Name: 薬物治療後の腫瘍凝集体内の局所細胞密度の非破壊的評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学ぶ 3D腫瘍凝集体の非破壊的細胞密度評価法。OCTイメージングを用いて薬物治療後の局所細胞密度と生存率をリアルタイムで追跡し、抗がん薬の浸透性と治療応答を評価する革新的アプローチです。

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この研究は、NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) および NIH R01 CA233188 (MB) によって支持された。これらの実験に提供されたトラスツズマブについて、AMC薬局に感謝します。

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<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+An+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
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<li>Freyei, J. P., Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+growth+saturation+and+development+of+necrosisin+EMT6%2FR0+multicellular+spheroids+by+the+glucose+and+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply.</a> Cancer Research. 46 (7), 3504-3512 (1986).</li>
<li>Desoize, B., Jardillier, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+resistance%3A+a+paradigm+for+clinical+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology+Hematology%22%5BJournal%5D)">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance.</a> Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).</li>
<li>Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+quiescent+tumour+microregions+for+evaluating+multicellular+resistance+to+chemotherapeutic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs.</a> British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).</li>
<li>Roberge, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-destructive+tumor+aggregate+morphology+and+viability+quantification+at+cellular+resolution%2C+during+development+and+in+response+to+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug.</a> Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).</li>
<li>Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-image+based+methods+used+for+non-invasive+volume+estimation+of+cancer+spheroids+a+practical+assessing+approach+based+on+entry-level+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22Computer+Methods+and+Programs+in+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment.</a> Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).</li>
<li>Imamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+2D-+and+3D-culture+models+as+drug-testing+platforms+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer.</a> Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+multicellular+tumor+spheroids+towards+optimized+treatment+for+patients+with+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).</li>
<li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).</li>
<li>Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+3D+environments+to+elucidate+the+effect+of+environmental+parameters+on+drug+response+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer.</a> Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+HHS+public+access%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography HHS public access.</a> Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).</li>
<li>Zhong, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+permeability+of+glycerol+with+ultrasound+in+human+normal+and+cancer+breast+tissues+in+vitro+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography.</a> Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).</li>
<li>Fujimoto, J., Swanson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development%2C+commercialization%2C+and+impact+of+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+detects+necrotic+regions+and+volumetrically+quantifies+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids.</a> Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).</li>
<li>Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+complements+confocal+microscopy+for+investigation+of+multicellular+tumour+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>El-Sadek, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+dynamics+optical+coherence+tomography+for+tumor+spheroid+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation.</a> Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844(2021).</li>
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<li>Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal%2C+label-free+assessment+of+cell+density+and+viability+in+multicellular+tumor+spheroids+via+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Summer+Biomechanics%2C+Bioengineering%2C+and+Biotransport+Conference%22%5BJournal%5D)">Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography.</a> Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).</li>
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<li>Riffle, S., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tumor+cell+adaptations+to+hypoxia+in+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 36, 102(2017).</li>
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<li>Pozzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+me+halfway%3A+Are+in+vitro+3D+cancer+models+on+the+way+to+replace+in+vivo+models+for+nanomedicine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760(2021).</li>
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</ol>

著者らには開示するものは何もありません。

意味 多細胞腫瘍スフェロイド(MCTS)は、腫瘍の進行および薬物スクリーニングを研究するための強力な3D in vitroモデルである1,2,3。これらの比較的単純な集合体の有用性を前進させることは、腫瘍モデルの進行および治療応答の両方に影響を与えることが知られている形態および細胞密度などのそれらの主要な特徴の特性評価に大きく依存する。しかし、それらの必要なサイズは、特に非破壊分析において、これらの特性を評価する際に課題をもたらします。提示された方法は、高密度3D凝集モデルの離散領域内の細胞密度および生存率の縦方向およびラベルフリー定量化のための新しいツールを提供する。同じ集合体は、複数の開発日にわたって光コヒーレンス断層撮影(OCT)で再画像化することができます。これらの体積スキャンは、MCTSの成熟中に細胞密度が局所的にどのように進化するかを特徴付けるために分析することができる。これらの同じ...

研究者らは、腫瘍進行の重要な特徴のいくつかを研究するために、主にベンチトップ3D培養in vitroシステムに目を向けている。この研究の多くは、多細胞腫瘍スフェロイド(MCTS)およびより複雑なオルガノイド1,2の再出現によって導かれてきた。これらのモデルは水蒸気であるが、それらはインビボで起こる生理学的および病理学的プロセスを反復するための強力なツールを提供する3、4、5。特に、中規模モデル(直径300~500μm)は、3D構造、病態生理学的勾配、コア内の低酸素による転移性シグナル伝達などの主要な腫瘍特徴を模倣することができる。これらのモデルは、血管化されたin vivo腫瘍に見られる特徴的な同心円状の層、すなわち増殖性細胞の外層、老化/静止細胞の移行層、およびコア3,6,7,8,9において低酸素状態を経験している細胞を示すことが十分に文書化されている3,6,7,8,9 .これらのモデルから、これらの層内、開発中および薬物への応答における細胞挙動を特徴付けることによって、独自の洞察を得ることができます。しかし、インビトロモデルを非常に強力にする勾配を開発するために必要なMCTSサイズは、非破壊評価に使用されるツールを大幅に制限します。実際、MTCSの非破壊分析における最大の課題の1つは、細胞スケールの詳細を定量化することです。明視野顕微鏡および位相差顕微鏡は、3D MCTSの成長と発達を非破壊的に評価するために日常的に利用されています。しかし、これらのモダリティは2D投影に限定されており、これらのモデル10,11,12,13の重要な3D構造を視覚化する能力に欠けている。細胞毒性および細胞増殖に関する情報は、典型的には、蛍光画像化(すなわち、光シート顕微鏡、共焦点顕微鏡)またはエクスビボ免疫組織学的染色14、15、16を介して収集される。これらのアプローチは、組織構造、細胞密度、および細胞機能に関する貴重で高解像度の情報を提供しますが、多くの場合、縦方向の分析を妨げる光学的透明化、固定/染色、埋め込みなどのサンプル調製が必要です。
光コヒーレンス断層撮影(OCT)は、上記の課題のいくつかを克服する可能性を秘めた非破壊構造イメージングモダリティです。これは、セルラー解像度と十分に広い視野(最大10mm x 10mm)を誇り、多細胞集合体全体を視覚化することができます17、18、19。重要なことに、使用される光の目に見える性質のために、この技術は完全に非破壊的であり、ラベルフリーである17。また、サンプルをインキュベーターから直接採取し、OCT(スキャン時間〜5〜10分)で迅速にスキャンし、インキュベーターに戻すことができるため、サンプル調製を必要とせずにその場でサンプルを画像化することができ、縦方向の特性評価が可能になります。腫瘍スフェロイドの挙動を分析するためにOCTを使用しようとする多くの研究が最近出現した。最もエキサイティングなデモンストレーションの1つで、HuangらはOCTを使用して大型腫瘍スフェロイドモデル内の壊死コアを非破壊的に検出し、生細胞領域と死細胞領域には光減衰の識別可能な違いがあり、ラベルフリーの生存率モニタリングに利用できる可能性があると指摘しました20。同様に、Hariらは、試料21内の低酸素症の存在を研究するために、OCTで画像化したヒト結腸癌(HCT116)スフェロイドの屈折率(RI)測定を実施した。彼らの測定値は直接推論には十分ではなかったが、後に共焦点顕微鏡によって同定された壊死コアの部位(サイズではないが)と相関する場所でRIの低下を観察した。Abd El-SadekらはOCTを用いて、乳癌腫瘍モデルの局所組織生存率を可視化および定量化した22。彼らは、組織ダイナミクスを視覚化するための2つのOCTベースの方法を報告し、これらのメトリックの違いと顕微鏡検査で同定された生細胞/死細胞の領域との間に中程度の相関関係を示した。
OCTを用いた我々の出版された研究は、この先行文献に基づいて構築され、開発中のMCTS乳癌モデル内の3D形態および細胞数を測定するための定量的、非破壊的アプローチを確立した10,23。Imaris 3Dレンダリング画像解析ソフトウェアを使用して、OCTボリュームスキャン内で画像化された細胞サイズのオブジェクト(すなわち、スポット)の数をカウントし、凝集解離時に血球計数器を介して決定されたものと統計的に類似していたMCTSにおいて、細胞カウントを非破壊的に測定した。しかし、OCTの構造的性質上、壊死による細胞死後もなお存在する細胞膜は、誤って生細胞として数えられることがある。さらに、この特徴付けは、有望な成功を伴う薬物レジメンに付された個々の凝集体内の細胞生存率を非破壊的に追跡するために拡張された10。重要なことに、我々のOCT-Imarisアプローチから、解離時にこれらのサンプル内でベンチマークされたものと同様の細胞生存率が報告されたことに留意された。この非破壊的でラベルフリーの細胞アプローチにより、構築物/凝集体構造を犠牲にすることなく、3Dコンストラクトおよび高密度凝集体内で細胞を縦方向にカウントできます。
本研究は、OCT-Imarisの3D凝集体形態と細胞数の両方を測定する能力を活用することにより、高密度凝集体内の局所細胞密度を直接定量化する改善されたアプローチを報告している。この方法論の進歩は、MCTSモデルの特徴的な同心円層内の細胞の空間分布と増殖のより詳細な画像を提供する。このような局所密度測定は、単に凝集体全体の平均細胞密度を計算するのではなく、圧縮に関連するものなどの細胞密度勾配を明らかにすることができる。この局所的評価は、局所細胞密度の変化によって測定される局所的な薬物応答を評価するために、化学療法で処理された凝集体にも適用される。OCTと高度なイメージング解析方法のこの組み合わせは、細胞密度の低下を経験する領域に基づいて薬物浸透を探索するために使用することができる局所細胞生存率の定量化を提供する。これは、高密度の細胞組織内の薬物に応答して局所的な細胞密度および生存率を非破壊的に定量化し、それを縦方向に測定する最初の報告である。MCTS全体にわたる3次元細胞密度および空間分布のこのような特性評価は、がん治療における薬物送達を最適化し、がんモデルの進行の理解を改善するのに役立つ可能性がある。

<table><tbody><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Greiner Bio-One&nbsp;</td><td>650970</td><td>CellStar Cell-Repellent Surface,</td></tr> <tr><td>https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/.25% トリプシン, 2.21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>AU565 乳がん細胞</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>FIJIソフトウェア</td><td>オープンソース</td><td>(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j</td><td>Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267151B</td><td></td></tr><tr><td>Imaris image analysis software</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Current version 9.8</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>コーニング</td><td>354263</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 乳がん細胞</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>Z1 AxioVision</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>コーニング</td><td>30-0002CI</td><td></td></tr><tr><td>プレート遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 培地 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>スペクトル ドメイン光干渉断層撮影</td><td>ThorLabs</td><td>TEL220C1</td><td></td></tr><tr><td>T75細胞培養フラスコ</td><td>Greiner Bio-One&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>この研究では、アルバニー医科大学薬局から寛大に寄贈</td>された<td>トラスツズマブ</td>残存臨床サンプル658175トラスツズマブ<td></td><td></td>残存物が使用されました。</tr></tbody></table>

薬物治療後の腫瘍凝集体内の局所細胞密度の非破壊的評価

Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment

多細胞腫瘍スフェロイド(MCTS)モデルは、がんの進行に関する インビトロ 研究および創薬の有用性が高まっていることを実証している。これらの比較的単純な無血管構築物は、3D構造および病態生理学的勾配などの in vivo 腫瘍の重要な態様を模倣する。MCTSモデルは、スフェロイド発生中および薬物に対する応答における癌細胞の挙動に関する洞察を提供することができる。ただし、必要なサイズは、非破壊評価に使用されるツールを大幅に制限します。光コヒーレンス断層撮影構造イメージングとImaris 3D解析ソフトウェアは、MCTS内の局所細胞密度の迅速、非破壊、およびラベルフリー測定のために探求されています。このアプローチは、4日間の成熟期間にわたって、および臨床的に関連する抗HER2薬であるトラスツズマブによる5日間の延長治療を通してMCTSを評価するために利用される。簡単に説明すると、AU565 HER2+乳がんMCTSは、異なる形態の凝集体(それぞれ、より厚い、円盤状の2.5D凝集体または平らな2D凝集体)を探索するために、マトリゲル(基底膜マトリックス)の添加の有無にかかわらず、液体オーバーレイ を介して 作成された。外側領域、遷移領域、および内側コア内の細胞密度は、成熟したMCTSにおいて特徴付けられ、外層と比較してコア領域におけるより高い細胞密度を有する細胞密度勾配を明らかにした。マトリックスは、セル密度を再分配し、この勾配を強化し、外側ゾーン密度を減少させ、コア内のセル圧縮を増加させる。細胞密度を、薬物応答の潜在的な地域差を評価するために、漸進的に深い100μmゾーン内の薬物処理(0時間、24時間、5日)後に定量した。最終時点までに、ほとんどすべての細胞死は各凝集体の外側200μmに拘束されているように見えたが、凝集体内のより深い細胞はほとんど影響を受けていないように見え、おそらく薬物浸透の制限による薬物応答の局所的な違いを示した。現在のプロトコルは、高密度の細胞組織内の局所細胞密度を非破壊的に定量化し、それを縦方向に測定する独自の技術を提供します。

以前の出版物では、OCT10を使用して細胞凝集体内の全球細胞密度を非破壊的に測定するための方法が確立された。本明細書では、この技術は、発達中の細胞凝集塊の局所的な細胞密度を評価するために拡張される。図1は、この拡張の概略図を示しており、図1B、Cの黄色の円で示された小さな(直径100μmの)球形プラグを代わりに見ることによって、回転楕円体の同心円層またはより局所的に細胞密度を評価できます。MDA-MB-231腫瘍スフェロイドは、凝集体内に中心点を設定し、スフェロイドの連続した同心円層内の物体/細胞の数を数えることによって最初に評価された。これらの結果を図 2 に示します。スチューデントのt検定は、回転楕円体コアにおいて、遷移層(p = 4.3e-4)および外層(p = 4.0e-6)よりも有意に高い細...

本プロトコルは、3D腫瘍凝集体内の迅速、非破壊的、かつラベルフリーの局所細胞密度および生存率測定のための画像ベースの技術を開発する。この知見は、細胞密度勾配を明らかにし、トラスツズマブで処理したHER2+凝集体では、凝集体の発生と主に末梢細胞死において、コア領域における細胞密度が外層よりも高いことを明らかにした。

Multicellular tumor spheroid (MCTSs) models have demonstrated increasing utility for in vitro study of cancer progression and drug discovery. These ...

このプロトコルは、腫瘍モデルの進行に関する情報を非破壊的な方法で提供する。また、年齢一致サンプルに依存するのではなく、単一の凝集体内の薬物レジメン全体を通じて治療応答の指標を提供します。凝集体内の細胞密度と生存率を得るための従来の方法は、サンプルの固定と切片化を必要としますが、私たちの方法は非破壊的にデータを提供します。そのため、時間の経過とともに 1 つの集計内で変更を追跡できます。この手法は、集合体の控えめな領域における薬物応答の理解を深め、これらのモデルがインビボ応答および薬物スクリーニング用途をどの程度反映しているかに示唆することが期待される。開始するために、標準条件下で所望の細胞株の70〜90%コンフルエント細胞培養物を調製する。標準的なトリプシン処理法に従って細胞単層をそれらの培養フラスコから剥離し、細胞懸濁液を遠沈管に加える。10マイクロリットルの細胞懸濁液を血球計数器に加え、顕微鏡検査でカウントして懸濁液中の細胞数を決定する。ペレット細胞は遠心分離を経て、細胞を1ミリリットル当たり5番目の細胞に10倍から2.5倍の所望の濃度で培地に再懸濁した。基底膜マトリックスで調製した懸濁液の場合、マトリックスバイアルをマイナス20°C保存から取り出し、冷蔵庫に入れて一晩解凍する。成長培地を入れた容器を準備し、10分間冷蔵して冷やします。凍結ピペットチップを用いて、この溶液の最終濃度が5%となるように冷却培地にマトリックスを加える丸底の各ウェルにこの培地を50マイクロリットル加え、非付着性96ウェルプレートに、これらのウェル中のマトリックスの最終濃度が2.5%以下の細胞懸濁液の添加後になるようにする。マトリックスなしで調製した懸濁液の場合、50マイクロリットルの平らな成長培地を各ウェルに加える。50マイクロリットルの細胞懸濁液を各ウェルに分配する。播種直後にプレートを123Gで室温で10分間遠心分離し、各ウェルの底部に細胞ペレットが確実に集められるようにした。構造イメージングにOCTシステムを利用する。高解像度の画像コレクションの場合は、スキャン レートを 5.5 キロヘルツに設定します。液体媒体中のサンプルの屈折率を 1.33 に設定します。画面右側の画像パラメータウィンドウで、サンプルがこの関心領域内に収まるように、X、Y、Z の値を入力して視野を設定します。[3D取得モード]をクリックし、[記録]をクリックしてサンプルの3Dボリュームスキャンを収集します。ボリュームの再構築を作成するには、Imaris を開き、アリーナ内で変換された TIF ファイルに移動します。編集に移動し、[画像のプロパティ]をクリックして、OCT画像のボクセルサイズを対応するXYZボックスに入力します。次に、[OK]をクリックします。オブジェクトツリーの上にある「新規サーフェスを追加」をクリックします。ツリーの下のメニューで、[自動作成をスキップ]をクリックして手動で編集します。表示調整ウィンドウ内で、赤と黒の矢印を手動でスライドさせて、サンプルと背景のコントラストを高め、サンプルの視覚化を改善します。スライス位置をサンプルの一方の端のスライスに合わせます。エスケープキーを使用してマウスをナビゲーションモードから選択モードに変更し、[描画]をクリックします。信号を表示している領域の輪郭を手動でトレースします。次の位置を入力ボックスに入力して、スライス位置を進めます。この次の位置は、前の位置よりもさらにサンプルに100スライス以下でなければなりません。信号を表示している領域を手動でトレースします。サンプルの反対側の端に達するまで、サンプルの厚さを通してこのステップを繰り返します。次に、[サーフェスの作成]と左側のメニューをクリックして、これらのスライスをステッチします。最後に、「編集」をクリックし、「マスク選択」をクリックしてから、「OK」をクリックしてボリュームの再構築を完了します。サンプルの総細胞密度を取得するには、[新しいスポットを追加]を選択します。アルゴリズム設定メニューで、すべてのボックスの選択を解除します。青い矢印をクリックして、ソースチャンネル画面に移動します。表示されるドロップダウンメニューから、マスクされたチャンネルを選択します。サンプルの平均セル径をXY径ボックスに入力します。バックグラウンド減算がチェックされていることを確認します。青い矢印をクリックして、分類スポットの画面に移動します。メニューの下部にあるグラフで、黄色のしきい値の左端をクリックしてグラフの左端にドラッグし、すべてのオブジェクトが黄色の影付きのしきい値に含まれるようにします。次に、緑色の矢印をクリックしてスポットの作成を完了します。「統計」をクリックして識別されたオブジェクトの数を取得します。次に、「全体」をクリックし、最後に「スポットの総数」をクリックします。作成したサーフェスをクリックし、[サーフェス スタイルの品質]タブに移動します。選択範囲を [中心点] に変更し、ピクセル幅を 20 未満に変更して、最適な視認性を実現します。[統計] に移動します。次に、「詳細」をクリックしてから、「位置」をクリックして、中央のスポットの位置を記録します。オブジェクトツリーの上にあるメニューから「新規参照フレームを追加」を選択します。メニューの X、Y の横にある表示ボックスと固定ボックスをオンにします。参照フレームアイコンの中心をクリックしてドラッグし、中央のスポットと一直線に揃えます。「XY 表示」ボックスと「修正」ボックスの選択を解除し、「XZ」用に選択します。もう一度、参照フレームアイコンの中心をクリックしてドラッグし、中央のスポットと一直線に揃えます。最後に、YZ 平面に対してこれを繰り返し、参照フレームが中心スポットと完全に揃うまで、これら 3 つの固定平面を交互に繰り返します。オブジェクトツリー内の参照フレームをダブルクリックし、中央などの名前を変更します。作成したスポットをクリックし、[統計]に移動します。次に、「詳細」をクリックし、「参照フレームの位置」をクリックします。位置X参照フレームをクリックして、最高値から最低値にソートします。最大値を記録して、集計の半径を取得します。手動計算を実行して、追加の対象場所を決定します。これを行うには、X の中心値に 100 マイクロメートルを追加し、中心点の Y 値と Z 値を使用して、中心軸に沿った最初の位置を定義します。[新しいスポットを追加]を選択します。次に、「自動作成編集を手動でスキップ」を選択します。キーボードのシフトボタンを押したまま、画面上の任意の場所をクリックして新しいスポットを配置します。対象となる最初の位置の XYZ 位置値を入力します。次に、「新規参照フレームを追加」を選択し、その位置に揃えます。連続する各 X 位置に 100 マイクロメートルを追加します。最後の参照フレームをサンプルの外側の半径から50マイクロメートル未満離して配置します。作成したスポットをクリックし、[統計]に移動します。メニューの右下隅にある[すべての統計をファイルにエクスポート]をクリックし、データをスプレッドシートに保存します。スプレッドシートを開きます。「原点からの距離」参照フレームタブに移動します。mod 関数を使用して、対応する参照フレームに各距離を数値的に割り当てます。この列の値をフィルター処理して、各参照フレームの距離を操作します。参照フレームごとに、関数 COUNTIF を使用して、フレームから 50 マイクロメートル以内のオブジェクト数を計算します。結果の値は、その地域のプラグ内のセルの数に対応します。この値を100マイクロメートルプラグの体積で割って、セル密度を求めます。スチューデントのT検定では、MDA-MB-231スフェロイドモデルの遷移層および外層よりも、回転楕円体コアの細胞密度が有意に高いことが明らかになった。結果は、4日後にこの回転楕円体コアが圧縮されたことを示しています。AU565およびMDA-MB-231凝集体モデルの両方において、マトリックスの添加は体積または細胞数に影響を及ぼさないようであり、したがって細胞増殖に無視できる程度の影響しか及ぼさないようである。むしろ、マトリックス添加は、有意なコア圧縮を促進し、外層における細胞密度を低下させる細胞密度を再分配するように見える。この新知見は、マトリックスがさまざまな乳がん細胞株における細胞凝集を可能にする物理的メカニズムに関する貴重な手掛かりとなる。次に、マトリックスで調製したAU565腫瘍スフェロイドを見て、成熟凝集体をトラスツズマブで処理し、局所細胞密度を5日間の薬物レジメンを通して評価した。プラグは、凝集体の厚さ全体にわたって100マイクロメートルごとにセットした。細胞密度のわずかな変動は、最小の細胞死を示す各凝集体の内側500マイクロメートル内で経時的に観察された。主に腫瘍スフェロイドの外層における薬物応答の指標としての細胞死の可視化は、トラスツズマブの薬物浸透の問題と一致する。構造を犠牲にすることなく、凝集体の細胞生存率を非破壊的に測定できるようになりました。これにより、単一の腫瘍凝集体における縦断的な薬物応答の評価が可能になり、候補抗がん剤の時間的および浸透性の性質が同定される。

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医薬品評価研究のための3D腫瘍スフェロイドの作製

本稿では、抗腫瘍抗体の重要ながん細胞死滅機構であるADCC機構を調節する化合物を同定する方法について紹介する。NK細胞の細胞毒性効果は、トラスツズマブの存在下で乳がん細胞スフェロイドで測定されます。画像解析により、スフェロイドの生細胞と死細胞、および標的細胞が同定されます。...

腫瘍スフェロイドモデルにおける抗体依存性細胞傷害性の定量化:創薬への応用

患者由来の腫瘍オルガノイドは、基礎研究およびトランスレーショナル研究のための高度なモデルシステムです。この手法では、異なるオルガノイド表現型の同時速度論的評価のためのマルチプレックス蛍光生細胞イメージングの使用について詳しく説明します。...

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学ぶ 3D腫瘍凝集体の非破壊的細胞密度評価法。OCTイメージングを用いて薬物治療後の局所細胞密度と生存率をリアルタイムで追跡し、抗がん薬の浸透性と治療応答を評価する革新的アプローチです。

薬物治療後の腫瘍凝集体内の局所細胞密度の非破壊的評価

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