Name: 機能研究のためのヒトシナプス受容体を再活性化するためのシナプス膜の微小移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 学ぶシナプス膜の微小移植法でXenopus laevis卵母細胞を用いてヒトのAMPAおよびGABA受容体の応答を記録する技術。この方法は神経変性疾患や精神疾患におけるシナプス受容体の機能変化を解明し、治療法開発に貢献する。

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この研究は、NIA/NIHのALへのR01AG070255およびR01AG073133の助成金によって支援された。我々はまた、この原稿に示されたヒト組織を提供してくれたカリフォルニア大学アーバイン・アルツハイマー病研究センター(UCI-ADRC)にも感謝する。UCI-ADRCは、NIH/NIA助成金P30 AG066519によって資金提供されています。

著者らは、開示する利益相反はありません。

ヒトの脳からの天然タンパク質複合体の分析は、脳障害における恒常性および病理学的プロセスを理解し、疾患を予防または治療するための治療戦略を開発するために必要である。したがって、スナップ凍結サンプルを含む脳バンクは、大規模でほとんど未開発の豊富な生理学的情報の非常に貴重な情報源である29,30。死後組織を使用するための最初の懸念は、データの解釈を混乱させる可能性のあるmRNAまたはタンパク質分解の明確な可能性である。例えば、脳のpHは、定量的リアルタイムPCRによるmRNAの定量と一貫して正の相関を示しており、この相関は病態31とは無関係である。被験者間のpHの違いは、結果の解釈を曖昧にする可能性のある大きな分散を伴うmRNA定量の違いをもたらし得る32。興味深いことに、pHが酸性になるにつれてmRNA転写産物の定量性が低くなるにもかかわらず、異なる転写産物間の共分散は維持され33、...

神経変性障害は、人口の大部分に影響を及ぼす。それらの壊滅的な結果はよく知られていますが、脳機能にとって重要な神経伝達物質受容体の機能的変化とそれらの症状との間の関連性はまだほとんど理解されていません。個人間の変動性、疾患の慢性的な性質、および症状の狡猾な発症は、化学的不均衡が十分に文書化されている多くの脳障害の理解を遅らせた理由のほんの一部です1,2。動物モデルは、非常に貴重な情報を生み出し、進化保存系における生理学と病態生理学の根底にあるメカニズムに関する知識を広げました。しかし、げっ歯類とヒトとの間のいくつかの種間差異は、動物モデルからヒト脳への受容体機能の直接的な外挿を妨げている3。したがって、天然のヒト受容体を研究するための最初の努力は、外科的に除去された組織および凍結サンプルを使用して、Ricardo Milediの研究室によって開発された。これらの初期の実験では、ニューロンシナプス受容体および余分なシナプス受容体ならびに非ニューロン神経伝達物質受容体を含む全膜を使用し、それらは罹患状態に関する重要な情報を提供するが、受容体の混合がデータの解釈を複雑にする懸念がある4、5、6、7。重要なことに、シナプスは多くの神経変性疾患における主要な標的である8,9;したがって、罹患したシナプスの機能特性を試験するためのアッセイは、シナプス通信に影響を及ぼす疾患関連の変化に関する情報を得るための基本である。ここで、元の方法の改変が記載されている:濃縮シナプスタンパク質調製物の生理学的特徴付けに焦点を当て、研究ラットおよびヒトシナプトソームに首尾よく適用されたシナプス膜(MSM)の微小移植10,11,12,13,14,15.この方法論により、かつてヒトの脳内で働いていたシナプス受容体を移植し、独自の天然脂質に埋め込み、関連するタンパク質の独自のコホートを移植することが可能である。さらに、MSMデータは定量的であるため、このデータを使用して、大規模なプロテオームまたはシーケンシングデータセット10と統合することができる。
シナプス受容体の多くの薬理学的および生物物理学的分析が組換えタンパク質に対して行われていることに注意することが重要です16,17。このアプローチは、受容体の構造と機能の関係についてのより良い洞察を提供するが、ニューロンに見られる複雑な多量体受容体複合体およびそれらの疾患の変化に関する情報を提供することはできない。したがって、天然タンパク質と組換えタンパク質の組み合わせは、シナプス受容体のより包括的な分析を提供するはずである。
シナプトソーム10,11,12,13,14,15を調製する方法は数多くあり、ラボの要件に合わせて調整することができます。このプロトコルは、シナプトソーム富化調製物が単離され、微小移植実験のために処理される準備ができているという仮定から始まる。ラボでは、製造元の指示に従って Syn-Per メソッドが使用されます。これは、電気生理学的実験10、11において再現性が高いためである。アフリカツメガエル卵母細胞18、19を単離する方法を説明する豊富な文献もあり、注射20の準備ができて購入することもできる。

<table><tbody><tr><td>マイクロインジェクション用</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5インチガラスキャピラリー</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル、平底 組織培養プレート</td><td>サーモフィッシャー</td><td>FB012929</td><td></td></tr><tr><td>フレーミング/ブラウンタイプ マイクロピペットプーラー</td><td>サッター</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>インジェクションディッシュ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機の管</td><td>サーモフィッシャー</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>鉱油</td><td>サーモフィッシャー</td><td>O121-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>ドラモンド</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>ナイロン メッシュ</td><td>工業用ネット</td><td>WN0800</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>ステレオスコープ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>03-000-037</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14-841-31</td><td></td></tr><tr><td>超音波洗浄バス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>FS20D</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus laevis frogs</td><td>Xenopus 1</td><td>4217<</td><td></td></tr><tr><td>strong>For Two Electrode Voltage clamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 cm long fire polished ホウケイ酸ガラス キャピ</td><td>ラリー サッター</td><td>B200-116-15</td><td></td></tr><tr><td>任意のPCコンピュータまたはラップトップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ローパスベッセルフィルター</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>LPF-8</td><td></td></tr><tr><td>ステレオスコープ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>03-000-037</td><td></td></tr><tr><td>2電極電圧クランプワークステーション</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>TEV-700</td><td></td></tr><tr><td>ValveLink 8.2 灌流コントローラー</td><td>科学</td><td>SKUを自動化する:01-18</td><td></td></tr><tr><td>WInEDR フリーソフトウェア</td><td>ストラスクライド大学 グラスゴー</td><td>https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td></tr><tr><td>Xシリーズ マルチファンクション DAQ</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>NI USB-6341</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二塩化カルシウム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>カルシウム硝酸塩四水和物</td><td>サーモフィッシャー</td><td>C109</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)</td> <td>サーモフィッシャー</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>カイニン酸</td><td>Tocris</td><td>0222</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーM63</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カリウム</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーP217</td><td></td></tr>重<tr><td>炭酸ナトリウム</td>サー<td>モフィッシャーS233</td><td></td><td></td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td><td>サーモフィッシャーS271-1</td><td></td><td></td></tr>ウルトラ<tr><td>フリー-0.1&マイクロ;m MCフィルター、</td><td>アミコン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

機能研究のためのヒトシナプス受容体を再活性化するためのシナプス膜の微小移植

Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

興奮性および抑制性のイオントロピック受容体は、生理学的ニューロン通信中のシナプスの活性を決定するイオンフラックスの主要なゲートである。したがって、それらの存在量、機能、および他のシナプス要素との関係の変化は、神経変性疾患および精神障害における脳機能および認知障害の変化の主要な相関として観察されている。興奮性および抑制性シナプス受容体の機能が疾患によってどのように変化するかを理解することは、効果的な治療法の開発にとって極めて重要である。疾患関連情報を得るためには、罹患したヒトの脳内で機能し続ける神経伝達物質受容体の電気的活動を記録することが重要である。これまでのところ、これは受容体の機能における病理学的変化を評価するための最も近いアプローチである。本研究では、ヒト受容体を含むスナップ凍結ヒト脳組織からシナプス膜を再活性化するシナプス膜を、アフリカツ メガ エルの卵母細胞の膜への注入と後部融合により微細移植する方法論を提示する。このプロトコルはまた、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸(AMPA)およびγ-アミノ酪酸(GABA)受容体の一貫した信頼性の高い応答を得るための方法論的戦略、ならびに正規化および厳密なデータ分析に使用される新規な詳細な方法を提供する。

注射後数時間以内に、神経伝達物質受容体およびイオンチャネルを運ぶシナプス膜は、卵母細胞原形質膜と融合し始める。図1は、アフリカツメガエル卵母細胞に微小移植されたAMPAおよびGABAA受容体の記録を示す。ほとんどの分析において、異なるカエル由来の卵母細胞の2つまたは3つのバッチを使用して、サンプルあたり合計6〜9個の卵母細胞について、サンプルあたり2つまたは3つの卵母細胞からの応答を測定した。これは、ヒト被験者の大規模なコホートがグループの違いを観察するために行われます。分析は簡単で、応答の振幅を測定します。移植された膜の融合は分極プロセスであり、したがって注射部位の選択が非常に重要であることに注意することは重要である。植物半球または赤道への注入は、一貫した結果をもたらし、注入されたすべての卵母細胞は受容体を首尾よく挿入し、単峰性分布22に従うイオン電流を生成する。興味深いことに、膜が最初に動物極に注入されたとき、卵母細胞応答は二峰性分布に従った:卵母細胞の1つのグループは応答が全くまたは非...

このプロトコルは、アフリカ ツメガエル・ラエビス 卵母細胞へのシナプス膜の微小移植を行うことによって、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸およびγ-アミノ酪酸受容体の一貫した信頼性の高い応答を記録することが可能であることを実証する。

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...

神経変性および精神的健康障害は、シナプス通信の変化から生じる。多因子事象は、私たちが完全には理解していない方法でシナプス受容体を変化させます。シナプス膜の微小移植は、これらの変化への洞察を提供する。この技術の主な利点は、ヒトの脳で働く天然の脳受容体の活性を記録する可能性であり、したがって、我々が研究している疾患を表す。シナプス受容体は、脳の電気的活動を調節する医学の主要な標的であるが、これらの受容体がどのように変化するかを理解することで、その機能を回復するより良い治療法を開発することができる。この方法は、昆虫、魚類、哺乳類から異なる種に首尾よく適用されているが、脳の外側の膜受容体、例えば筋肉および腫瘍にも適用することができる。可能性は広いです。注射針のトリミングは難しいです。小さすぎるとタンパク質注入を防ぐことができ、2つの大きな細胞を殺すことができます。これは、カミソリの刃のような一貫した測定を使用するのに役立ちます。関心のある人間の脳領域から調製した選択されたサンプルを、浮遊した湿った氷で浴中で3回超音波処理することから始めます。毎回5秒のサイクルを使用し、サイクル間のウェットアイスで1分間待ちます。1マイクロリットルのサンプルを熱可塑性プラスチックの上に置き、必要に応じてサンプルの配置前に表面にくぼみを作り、サンプルの動きを防ぎます。ナノインジェクターを保持するマニピュレーターのつまみを使用して針を配置し、充填するサンプルに向かって移動させます。針先がサンプルに入ったら、十分なサンプルが取り込まれるまでフィルボタンを押し続けます。10個の卵母細胞に対して約0.5マイクロリットルのサンプルが必要である。ノブを使用して、ナノインジェクターの針を最も高い位置に戻します。表面のすぐ下の卵母細胞を針で貫通し、深くは浸透させず、フットペダルを使用してサンプルを注入します。約2〜3秒間待ちます。注入が成功すると、細胞は膨張する。マニピュレーターのつまみを使用してセルを終了します。次の卵母細胞が針と揃うようにペトリ皿を動かします。ディッシュ内の所望の数の卵母細胞が注入されるまでこのプロセスを繰り返し、ナノインジェクターを元の位置に引っ込めて針を取り外す。卵母細胞の1つのウェルがコントロールとして使用するために注射されていないままであることを確認してください。イオン電流の記録に使用するすべての機器の電源を入れ、デスクトップコンピュータの電源を入れて、WinEDRバージョン3.9.1にログインします。プログラムが実行中であり、レコードが [ディスク] に設定されていることを確認します。その後、録音時間を設定し、シミュレータオプションをクリアします。電圧電極部については、負容量補償をオフにします。バス電極セクションのゲインセレクタスイッチを10に設定し、ゲイン乗算器を選択する3つの位置トグルスイッチをx1に設定します。LEDライトはゲイン乗算器の選択を示します。クランプモードセレクタをオフにし、DCゲイン制御をinに設定し、ゲイン制御を全帯域幅オープンループの約半分に設定します。コマンドを 40 ミリボルト、ホールド コントロールを負、スケール乗数を x2 に設定します。電流電極の場合、卵母細胞に衝突する前に、VEオフセットを使用してゼロ基準を確立します。次に、WinEDR バージョン 3.9.1 ソフトウェアを開き、トップ メニューに移動して、[ファイル]、[新規] の順に選択します。独自のフォルダを作成し、ファイルを保存します。メインメニューで、[記録]を選択し、[ディスクに記録]を選択します。記録チャンバの後ろのそれぞれの円形の穴に寒天ブリッジを配置し、記録チャンバ内のグランド基準として使用される電極用のウェルを接続する。1x Ringerの作業ソリューションを対応する灌流バルブに追加します。記録チャンバがリンゲルの溶液で満たされるまでバルブを開きます。電極を保持する左右のマニピュレータを使用して、電極針をリンゲル溶液で満たされた記録チャンバに導きます。VMとVEオフセットノブをゼロにし、電極テストボタンを押して、各電極の抵抗を確認します。抵抗は0.5〜3メガオームでなければなりません。抵抗が範囲外の場合は、新しいマイクロ電極を使用して交換してください。次に、録音室を新鮮なリンガーの溶液で満たします。ガラスピペットを使用して、非注射または微小移植卵母細胞を記録チャンバの中央に配置します。卵母細胞が動物側を上にして顕微鏡下ではっきりと見えることを確認してください。電極が卵母細胞膜に触れるまで、電極をリンゲル溶液に導きます。動物側の卵母細胞膜を両方の電極で優しく突き刺し、静止膜電位を記録する。着信音のソリューション フローをオンにします。Oocyteクランプアンプを使用して、モードを電圧クランプスローに変更し、保持電圧を80ミリボルトに設定します。モニタの電流は負で、通常は0~0.4マイクロアンペアです。[ファイル]、[新規作成] の順に選択し、ソフトウェアに録画を保存して新しいファイルを作成し、録画を保存します。「録音」を押してから「ディスクに録音」を押して、録音を開始します。[マーク チャート] ダイアログを使用して、関連情報をファイルに追加します。バルブを開き、それらを記録チャンバに15秒間灌流することによって、化学的刺激のためのアゴニストを適用する。録音が完了したら、電圧クランプをオフの位置に回し、リンガーのソリューションバルブをオフにします。卵母細胞を除去し、ヒト脳サンプルの制度的方針に従って破棄し、記録を停止してファイルを保存します。録画のコピーをUSBドライブに保存します。そこから、分析するファイルを開きます。AMPA最大応答、およびGABA Aピーク応答を測定するには、まず、赤い線を見つけることによって0レベルまたはベースラインを確立し、次にそれをRingerアプリケーションまたはベースラインによって生成された電流にドラッグします。0レベルが確立されたら、緑色の垂直読み出しカーソルをグラフトレーサの目的の部分にドラッグして、応答測定値を決定します。ヒトシナプス受容体からの膜を注入した卵母細胞からのイオン電流が記録された。AMPA受容体は100マイクロモルのカイネートで活性化され、そして1ミリモルのGABAでGABAA受容体を活性化した。魚雷の電気器官からの濾過された膜の共注入は、アセチルコリン受容体に富み、そしてGABA行1受容体をコードするcDNAを動物極に、それらの応答に基づいて主に2群の卵母細胞を産生した。卵母細胞の1つの群はアセチルコリンに対して大きな応答を有したが、1つのマイクロモルGABAに対する応答はなかった。別の群の卵母細胞は、アセチルコリンに対する応答がゼロまたは低であったが、GABAに対する応答は大きかった。グラフ画像は、グループ1とグループ2のピーク電流の平均に標準誤差を加えた値を示しています。グループ2の1つの卵母細胞は、大きなGABAおよびアセチルコリン応答を有し、核の破裂を示唆した。その結果、応答の分布は、膜電流の分布の平均と中央値の差によって示されるように、低い値に歪んでいました。低応答卵母細胞の原因の1つは、膜が注入され、卵母細胞の核に閉じ込められていることです。非AD脳、およびAD脳から得られた濾過されていない膜を有する動物または植物極に注入された卵母細胞のGABAおよびカイニン酸応答がここに示されている。核を標的とせずに動物の極の近くに注射された卵母細胞は、植物極に注入された卵母細胞よりも大きな応答を示し、したがって、受容体の数が非常に少ない組織サンプルの研究を可能にした。この手順を実行するときは、常に Ringer レベルを監視してください。重要な録音中には常に不足し、その結果、卵母細胞の死、非常に貴重なデータの損失が使用されます。この手順に続いて、シナプス受容体または目的のタンパク質の存在を検証するために西洋負荷を実行することができます。これは、異なる脳領域における阻害シナプス比、および異なる脳障害に対するグローバルな興奮を測定することを可能にし、疾患の原因に関する理論的予測に関する直接テストを行うことを可能にする。

microtransplantation-synaptic-membranes-to-reactivate-human-synaptic

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神経科学

グルタミン酸作動性シナプスはサイレントモードにアクティブモードを切り替えることができます。我々は齧歯類の神経細胞の分散培養でそのシナプス前の活動状況を示すと、アクティブなシナプスを可視化するためにFM1 -​​ 43色素の修正可能なフォームを使用し、すべてのグルタミン酸シナプスを可視化するvGluT -...

光学顕微鏡で学ぶシナプス前サイレントシナプス

この報告書は、添付されたシナプス前boutonsを保持する個々の実行可能な神経細胞の機械的な分離のためのテクニックを示しています。...

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

このプロトコルでは、化学 wholemount...

バイオミメティック化学ニューロモデュレーション神経伝達物質グルタミン酸の in Vitroラット網膜のための方法論

このプロトコルの結合解離ひと多能性幹細胞由来神経細胞の再現性のある手法を目指して、アストロ サイト 3 D...

ひと多能性幹細胞からのニューロンとアストロ サイトの三次元共培養系によるシナプス局所回路におけるモデリング

シナプス小胞 (SV) 培養神経細胞におけるリサイクルの光分析について述べる。このプロトコルを組み合わせて二重トランスフェクション シナプス...

シナプス小胞の培養神経細胞シナプス蛋白質の過剰発現でリサイクルのため光アッセイ

このプロトコルは、以前にインビトロで神経前駆体から数週間分化していたヒト幹細胞由来ニューロンを再中断および培養するための詳細な手順を説明する。この手順は、光顕微鏡検査および高含有量スクリーニングと互換性のある形式で、神経伝達物、シナプス、および後期発現ニューロンマーカーのイメージングベースのアッセイを容易にします。...

ニューウトジェネシスとシナプス成熟の高含有量スクリーニングに対するヒト多能性幹細胞由来ニューロンの分化後再形成

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

ここでは、急性げっ歯類の脳スライスにおけるシナプス特異的な電気生理学的特性評価を可能にするために、光遺伝学的構築物を備えた個別の脳領域のウイルス形質導入を記述するプロトコルを提示します。...

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

ここに提示されたプロトコールは、免疫適格マウスにおける鼻腔内経路を介して誘導多能性幹細胞由来ヒトミクログリア(iPSMG)の脳への移植を可能にする。iPSMGの維持のための細胞の調製および経鼻移植ならびにサイトカイン混合物の投与のための方法が示されている。...

ヒト人工多能性幹細胞由来ミクログリアの免疫適格マウス脳への非侵襲的経鼻経路による移植

ニューロンプログラミングによって生成されたヒト多能性幹細胞由来のGABA作動性ニューロンの移植は、神経発達障害の潜在的な治療アプローチとなる可能性があります。このプロトコルは、ヒト幹細胞由来のGABA作動性ニューロン前駆体の生成と新生児マウスの脳への移植を記述しており、移植されたニューロンの長期的な調査とその治療可能性の評価を可能にします。...

ヒト幹細胞由来GABA作動性ニューロンの生後早期マウス海馬への移植による神経発達障害緩和

ここでは、化学的に再プログラムされた幹細胞をドーパミン作動性前駆細胞に分化させ、パーキンソン病のマウスモデルに移植し、移植された細胞の成功した統合と機能的有効性を確認するために、これらの細胞を正確なニューロン調節を達成するためのプロトコルについて説明します。...

神経変性疾患の治療における再プログラム幹細胞由来前駆細胞における化学遺伝学的制御

学ぶシナプス膜の微小移植法でXenopus laevis卵母細胞を用いてヒトのAMPAおよびGABA受容体の応答を記録する技術。この方法は神経変性疾患や精神疾患におけるシナプス受容体の機能変化を解明し、治療法開発に貢献する。

機能研究のためのヒトシナプス受容体を再活性化するためのシナプス膜の微小移植

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