インビトロ 巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

この尺度は、複雑な生化学的調節を欠く細胞の最小モデルを構築する。使用される技術は、リポソームの高収率を生成し、細胞骨格タンパク質に対して高いカプセル化効率を有することができる。この対策は、さまざまなタンパク質や、微粒子や自己準備マイクロスイマーなどの大きな物体のカプセル化に適用できます。

個人は、最初の数回の試みでリポソーム収量を増やすのに苦労しています。歩留まりを上げるために、原稿のセクションを定期的に議論して詳細を確認することをお勧めします。はじめに、0.1ミリモルのCACL2種、10ミリモルのHEPES、1ミリモルのDTT、0.5ミリモルのDAPCO、320ミリモルのスクロース、および0.2ミリモルのATPを混合することにより、水性内部非重合緩衝液を総容量5ミリリットルで調製する。

摂氏4度で内側の非重合バッファーにタンパク質を添加して、タンパク質ミックスを調製します。アクチン層を形成するには、100ナノモルのゲルカリン、4マイクロモルのコファリン、および2.2マイクロモルのVCA HEZをタンパク質ミックスに加えます。対照実験として、タンパク質混合物を1ミリリットル当たり100マイクログラムの蛍光色素に置き換えます。

100ミリモルの塩化カリウムを混合することにより、全量5ミリリットルの水性内部重合緩衝液を調製する。4ミリモル塩化マグネシウム、10ミリモルHEPES、1ミリモルDTT、0.5ミリモルDABCO、10ミリモルATPおよび80ミリモルスクロース。内部非重合緩衝液と内部重合緩衝液を1対1の容量比で混合して最終緩衝液を調製し、リポソーム内に封入されることになる総容量30マイクロリットルの内水溶液を得た。

10ミリモルのHEPES、50ミリモルの塩化カリウム、2ミリモルの塩化マグネシウム、0.2ミリモルの塩化カルシウム、2ミリモルのATP、1ミリモルのDTT、0.5ミリモルのDAPCO、212ミリモルのグルコースおよび0.1ミリグラム/ミリリットルのベータケーシングを混合することにより、総容量150マイクロリットルの水性外部緩衝液を調製する。脂質油混合物を調製するには、1ミリリットルあたり25ミリグラムの100マイクロリットルをガラスバイアルに加えることから始めます。アルゴンガスでクロロホルムを蒸発させ、バイアルの底に乾燥した固体脂質フィルムを残します。

アクチン層を形成するには、クロロホルムを蒸発させる前に、EGGPCとニッケル脂質の比率を10対1の割合でニッケル脂質を加えて混合します。2ミリリットルの鉱油を加える。クロロホルムを蒸発させ、脂質を再懸濁するために、浴中で室温で脂質油混合物を1時間超音波処理する。

目的のタンパク質を含む単層脂肪滴を調製するための油エマルジョン中の最終バッファーを調製する。まず、100マイクロリットルの脂質油混合物をプラスチックチューブに入れ、10マイクロリットルの最終バッファーを脂質油混合物に加えます。最終バッファーが 1 つの液滴に入っていることを確認します。

ガラスシリンジを使用して、最初に少量の脂質オイル混合物を吸引し、次にシリンジの先端を液滴の周囲に配置して小さな液滴に分解することにより、最終的なバッファー液滴を吸引します。濁ったエマルジョンが形成されるまで、上下に複数回穏やかに吸引します。30マイクロリットルの外部バッファーを別のプラスチックチューブに入れます。

30マイクロリットルの脂質オイル混合物を外側のバッファーの上に置き、約10分間放置して、界面に脂質単層を発達させます。リポソームを調製するには、50マイクロリットルの最終バッファーオイルエマルジョンをチューブの上部油相に注意深く加えます。プラスチックチューブを摂氏4度で100倍Gで15分間遠心分離します。

時間と遠心分離速度を変化させ、リポソーム形成のために最適化する。必要に応じて、余分な容量をピペット吸引して油相を慎重に取り除きます。リポソーム相の上にオイルのメニスカスが作成されないように、ピペットチップをチューブの側面に置かないようにしてください。

新しいピペットで、ピペットの先端を切ります。ピペットを残りのボトムフェーズにゆっくりと貼り付け、水性容量を吸引してリポソームを収集します。100マイクロリットルの外部バッファーをインキュベーションチャンバーのウェルに注ぎます。

採取したリポソームを外側のバッファーに静かに入れ、チャンバーの上に別のカバースリップを置きます。63倍の油浸対物レンズを使用して共焦点顕微鏡でリポソームを観察します。488、647、および561ナノメートルのレーザーラインを使用します。

蛍光標識脂質を観察するために、封入蛍光色素および封入蛍光標識アクチンをそれぞれ行った。目的のフレームをキャプチャし、画像をTIF形式で保存します。画像J内の画像を処理および分析まず、画像Jソフトウェアを使用してTIFファイルを開きます。

画像に移動し、[調整]をクリックします。明るさのコントラストに続いて、最小設定と最大設定、明るさとコントラストのスライダーを調整して、画像の明るさとコントラストを目的のスケールに調整します。ツールバーの長方形選択ツールをクリックし、関心領域を選択します。

画像に移動し、[切り抜き]をクリックしてROIをトリミングします。[解析] に移動し、[縮尺を設定] をクリックします。ポップアップウィンドウで、ピクセルアスペクト比フィールドに1.0と入力し、長さの単位としてマイクロメートルを設定します。

[ピクセル単位の距離] フィールドに、画像の幅をピクセル単位で入力します。既知の距離フィールドに、実際の画像の幅をミクロン単位で入力します。リポソームのサイズを測定するには、ツールバーの楕円形の選択ツールを使用して、リポソームのエッジに沿って円を描きます。

分析に移動し、[測定]をクリックして円の面積を測定し、そこからリポソームの直径を計算できます。リポソーム生成の成功は、緑色の蛍光脂質二重層である薄い円形のリングの視覚化によって検証されます。共焦点顕微鏡を用いて488ナノメートルレーザー下で蛍光色素の封入を確認した。

リポソームの内部環境は、647ナノメートルのレーザー下で均一に蛍光する必要があります。リポソームの形成は、薄い緑色の円形のリングによって視覚化することができます。リポソーム内のネットワークにおける再構成された影響は不均一であり、アクチンフィラメントの分岐ネットワーク構造として現れる。

分岐アーキテクチャは、VCA HEZとともにアクチンフィラメントの核形成と分岐を同時に制御するARP two 3複合体の導入によって引き起こされました。薄いが密に分岐したアクチン層が、蛍光として視覚化できるリポソームの二重層の内側のリーフレットに作成されます。脂質オーディオ最終緩衝液混合物は、気泡の導入を避けるために、一般にガラスシリンジを通して前後にポンプで送られなければならない。

混合物はプロセス後に白っぽくなければなりません。この技術は、複雑な生化学的調節を欠いた細胞の最小限のモデルを構築するための道を開いた。この細胞模倣システムにより、研究者は細胞骨格タンパク質、核細胞、分子モーターの機械的および動的特性を調べることができます。