと反射ビームの比率を調整します(図1A-2)。ビームスプリッタ2は、レーザ光のs成分を反射し、p成分を透過する。</li>
		<li>2を通過するビームはミラー7に当たり(図1A-7)、ビームを下部ガルバニックミラーに偏向させます。それはミラー21へのHeNeビームの経路をたどるべきです。この位置決めを達成するために、ミラー7の小さな動きを実行します。</li>
		<li>ミラー2で反射されたビームが57.5mmの高さでミラー10(図1A-10)に当たるようにミラー2を調整します。</li>
		<li>ビームはミラー10から57.5mmの高さでミラー8(図1A-8)に反射されます。後続のビームは同じ高さでミラー9に当たるはずです。そうでない場合は、必要に応じてミラー10と8を微調整します。</li>
		<li>対物レンズを取り外し、対物レンズ砲塔のポートにパワーメーターのヘッドを置きます。</li>
		<li>プレート14、15、および16(図1A-14、15、16)を使用して、図1Cに示すように、各レーザービームの出力が等しくなるように調整します。</li>
		<li>ビームエキスパンダ1(図1A-1)を所定の位置に取り付けます。拡張されたレーザービームを、コマや乱視のない円形になるように調整します。</li>
		<li>光学トラップをテストするには、水に懸濁した1μmのポリスチレンビーズの溶液を作ります。次に、この溶液10 μLを顕微鏡スライドに置き、カバーガラスを上に置き、マニキュアで密封します。スライドを顕微鏡ステージに置き、これらの1μmビーズをトラップして光学トラップをテストします。ステージを移動するときにビーズがトラップに吸い込まれ、安定して保持されていることを確認してください。トラップは、トラップのすべての側面から等しく効率的に行う必要があります。</li>
	</ol></li>
</ol>2. マイクロ流体チャンバーの準備
<ol><li>フローセルがカバーガラス上のポリジメチルシロキサン(PDMS)から作られた市販のデバイスである場合は、手順3に進みます。コネクタが取り付けられたガラスデバイスの場合は、手順4に進みます。</li>
	<li>フローセルにコネクタが取り付けられていない場合は、最初に顕微鏡スライドの入口穴にコネクタを接着します。コネクタを接続する手順については、手順 3 を参照してください。</li>
</ol>3. PDMSフローセルを使用したフローセル接続
メモ: セットアップについては、 図 2D を参照してください。
<ol><li>フローセルをきれいな平らな面に置きます。PTFEチューブを自由端から3mm離して鉗子で保持します。チューブを事前に形成されたポートに押し込みます(ポートは2バールライン圧力をサポートできます)。</li>
	<li>残りの各ポートについて、この手順を繰り返します。入口ポートをシリンジポンプに接続し、出口を廃棄物ボトルに接続します(図4A、B)。</li>
	<li>各ガラスシリンジに1 mLの分光光度グレードのメタノールを充填します。各シリンジをスイッチングバルブに取り付けます。バルブに廃棄物に向けられた出口があることを確認し、各ラインに50 μLのメタノールをパージします(図4C、閉位置)。</li>
	<li>出口位置をフローセルに切り替えます(図4C、開位置)。800 μLのメタノールを100 μL/hの流量でフローセルに通し、表面を濡らして気泡を除去します。</li>
	<li>翌日、800μLの超純水を用いてこのプロセスを繰り返します。これで、フローセルを使用する準備が整いました。</li>
</ol>4. 圧入チューブコネクタの取り付け
メモ: セットアップについては、 図 2F を参照してください。
<ol><li>圧入チューブコネクタを使用する場合は、コネクタの片側から粘着テープを慎重にはがし、顕微鏡スライドの穴の上に置きます。数秒間押し下げます。残りのコネクタについてもこのプロセスを繰り返します。</li>
	<li>フローセルをきれいな平らな面に置きます。PTFEチューブを自由端から3mm離して鉗子で保持します。チューブをポートの事前に形成された穴に押し込み、残りのポートごとにこの手順を繰り返します。</li>
	<li>入口からスイッチングバルブにチューブを取り付けます。手順 7 に進みます。</li>
</ol>5.常設総会の添付
メモ: セットアップについては、図 2A-C を参照してください。
<ol><li>清潔で平らな面または特注のマニホールドで取り付けを行い、接着中にフローセルとコネクタを所定の位置に保持します。</li>
	<li>フローセルを清潔な平らな面またはマニホールドのくぼんだ部分に置きます(図2B)。アセンブリの底に少量のガラス接着剤を置き、シールを挿入します。</li>
	<li>ナノポートを顕微鏡スライドの入口穴の1つに配置します。ゆっくりと押し下げ、横方向に動かさずに所定の位置に保持します。残りのポートについてもこのプロセスを繰り返します。</li>
	<li>マニホールド内の所定の位置に乾燥またはクランプします。フローセルをマニホールドからそっと取り外し、アセンブリがフローセルの入力ポートとうまく位置合わせされていることを確認します。準備ができたら、手順 7 に進みます。</li>
</ol>6. フローセルの接続と準備
メモ: セットアップについては、 図 4A、B を参照してください。
<ol><li>顕微鏡ステージにフローセルを置きます。フィンガータイトコネクタを使用してチューブを取り付けます。</li>
	<li>各ガラスシリンジに1 mLの分光光度グレードのメタノールを充填します。各シリンジをスイッチングバルブに取り付けます。バルブに廃棄物に向けられた出口があることを確認し、各ラインに50 μLのメタノールをパージします(図4C、閉位置)。</li>
	<li>出口位置をフローセルに切り替えます(図4C、開位置)。800 μLのメタノールを100 μL/hの流量でフローセルに通し、表面を濡らして気泡を除去します。</li>
	<li>翌日、800μLの超純水を用いてこのプロセスを繰り返します。これで、フローセルを使用する準備が整いました。</li>
</ol>7.流体の流れの制御
<ol><li>スイッチングバルブを閉位置に回します(図4C)。シリンジを取り外し、残留水を廃棄し、シリンジに実験溶液、例えばDNAビーズを充填する。酵素;とATP。シリンジをポンプに戻し、スイッチングバルブに接続します。</li>
	<li>この位置で、プランジャーを手動で5〜10μL押し下げて気泡を取り除きます。スイッチングバルブの位置を オープンに変更します。</li>
	<li>流量スキームを使用して、 表1に概説されているトラップと視覚化に最適な流体流速を実現します。光トラップに最適な流体の流れは、ビーズの安定したトラップを可能にし、DNAが伸張されると、B型(~3,000 bp/μm)になるはずです。</li>
</ol>8. 単一DNA分子を結合させたポリスチレンビーズのトラップ
<ol><li>10倍の倍率で、チャネルエントリポイントに近い流体ストリーム間の境界を見つけます。100倍の対物レンズにオイルを加え、高倍率に切り替えます。</li>
	<li>光トラップのシャッターを開きます(両方または一度に1つ)。集束されたレーザービームはビーズをトラップし、DNAはすぐに伸びるはずです。</li>
	<li>複合体がトラップされたら、ステージを流れに垂直に移動します(図3A、C、挿入図)。これにより、トラップされた複合体がDNAビーズ溶液からストリーム2に移動します。さらに変換すると、複合体がストリーム3に移動します。</li>
</ol>9.フローセルのクリーニング
注:これを毎日実行してください。
<ol><li>実験が完了したら、ポンプをオフにします。スイッチングバルブを閉位置に回します(図4C)。</li>
	<li>注射器を取り外して空にします。ろ過した蒸留水で3回すすいでください。</li>
	<li>シリンジに洗浄液を入れます。シリンジをポンプに入れ、スイッチングバルブに接続します。</li>
	<li>スイッチングバルブをパージし、位置を変更して開きます。800 μLの洗浄液を100 μL/hの流量で通常一晩ポンプで送ります。</li>
	<li>翌日、スイッチングバルブを閉じてから、シリンジを取り外して水ですすいでください。フローセルとラインを4〜800μLの水で400〜800μLの流量で洗い流します。フローセルのより激しい洗浄が必要な場合は、洗浄液を6 M塩酸グアニジウムと交換してください。</li>
</ol>

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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

フローシステムの慎重な組み立ては、実験4,6の成功結果にとって重要です。プロトコルの最も困難な側面の1つは、ガラス表面へのコネクタの取り付けです。このために、圧入チューブコネクタとナノポートアセンブリの2つのアプローチを使用します。圧入コネクタはガラスに容易に接着し、鉗子を使用してPTFEチューブを事前に形成された穴に押し込みます。より安定した取り付けが必要な場合は、ナノポートアセンブリの接合が好ましい。慎重な使用と洗浄により、恒久的なアセンブリを備えた単一のガラスフローセルを1年以上使用できます。フローセルをより頻繁に切り替える必要がある場合は、PDMSフローセルが優れた安価な代替品であるため、使用できます。それらは再利用できますが、PDMSは膨潤しやすく、時間の経過とともに流体の流れの挙動が変化する可能性があります。
ガラスとPDMSの両方のフローセルは破壊できないわけではありません。実験室では、使用される最大流量は800μL/hです。これを毎日および/または長...

タンパク質とDNAの相互作用を1分子レベルかつリアルタイムで可視化できることは、ゲノムの安定性に関する重要な洞察を提供しました1,2。DNAの単一分子を一度に1つずつ扱うことに加えて、近くの個々の分子間のトランザクションを表示する機能は、追加の洞察を提供します3,4,5。追加のDNA分子の操作には、追加の光学トラップと、高品質のマルチチャネルマイクロ流体フローセルの両方が必要です6。
複数の光トラップを生成するには、いくつかの方法があります。これらには、検流計走査ミラー、音響光学変調器、および回折光学系が含まれ、ホログラフィック光ピンセット4、7、8、9を生成します。多くの場合、走査ミラーと音響光学変調器は、タイムシェアするトラップを生成します。ここで説明するセットアップでは、単一のNd:YAGレーザーのビームが偏光で分割され、ガルバノメーターレーザースキャニングミラーがモバイルトラップと呼ばれる位置を制御します(図1)4。トラップビームを顕微鏡対物レンズの背面開口部に向けるためのミラーとフィルターの位置決めを容易にするために、HeNeレーザーが使用されます。これにより、HeNeビームは肉眼で見えるのに対し、赤外線ビームは見えないため、全体的な位置合わせが容易になります。HeNeビームは、ミラーやその他のコンポーネントの位置決めのストレスを軽減するためにもより安全です。最初は、このレーザーのビームパスは1064 nmビームから分離されていますが、同じビームパスに導入され、次に顕微鏡対物レンズに導入されます。物理的な位置合わせが達成されると、HeNeビームの上に1064nmビームを配置し、赤外線ビューアとさまざまなビームイメージングツールを使用してビームの位置と品質を視覚化することで、これが容易になります。次に、ビームエキスパンダーが導入され、結果として生じる拡張された赤外線ビームが対物レンズの背面開口部に位置合わせされます。最後に、対物レンズを取り除き、各偏光ビームのパワーを測定し、λ/2波長板を使用して等しくなるように調整します(図1C)。電力測定は、目標が返されると実行され、通常、53%の電力損失が発生します。ただし、焦点面に安定した固定および移動する光学トラップを形成するのに十分な電力があります(図1D)。
DNAトランザクションを画像化するために、マイクロ流体フローセルは、高い空間分解能と時間分解能で単一分子レベルでの制御された測定を可能にするため、重要な役割を果たします(図2)。マイクロ流体という用語は、5〜500μm10,11の範囲の寸法を有する1つ以上のチャネル内の流体を操作する能力を指す。ストリームという用語は、チャネル内の実際の流体を指し、チャネルは、流体ストリームが移動する物理チャネルを指します。シングルチャンネルフローセル設計には、反応が観察される共通の物理チャネルがあり、通常は流体の流れが1つだけ存在します。したがって、これらの設計はシングルストリームフローセルとして知られています。対照的に、マルチストリームフローセルは、2つ以上の入口チャネルが単一の共通の物理チャネルに収束するマイクロ流体デバイスとして定義されます(図2A)。共通チャネル内では、個々のチャネルから発生する流体の流れは互いに平行に流れ、拡散によって発生するそれらの間の混合を最小限に抑えて分離されたままになります(図2B)。ほとんどの実験セットアップでは、1つのポンプが同じ速度で流体を各チャネルに押し込みます。対照的に、バウンダリーステアリングを使用する場合、3つ以上の独立して制御されたポンプが流体をチャネルに押し込みます。ただし、各ポンプは異なる速度で動作しますが、共通チャネルの正味流量は一定12です。これにより、ポンプ速度を変更するだけで、メインチャネルコンポーネントの迅速な交換が可能になります。
層流に加えて、別の重要な要素は、層流内の放物線速度プロファイルです。最も高い流速は流れの中央で発生し、最も遅い流速はサーフェスの隣で発生します(図2C)13。このプロファイルは、蛍光DNAの正確な可視化と正確な単一分子分析のために、ストリームに保持されたビーズに付着したDNA分子を完全に引き伸ばすために考慮する必要があります。ここでは、DNAはB型に伸張され、0pNの力で所定の位置に保持されます。これを実現するには、光学トラップ位置の焦点を底部カバースリップ面から10〜20μmの位置に配置する必要があります(図2D)。DNA分子がB型を超えて引き伸ばされないように注意する必要があります これは酵素反応を阻害する可能性があるためです。一般的なバッファー条件下では、1 μm = 3,000 bp の DNA14 です。さらに、カバーガラスから10〜20μmをトラップすることにより、DNA複合体は表面から遠くに配置され、それによって表面相互作用が最小限に抑えられます。
マイクロ流体デバイスチャネルを作成するために多くの方法が使用されており、これらは実験室で行うことができ、またはフローセルは市販の供給源から購入することができる6、15、16、17。フローセルの構築に使用される最適な材料は、機械的に剛性があり、光学的に透明で蛍光が低く、有機溶媒を通さないものでなければなりません6。多くの場合、ホウケイ酸フロートガラスまたは溶融シリカは、光学トラップ、視覚化、および力検出に適した安定した流動環境を長時間提供するために使用されます。これらの材料はまた、表面の濡れと気泡の除去を簡素化するための非水溶媒(例えば、分光光度グレードのメタノール)、およびフローセルを洗浄するための変性剤(例えば、6M塩酸グアニジニウム)または洗剤の使用を可能にする。最後に、フローセルに流体を導入するために使用される方法は、複雑な真空ポンプシステムからシングルシリンジポンプ14、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27までさまざまです。ここで説明するアプローチでは、最大10本のシリンジを収容できるシリンジポンプが使用されます(図3A)。これにより、単一チャネルのフローセルまたは複数の入口チャネルを持つフローセルを柔軟に使用できます。ここでは、3チャンネルフローセルを使用し、ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)チューブを使用してシリンジポンプの所定の位置に保持されたシリンジに嵌合します(図3A-C)。流体の流れは4方向切換弁によって制御されるため、フローセルへの気泡の導入を最小限に抑えるのに役立ちます(図3A、D)。さらに、硬いガラス壁とポリテトラフルオロエチレン(PTFE)コーティングされたプランジャーを備えたハミルトンの気密シリンジは、スムーズな流れを得るために不可欠な非常に滑らかなプランジャーの動きを提供するため、推奨されます14,27。
記載された実験系では、2〜5個の入口チャネルを有するフローセルが使用されてきた。入口チャネルの数は、実行されている実験によって決まります。RecBCDとHop2-Mnd1の研究では、2つのストリームチャネルで十分でした14,28。ヘリカーゼの場合、酵素はDNAの自由末端に結合し、マグネシウムとATPを含むストリームに翻訳されて、転座と巻き戻しを開始しました。Hop2-Mnd1の場合、光学的にトラップされたDNAは、タンパク質および緩衝液±二価金属イオンを含む隣接する流体流に翻訳されました。3チャンネルフローセルを使用すると、ストリーム1にDNAをトラップし、DNAをストリーム2に翻訳してタンパク質結合を起こし、次にATPが存在するストリーム3に移動して、たとえば反応を開始することができます。上記のバリエーションは、チャネル2で蛍光タグ付きタンパク質を使用することであり、その結果、流体の流れは完全に白色になり、DNAの視覚化が妨げられます。この分子がストリーム3に翻訳されると、反応が開始されたときにタンパク質とDNAの両方が見えるようになります。
流体の流れを制御するための4方向スイッチングバルブの使用は、フローセル内の気泡を除去するためのシステムの重要なコンポーネントです。気泡は予測できない方法で収縮および膨張し、流速の急激な変化と乱流の導入をもたらすため、安定した流体の流れに悪影響を及ぼします。シリンジとインレットチューブの間にバルブを配置すると、シリンジ交換時にバルブ位置を切り替えることで流路が切断されます。新しいシリンジが設置されたら、プランジャーを手動で押し下げて、>6μL(バルブのデッドボリューム)を排出し、気泡をほぼ完全に除去することができます。
フローセルへのコネクタの取り付けは、フローセルの使用における律速ステップであることがよくあります。圧入と呼ばれる取り外し可能なコネクタと恒久的なもの(ナノポートアセンブリ)の2種類のコネクタの使用について説明します。取り外し可能なコネクタはフローセルに簡単に接着でき、推奨されるPTFEに加えて、さまざまなタイプのフレキシブルチューブをこれらのコネクタでテストできます。これは、より高価なガラスフローセルを犠牲にすることなく、チューブとコネクタをテストするための迅速かつ費用効果の高い方法です。対照的に、ナノポートアセンブリは恒久的に取り付けられ、最大1,000psiの圧力に耐え、私たちの手では、それらの使用は異なる直径のPEEKチューブに制限されています。これは、PEEKチューブが好ましく使用されるため、不利ではありません。恒久的なアセンブリが取り付けられた単一のガラスフローセルは、慎重に使用することで1年以上再利用できます。

<table><tbody><tr><td>100倍対物</td>レンズ <td>Leica</td><td>506318 または 506038</td><td>Oil Immersion Lens;イメージングとオプティカルトラッピングのみ。蛍光イメージングに最適化されたAPO対物レンズ</td></tr><tr><td>10倍対物レンズ</td><td>ライカ</td><td>506263</td><td>アライメント中にレーザービームスポットの位置を特定するために使用; フローセル内の焦点とX-Y位置を見つけるために使用</td></tr><tr><td>1mm蛍光ビーズ</td><td>Bangs Labs</td><td>FSDG004</td><td>タップ性能、焦点位置決定に使用</td></tr><tr><td>1mmポリスチレンビーズ</td><td>Bangs</td><td>Labs CPO1004</td><td>トラップ性能評価に使用され、ビオチン化分子への結合</td></tr><tr><td>63倍対物</td><td>レンズ ライカ</td><td>506081</td><td>アライメント中にレーザービームスポットの位置を特定し、フローセル内の焦点とX-y位置を見つけるために使用されます。100Xと同じ背部開口部径を持つため、光トラップに使用できます。油浸レンズ</td></tr><tr><td>アライメント</td><td>レーザーLumentum</td><td>1100シリーズ</td><td>肉眼で見える10mW HeNeレーザー 光学系の位置決めに使用</td></tr><tr><td>ビームアライメントカメラ</td><td>Amscope</td><td>MU303</td><td>ビーム位置のイメージングのためのシンプルで安価なソフトウェア制御カメラ</td></tr><tr><td>カメラ制御と画像キャプチャソフトウェア</td><td>浜松</td><td>HCImage</td><td>ラムダDG4の活動をカメラと調整し、迅速な波長切り替えを容易にする</td></tr>カメラ<tr><td>;オルカフラッシュ4</td><td>浜松電機</td><td>c13440-20cu</td><td>CCDカメラ 単一分子実験のイメージング用</td></tr><tr><td>ビームアライメントカメラ用Cマウント</td><td>スポットイメージングソリューション</td><td>DE50CMT</td><td>アライメント中のレーザービームイメージングのためのカメラの最適な位置決めを提供します</td></tr> オル<tr><td>カフラッシュ4カメラ</td><td></td><td></td><td>用CマウントIRブロッキングフィルターを所定の位置に保持するためのリテーナーリングがあります。これにより、光トラップからの反射IRビームが排除され、トラップされた物体のより鮮明なイメージングが容易になります。</td></tr><tr><td>Cy5&nbsp; 蛍光フィルターキューブ</td><td>Semrock</td><td>cy5-404a-lsc-zero</td><td>Lambda DG4と組み合わせて使用 Cy5のみ</td></tr><tr><td>Fitc-Txred&nbsp; 蛍光フィルターキューブ</td><td>Semrock</td><td>fitc/txred-2x-b-000</td><td>Lambda DG4と組み合わせて使用 FITC and TXRed</td></tr><tr><td>Fluidicsチューブ</td><td>Grace Bio</td><td>46004</td><td>を画像化PEEKの代替品としてのPTFEチューブ。一部のフローセルでうまく機能します。Grace Bio fitチューブコネクタを使用する場合、PDMSフローセルまたはグラスフローセルで使用できます</td></tr><tr><td>GFP蛍光フィルターキューブ</td><td>Semrock</td><td>gfp-3035b-lsc-zero</td><td>Lambda DG4と組み合わせて使用 GFPのみ</td></tr>の<tr><td>イメージング ガラスフローセル</td><td>Translume</td><td>Custom</td><td>イメージング用のクリアフローチャネル(図2E)</td></tr><tr><td>ガラス接着剤</td><td>ロックタイト</td><td>233841</td><td>Nanoportアセンブリをガラスフローセルに確実かつ簡単に接着します</td></tr><tr><td>ガラス/PDMSサンドイッチフローセル</td><td>CIDRA精密サービス</td><td>カスタムデザイン</td><td>お客様の仕様に合わせて作られたフローセル、イメージングチャンネルはクリアです(図2C)</td></tr><tr><td>ハミルトン クリーニングソリューション</td><td>ハミルトン</td><td>18311</td><td>グラスフローセル用の優しく効率的なクリーニングソリューションで、慎重に使用しても泡立ちません</td></tr><tr><td>照明システム</td><td>サッターインスツルメント</td><td>ラムダ DG4</td><td>販売終了 ラムダ721</td></tr>イル<tr><td>ミネーションシステム</td><td>サッター機器</td><td>ラムダ DG4</td><td>販売終了 ラムダ721</td></tr><tr><td>を推奨 画像解析ソフトウェア</td><td>メディアサイバネティクス</td><td>Image Pro Premiere</td> 画像解析と<td>単一分子トラッキング</td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア</td><td>フィジー/NIH 画像/画像J</td><td>シェアウェア</td><td>画像と単一分子トラッキングの解析</td></tr><tr><td>画像ディスプレイカード</td><td>Melles Griot</td><td>06 DLA 001</td><td>Thorlabs からの代替製品: VRC5</td></tr><tr><td>液浸油</td><td>ツァイス</td><td>444960</td><td>イマーソール 518 F 蛍光フリー</td></tr><tr><td>レーザービームアライメントツール</td><td>トールラボ</td><td>FMP05/M; dgo5-1500-h1;BHM1&nbsp;</td><td>梁が水平で正しい高さにあることを確認するために使用されます</td></tr><tr><td>レーザービームビューア</td><td>カナダのフォトニクスラボ</td><td>IR 3150</td><td>ミラー上のIRビームスポットの画像化に使用され、 &nbsp;ターゲット</td></tr><tr><td>レーザーパワーメーター</td><td></td><td></td><td>レーザー出力の測定だけでなく、トラップ強度</td></tr><tr><td>レーザー安全メガネ(HeNe)</td><td>トールラボ</td><td>LG7または8</td>ブロック <td>>波長>600nmの光の3 OD単位</td></tr><tr><td>レーザー安全メガネ(IR)</td><td>トールラボ</td><td>LG11</td><td>波長&sup3の光の>7 OD単位をブロックします。1000 nm</td></tr><tr><td>Mcherry&nbsp; 蛍光フィルターキューブ</td><td>Semrock</td><td>mcherry-a-lsc-zero</td><td>Lambda DG4と組み合わせて使用 mcherry のみの画像化に使用</td></tr><tr><td></td><td>顕微鏡 Leica</td><td>DMIRE2</td><td>DIC ポートを取り外してダイクロイックトラッピング/アライメントミラー</td></tr><tr><td>顕微鏡制御ソフトウェア&nbsp;</td><td>UCSF/shareware</td><td>uManager</td><td>顕微鏡を制御し、対物レンズの焦点アライメントとステージ制御を可能にします</td></tr><tr><td>ナノポートアセンブリ</td><td>IDEX</td><td>N333</td><td>フローセルに接着されたコネクタ</td></tr><tr><td>光学テーブルサポート</td><td>トールラボ</td><td>PA52502</td><td>アクティブアイソレーションテーブルサポート</td></tr><tr><td>光学系とレンズ</td><td>ソーラー TII</td><td>各種</td><td>干渉ミラー、望遠鏡、レンズは、システム</td></tr><tr><td>PDMSフローセル</td><td>ufluidix</td><td>カスタム</td><td>フローセルは、あなたの仕様に応じて構築するために設計されています。イメージングチャネルはクリアです(図2BおよびD)</td></tr><tr><td>PEEKチューブ</td><td>IDEX</td><td>1532</td>は<td>、フローセルとスイッチングバルブピン</td></tr><tr><td>ケル蛍光フィルターキューブ</td><td>Semrock</td><td>lf488/543/635-3x-a-000</td><td>に優れた接続を提供しますLambda DG4と組み合わせて使用し、複数の蛍光色素を迅速に画像化</td></tr><tr><td>圧入チューブコネクタ</td><td>GraceBio</td><td>46003</td><td>ガラスによく結合する接着剤付き透明シリコンコネクタ</td></tr><tr><td>スキャニングミラー</td><td>GSI Lumonics</td><td>VM500</td><td>第2の光トラップの制御に使用されます。GSI Lumonics は存在しなくなりました。ケンブリッジの科学的な段階から同様のミラーを購入することができます</td></tr><tr><td></td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステージマイクロメーター</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>68042-08</td><td>ビームとシステムキャリブレーションの位置決めのためのスクリーン定規を提供します</td></tr><tr><td>スイッチングバルブ</td><td>IDEX</td><td>V-101T</td><td>流体の流れの方向を制御し、フローセルへの気泡の導入を排除し</td></tr>ます <tr><td>シリンジとバルブマニホールド</td><td>機械工場</td><td>なし</td><td>カスタムメイド</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td>PHD 2000</td><td>フローセルを通る流体の流れを制御</td></tr><tr><td>シリンジポンプソフトウェア</td><td>ハーバード Apparatus</td><td>70-6000</td><td>Flow 制御は、流体の流れのシームレスでプログラム可能な制御を提供します</td></tr><tr><td>シリン</td><td>ジ ハミルトン</td><td>81320</td><td>気密性、PTFE ルアーロック、ガラスバレルテフロンコーティングされたプランジャー</td></tr><tr><td>テーブルトップ</td><td>トールラボ</td><td>T36H</td><td>光学式テーブルトップまたはブレッドボード</td></tr><tr><td>トラッピングレーザー</td><td>ニューポート/スペクトラフィジックス</td><td>Jシリーズ;BL106C</td><td>Nd:YAGレーザー 1064 nm; 5Wレーザー</td></tr></tbody></table>

1分子研究のためのデュアル光ピンセットとマイクロ流体工学の使用

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

視覚生化学は、バルク相研究で行われる平均化では不明瞭な単一酵素または酵素複合体の確率的特性を観察するための強力な手法です。視覚化を実現するために、一方のトラップが固定され、もう一方のトラップが可動であるデュアル光学ピンセットが、倒立蛍光顕微鏡のステージ上に配置されたマルチストリームマイクロ流体チャンバーの1つのチャネルに焦点を合わせられます。光ピンセットは、蛍光標識されたDNAの単一分子をトラップし、チャンバー内を流れてトラップされたビーズを通過し、DNAをB型(最小の力、つまり0 pN)に伸ばし、核酸は黒い背景に対して白いひもとして観察されます。DNA分子は、段階を流れに垂直に変換して、制御された方法で反応を開始できるようにすることで、ある流れから次の流れに移動します。成功を達成するために、光学的に透明なチャネルを備えたマイクロ流体デバイスは、シリンジポンプの所定の位置に保持されたガラスシリンジと嵌合されます。最適な結果を得るには、フローセルに恒久的に接着されたコネクタ、機械的に剛性があり耐薬品性があり、層流を妨げる気泡を除去するスイッチングバルブに接続されたチューブを使用します。

トラップの位置合わせと強度の初期テストは、1 μmの非蛍光ポリスチレンビーズで行われます。実験室で行われる研究のほとんどは蛍光を使用しているため、1μmのドラゴングリーンポリスチレンビーズを使用してトラップ強度をさらにテストします(図1D、E)。その後、DNAをビスインターカレート色素YOYO-1で染色するDNAビーズ複合体の光学トラップに変わります14,29。これらの複合体がマイクロ流体フローセルのカバーガラス表面から10〜15 μm上にトラップされると、ビーズを通過する流体の流れがDNAを伸ばします(図3B、C)。流体で引き伸ばされたDNAの長さを測定して、予想される長さであるB体の長さまで引き伸ばされていることを確認することが重要です。例えば、バクテリオファージラムダDNAの場合、全長は16μmよりわずかに長く、これは48,504...

マイクロ流体チャンバーを介して研究される視覚的な単一分子生化学は、ガラスバレル、気密シリンジ、チューブとフローセルへのチューブの安定した接続、およびシリンジとチューブの間に切り替えバルブを配置することによる気泡の除去を使用して大幅に促進されます。このプロトコルは、DNAトランザクションと分子間相互作用の視覚化を可能にするデュアルオプティカルトラップを記述します。

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

チューブ付きのシリンジに嵌合するためのポートの取り付けは、正しく行われれば漏れがなく、フローセル内に気泡がなく、慎重に使用すれば、同じフローセルを使用して1年間にわたって繰り返し実験できるため、非常に重要です。ここでは、コネクタをフローセルに取り付けるための2つの簡単な方法を紹介します。これらは簡単で再現性があり、研究者はそれほど問題なくフローセルをニーズに簡単に適応させることができます。これらのフローセルの使用は、単一分子実験を念頭に置いて行われました。特に、私たちが視覚生化学と呼んでいるものですが、マイクロフルイディクスが必要なあらゆる研究や、薄層流体の流れが使用される状況で使用できます。したがって、間違いを避けるために、貴重なフローセルを使用してテクニックを確立する代わりに、最初にスライドガラスまたはカバースリップで練習することをお勧めします。これにより、ガラスやPDMS材料の感触をつかみ、それらの取り扱い方法や、チューブを挿入したりコネクタを接着したりするときにどれだけの力を加えるかを知ることができます。これにはいくつかのコネクタを犠牲にする必要がありますが、フローセルよりもはるかに安価です。フローセルをきれいな平らな面に置くことから始めます。PTFEチューブを自由端から3ミリメートル離して鉗子で持ち、チューブをポートに押し込みます。残りの各ポートについて、この手順を繰り返します。入口ポートをシリンジポンプに接続し、出口を廃棄物ボトルに接続します。各ガラスシリンジに1ミリリットルの分光測光、等級付けメタノールを充填し、それらをスイッチングバルブに取り付けます。バルブに廃棄物に向けられた出口があることを確認し、各ラインを50マイクロリットルのメタノールでパージします。出口位置をフローセルに切り替え、800マイクロリットルのメタノールをフローセルに毎時100マイクロリットルの流量で送り込み、表面を濡らして気泡を除去します。翌日、800マイクロリットルの超純水を使用してこのプロセスを繰り返します。これで、フローセルを使用する準備が整いました。圧入チューブコネクタを使用する場合は、コネクタの片側から粘着テープを慎重にはがし、顕微鏡スライドの穴の上に置きます。数秒間押し下げます。残りのコネクタについてもこのプロセスを繰り返します。次に、フローセルをきれいな平らな面に置きます。PTFEチューブを自由端から3ミリメートル保持し、チューブをポートの穴に押し込みます。残りの各ポートについて、この手順を繰り返します。入口からスイッチングバルブにチューブを取り付けます。アタッチメントを清潔で平らな面または特注のマニホールドに配置して、ボンディング中にフローセルとコネクタを所定の位置に保持します。フローセルをマニホールドの凹んだ部分に置き、アセンブリの底に少量のガラス接着剤を置き、シールを挿入します。ナノポートを顕微鏡スライドの入口穴の1つに配置します。ゆっくりと押し下げ、横方向に動かさずに所定の位置に保持します。残りのポートについてもこのプロセスを繰り返します。マニホールド内の所定の位置に乾燥またはクランプします。フローセルをマニホールドからそっと取り外し、アセンブリがフローセルの入力ポートとうまく位置合わせされていることを確認します。顕微鏡ステージにフローセルを置き、フィンガータイトコネクタを使用してチューブを取り付けます。各ガラスシリンジに1ミリリットルの分光測光グレードのメタノールを充填します。各シリンジをスイッチングバルブに取り付けます。バルブに廃棄物に向けられた出口があることを確認し、各ラインを50マイクロリットルのメタノールでパージします。出口位置をフローセルに切り替え、800マイクロリットルのメタノールをフローセルに100マイクロリットルの流量で送り込みます。翌日、800マイクロリットルの超純水を使用してこのプロセスを繰り返します。電力出力の測定値をここに示します。レーザーからのパワー出力は、レーザーヘッドを光学レイアウトに取り付ける前に測定されます。トラップアライメントが完了すると、各トラップの対物レンズの100倍の後にビームパワーが測定されます。画像は、1マイクロメートルの蛍光ビーズの安定した光学トラップを示しています。ここで、Fは固定トラップであり、Mはモバイルトラップです。スキャンモードのモバイルトラップが30ヘルツで大小の円を移動します。フローセル内の流体の流れは層流です。回路図は、フローセルを上から示し、チャネル間拡散が隣接する流体ストリーム間の混合の主な原因であることを示しています。青色の矢印はフロー方向を示し、個々の河川は白、ライト グレー、および白で色分けされています。チャネル間の横方向の拡散領域の拡大領域は赤で示されています。挿入図は、下流に蛍光標識DNAビーズ複合体、上流に緩衝液のみを使用した10倍の倍率での隣接する流体流の蛍光画像を示しています。上流の白い斑点はCCDカメラからのショットノイズです。フロープロファイルセルと層流セルは放物線状です。フローセルは側面から見て、フローの方向は各セルの上に示されます。線形ビーズ速度は、ポンプ速度とスクロース濃度の影響を受けます。ビードにかかる反対力は、溶液の粘度の影響を受けます。ビードの直径は、流れ中のビードにかかる力に影響します。この手順を試みるときは、作業している領域がきれいで、分光グレードのメタノールまたはアセトンでガラス表面をきれいにしていることを確認してください。この段階で、シリンジポンプにフローセルができ、ソリューションを導入して光ピンセットの実験を開始する準備が整いました。長期間使用できるフローセルを使用することで、研究者は、力を測定するか、反応を蛍光または両方の組み合わせで視覚化するさまざまな単一分子反応を調査することができました。

use-dual-optical-tweezers-microfluidics-for-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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コンスタント·フォース軸光ピンセットを用いたDNAの短い配列を伸ばす

彼らはkHzのレートで安価にピコリットル、自己区分血管を生成することができるので、液滴ベースのマイクロ流体プラットフォームは、ハイスループットの実験のための有望な候補である。...

マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

この記事では、高度に並列化可能な方法で単一分子レベルでのタンパク質分解酵素に作用する力の影響を研究するために磁気ピンセットの使用方法について説明します。...

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

ここでは、二枚の光学トラップされたマイクロスフェアの間に懸架単一のDNA分子と相互作用する単一の蛍光標識タンパク質分子を検出するための機器および方法が記載されている。...

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