機能研究のためのヒトシナプス受容体を再活性化するためのシナプス膜の微小移植

神経変性および精神的健康障害は、シナプス通信の変化から生じる。多因子事象は、私たちが完全には理解していない方法でシナプス受容体を変化させます。シナプス膜の微小移植は、これらの変化への洞察を提供する。

この技術の主な利点は、ヒトの脳で働く天然の脳受容体の活性を記録する可能性であり、したがって、我々が研究している疾患を表す。シナプス受容体は、脳の電気的活動を調節する医学の主要な標的であるが、これらの受容体がどのように変化するかを理解することで、その機能を回復するより良い治療法を開発することができる。この方法は、昆虫、魚類、哺乳類から異なる種に首尾よく適用されているが、脳の外側の膜受容体、例えば筋肉および腫瘍にも適用することができる。

可能性は広いです。注射針のトリミングは難しいです。小さすぎるとタンパク質注入を防ぐことができ、2つの大きな細胞を殺すことができます。

これは、カミソリの刃のような一貫した測定を使用するのに役立ちます。関心のある人間の脳領域から調製した選択されたサンプルを、浮遊した湿った氷で浴中で3回超音波処理することから始めます。毎回5秒のサイクルを使用し、サイクル間のウェットアイスで1分間待ちます。

1マイクロリットルのサンプルを熱可塑性プラスチックの上に置き、必要に応じてサンプルの配置前に表面にくぼみを作り、サンプルの動きを防ぎます。ナノインジェクターを保持するマニピュレーターのつまみを使用して針を配置し、充填するサンプルに向かって移動させます。針先がサンプルに入ったら、十分なサンプルが取り込まれるまでフィルボタンを押し続けます。

10個の卵母細胞に対して約0.5マイクロリットルのサンプルが必要である。ノブを使用して、ナノインジェクターの針を最も高い位置に戻します。表面のすぐ下の卵母細胞を針で貫通し、深くは浸透させず、フットペダルを使用してサンプルを注入します。

約2〜3秒間待ちます。注入が成功すると、細胞は膨張する。マニピュレーターのつまみを使用してセルを終了します。

次の卵母細胞が針と揃うようにペトリ皿を動かします。ディッシュ内の所望の数の卵母細胞が注入されるまでこのプロセスを繰り返し、ナノインジェクターを元の位置に引っ込めて針を取り外す。卵母細胞の1つのウェルがコントロールとして使用するために注射されていないままであることを確認してください。

イオン電流の記録に使用するすべての機器の電源を入れ、デスクトップコンピュータの電源を入れて、WinEDRバージョン3.9.1にログインします。プログラムが実行中であり、レコードが [ディスク] に設定されていることを確認します。その後、録音時間を設定し、シミュレータオプションをクリアします。

電圧電極部については、負容量補償をオフにします。バス電極セクションのゲインセレクタスイッチを10に設定し、ゲイン乗算器を選択する3つの位置トグルスイッチをx1に設定します。LEDライトはゲイン乗算器の選択を示します。

クランプモードセレクタをオフにし、DCゲイン制御をinに設定し、ゲイン制御を全帯域幅オープンループの約半分に設定します。コマンドを 40 ミリボルト、ホールド コントロールを負、スケール乗数を x2 に設定します。電流電極の場合、卵母細胞に衝突する前に、VEオフセットを使用してゼロ基準を確立します。

次に、WinEDR バージョン 3.9.1 ソフトウェアを開き、トップ メニューに移動して、[ファイル]、[新規] の順に選択します。独自のフォルダを作成し、ファイルを保存します。メインメニューで、[記録]を選択し、[ディスクに記録]を選択します。

記録チャンバの後ろのそれぞれの円形の穴に寒天ブリッジを配置し、記録チャンバ内のグランド基準として使用される電極用のウェルを接続する。1x Ringerの作業ソリューションを対応する灌流バルブに追加します。記録チャンバがリンゲルの溶液で満たされるまでバルブを開きます。

電極を保持する左右のマニピュレータを使用して、電極針をリンゲル溶液で満たされた記録チャンバに導きます。VMとVEオフセットノブをゼロにし、電極テストボタンを押して、各電極の抵抗を確認します。抵抗は0.5〜3メガオームでなければなりません。

抵抗が範囲外の場合は、新しいマイクロ電極を使用して交換してください。次に、録音室を新鮮なリンガーの溶液で満たします。ガラスピペットを使用して、非注射または微小移植卵母細胞を記録チャンバの中央に配置します。

卵母細胞が動物側を上にして顕微鏡下ではっきりと見えることを確認してください。電極が卵母細胞膜に触れるまで、電極をリンゲル溶液に導きます。動物側の卵母細胞膜を両方の電極で優しく突き刺し、静止膜電位を記録する。

着信音のソリューション フローをオンにします。Oocyteクランプアンプを使用して、モードを電圧クランプスローに変更し、保持電圧を80ミリボルトに設定します。モニタの電流は負で、通常は0~0.4マイクロアンペアです。

[ファイル]、[新規作成] の順に選択し、ソフトウェアに録画を保存して新しいファイルを作成し、録画を保存します。「録音」を押してから「ディスクに録音」を押して、録音を開始します。[マーク チャート] ダイアログを使用して、関連情報をファイルに追加します。

バルブを開き、それらを記録チャンバに15秒間灌流することによって、化学的刺激のためのアゴニストを適用する。録音が完了したら、電圧クランプをオフの位置に回し、リンガーのソリューションバルブをオフにします。卵母細胞を除去し、ヒト脳サンプルの制度的方針に従って破棄し、記録を停止してファイルを保存します。

録画のコピーをUSBドライブに保存します。そこから、分析するファイルを開きます。AMPA最大応答、およびGABA Aピーク応答を測定するには、まず、赤い線を見つけることによって0レベルまたはベースラインを確立し、次にそれをRingerアプリケーションまたはベースラインによって生成された電流にドラッグします。

0レベルが確立されたら、緑色の垂直読み出しカーソルをグラフトレーサの目的の部分にドラッグして、応答測定値を決定します。ヒトシナプス受容体からの膜を注入した卵母細胞からのイオン電流が記録された。AMPA受容体は100マイクロモルのカイネートで活性化され、そして1ミリモルのGABAでGABAA受容体を活性化した。

魚雷の電気器官からの濾過された膜の共注入は、アセチルコリン受容体に富み、そしてGABA行1受容体をコードするcDNAを動物極に、それらの応答に基づいて主に2群の卵母細胞を産生した。卵母細胞の1つの群はアセチルコリンに対して大きな応答を有したが、1つのマイクロモルGABAに対する応答はなかった。別の群の卵母細胞は、アセチルコリンに対する応答がゼロまたは低であったが、GABAに対する応答は大きかった。

グラフ画像は、グループ1とグループ2のピーク電流の平均に標準誤差を加えた値を示しています。グループ2の1つの卵母細胞は、大きなGABAおよびアセチルコリン応答を有し、核の破裂を示唆した。その結果、応答の分布は、膜電流の分布の平均と中央値の差によって示されるように、低い値に歪んでいました。

低応答卵母細胞の原因の1つは、膜が注入され、卵母細胞の核に閉じ込められていることです。非AD脳、およびAD脳から得られた濾過されていない膜を有する動物または植物極に注入された卵母細胞のGABAおよびカイニン酸応答がここに示されている。核を標的とせずに動物の極の近くに注射された卵母細胞は、植物極に注入された卵母細胞よりも大きな応答を示し、したがって、受容体の数が非常に少ない組織サンプルの研究を可能にした。

この手順を実行するときは、常に Ringer レベルを監視してください。重要な録音中には常に不足し、その結果、卵母細胞の死、非常に貴重なデータの損失が使用されます。この手順に続いて、シナプス受容体または目的のタンパク質の存在を検証するために西洋負荷を実行することができます。

これは、異なる脳領域における阻害シナプス比、および異なる脳障害に対するグローバルな興奮を測定することを可能にし、疾患の原因に関する理論的予測に関する直接テストを行うことを可能にする。