Name: 嫌気性増殖細菌によるマウス膣コロニー形成モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぶマウス膣コロニー形成モデルで嫌気性細菌の感染動態を解明する方法です。Gardnerella vaginalisなどの厳格嫌気性菌を用いた膣内接種と回収技術を詳しく説明し、女性生殖器感染症の研究に活用できます。

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これらのモデルの開発中に技術支援を提供してくれたリン・フォスターに感謝します。分子微生物学部門と女性感染症研究センター(ALへ)からのスタートアップ資金、および初期段階の実験を支援するのに役立ったマーチオブダイム(ALへのバジルオコナー賞)に感謝します。国立アレルギー感染症研究所(R01 AI114635)もこれらのモデルの開発を支援しました。

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 <a target="_blank" href="https://app.biorender.com/biorender-templates">https://app.biorender.com/biorender-templates</a> (2022).</li>
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著者は利益相反を宣言しません。

ここで説明するモデルが以前に公開された膣接種モデルと異なる最も重要な点は、嫌気的に培養された細菌の使用であり、生存可能な接種材料の調製とマウスからの細菌の回収に特別な配慮が必要です。上記のプロトコルの具体的な手順は、 補足ファイル1で提案されているように、使用する細菌の種/菌株によってわずかに異なる場合があります。さらに、この原稿は、細菌と膣洗浄剤を投与するための新しい手順を説明しており、研究者の経験が少なく、マウスの拘束が少なくて済みます。実験者がステップ3.2で説明されている拘束の形式に慣れていない場合。ステップ3.3.は、マウスを、実験デザインおよび施設内IACUCガイドラインに従って麻酔の有無にかかわらず、前述のように34 のように絞首刑にすることができる。
マウスモデルで嫌気的に培養された細菌を使用することに関する重要な注意点は、特定のステップ(生きている動物が関与するステップなど)は嫌気室の外で行わなければならないということです。したがって、このプロトコルの最も重要なステップは、目的の細菌がマウスの接種中などの好気性環境にさらされるステップです。このモデルで新しい嫌気性菌を使用するには、酸素への曝露時に生存能力を維持する能力に関する予備調査が必要になります(ステップ2.5およびステップ3.4で説明されている接種前と接種後のCFUの比較など)。生物の酸素およびPBS感受性の程度に応じて、接種材料の調製の異なる方法を検討する必要があります(補足ファイル1、ステップ2.4.5)。 G. vaginalis JCP8151Bを用いた接種では、1本の接種材料をPBSで調製し、すべてのマウスに感染させることができることを見出しました。酸素に敏感な別の嫌気性細菌を使用している場合は、代わりにマウスごとに別々のチューブで接種材料を調製できるため、チューブの開閉を繰り返す必要はありません。同様に、関心のある細菌種が G.膣 よりもPBSでより潔癖である/生存能力が低い場合は、代わりに培養培地で接種を調製することができます。使用される培地に、 Prevotella bivia の培養に使用されるCDC嫌気性菌培地(補足ファイル1、ステップ2.1.およびステップ2.2)などの還元剤が含まれている場合、細菌は酸素曝露からの保護も強化されます。
チューブキャップを閉じた状態で行われ、したがってハンドヘルドホモジナイザーよりも少ない酸素を導入する可能性のあるビーズビート22,35などの均質化の代替方法も検討できます。さらに、より酸素感受性の生物は、培地に対してより長い平衡時間を必要とする可能性がある。レサズリンなどの酸素インジケーターを使用して、嫌気性条件に達したことを確認できます(ステップ2.1)。嫌気性ジャーなどの代替方法は結果に影響を与える可能性があるため、使用前に細菌の生存率を精査する必要があります。
実験生物の酸素感受性と潔癖さも、洗浄/ホモジナイズ中にマウスから生菌を正常に回収する上で役割を果たす可能性があります(補足ファイル1、ステップ3.2.およびステップ5.1)。非常に敏感な生物の場合、洗浄が採取されてからメッキされるまでの時間は、生存能力の喪失につながり、細菌の膣コロニー形成の人為的に低い推定値を引き起こす可能性があります。この影響を軽減するために、収集された洗浄剤は、新鮮な嫌気性培養培地(還元剤を含む)に直ちに希釈することができます。同様に、臓器の均質化は、細菌の生存率を高めるためにPBSではなく新鮮な培養培地で行うことができ、酸素曝露を最小限に抑えるために嫌気性チャンバー自体で行うこともできます。
与えられた実験の目的に応じて、実験者は対照群に注意を払う必要があります。仮説を検証するために、ビヒクルのみで模擬処理された非感染対照マウスのベースライン測定値は、ケモカイン/サイトカインの誘導または他の特定の感染結果があるかどうかを確認するのに役立ちます。使用するコントロールビヒクルは接種に使用するビヒクルと同じでなければならないため、細菌を培地で接種する場合は、接種されていない培地をコントロールとして使用する必要があります(補足ファイル1、ステップ2.4.5)。
このプロトコルに記載されている方法は、嫌気的に増殖することができるが、好気性培養条件( 大腸 菌やグループB 連鎖球菌など)を使用して伝統的に研究されている通性細菌にも適用できます。これは、子宮頸部などの低レベルの酸素を含むと考えられている身体部位でのこれらの生物による感染症に特に関連している可能性があります。通性生物は、接種源が好気的によりも嫌気的に調製された場合、より少ない酸素でよりうまく部位に感染する可能性がある。このような実験では、CFU列挙のための生菌の回収は嫌気性条件を必要としない場合がある。

哺乳類では、膣は細菌種のコンソーシアムの本拠地です。ヒト膣マイクロバイオームは、ラクトバチルス属のメンバーの豊富さと対応する低い膣pH(3.8-4.5)1,2,3,4において哺乳類の中で独特です。この乳酸菌優勢の崩壊は、さまざまな健康上の悪影響と関連しています。
細菌性膣炎(BV)では、乳酸桿菌が少なくなり、ガードネレラ膣やプレボテラビビアなどの多様な嫌気性細菌が豊富に増えています5,6。BVの女性は、性感染症7,8,9、不妊症10、妊娠喪失11、早産12,13,14、子宮内感染症15、子宮頸部感染症16、がん16,17,18のリスクが高い。.BVはまた、羊水感染症からの一般的な分離株であるフソバクテリウム核1、19、20などの潜在的に病原性細菌による膣コロニー形成のより高い可能性と関連している21。
人間の膣の健康における嫌気性細菌の重要性のために、これらの生物の生物学と病因を調査するために使用できる動物モデルが必要です。ここでは、エストロゲン化マウスにおける ガードネレラ 膣の膣接種と生存可能な回復の方法について説明し、 プレボテラビビア と フソバクテリウム核の追加戦略を提案します。マウス膣コロニー形成の他のモデルは以前に説明されていますが、これらは好気的に培養されたグループB 連鎖球菌22 や 淋菌23 などの通性嫌気性細菌の接種と回復に焦点を当てています。偏性嫌気性菌の接種と回収は、適切な実験戦略で成功裏に達成できます。いくつかの細菌分類群の実行可能な回復のためのアプローチについて議論し、関心のある追加の種/株の生存率の条件の経験的評価を提案します。
生きた細菌によるコロニー形成を推定する古典的な方法は、コロニー形成単位(CFU)の回収です。独自の内因性微生物叢を持つ従来の飼育マウスでは、接種された細菌株を増殖させながら、内因性膣内細菌叢のメンバーに対して選択する寒天培地での回復が必要です。ここでは、ストレプトマイシン含有寒天培地で選択的に回収できる G. vaginalis24 のストレプトマイシン耐性分離株を使用します。培地が十分に選択的であり、逆にストレプトマイシン耐性菌が内因性微生物叢に存在しないことを確認するために、接種直前に収集された膣洗浄剤を選択的(ストレプトマイシン含有)寒天培地に播種する必要があります。
接種材料調製のための最良の方法は、細菌の種および株によって異なり得る。マウスでの実験を開始する前に、培地の好ましい条件、成長エンドポイント、接種材料の調製、ならびにPBSの酸素に対する感受性と生存率を決定するための予備作業を実施する必要があります。より酸素感受性の細菌の場合、接種材料の代替調製を検討することができる(例えば、適切なビヒクル対照群を有する嫌気性培養培地中)25,26。

<table><tbody><tr><td>&beta;-エストラジオール17-吉草酸</td><td>Sigma</td><td>E1631</td>マウスの<td>エストロゲン化</td></tr><tr><td>0.22 &micro;m、50 mL Steriflip真空フィルター</td><td>フィッシャー</td><td>&nbsp;SCGP00525</td><td>滅菌ろ過ゴマ油</td></tr><tr><td>14mLチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352059</td><td>マウスのエストロゲン化</td></tr><tr><td>190プルーフエタノール</td><td>Koptec</td><td>&nbsp;V1105M</td><td>解剖、組織均質化、CDCおよびコロンビア培地</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>フィッシャー</td><td>MT21040CM</td><td>膣洗浄、G. vaginlalis 接種準備、組織収集および均質化</td></tr><tr><td>25 G &times; 5/8-in needle</td><td>BD</td><td>305122</td><td>マウスのエストロゲン化</td></tr><tr><td>5 mL チューブ</td><td>ファルコン</td><td>352063</td><td>組織収集と均質化</td></tr><tr><td>嫌気性チャンバー</td><td>Coy</td><td>7200000</td><td>嫌気性細菌の増殖</td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>フィッシャー</td><td>DF0140074</td><td>G. vaginalis, F. nucleatum, P. bivia 寒天プレート</td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>フィッシャー</td><td>DF0118170</td><td>CDC P. bivia 成長用嫌気性培地</td></tr><tr><td>コロンビアブロス</td><td>フィッシャー</td><td>DF0944170</td><td>コロンビア培地 F. nucleatum成長用</td></tr><tr><td>除細動羊の血液</td><td>Hemostat</td><td>DSB500</td><td>CDC嫌気性培地P.bivia成長</td></tr><tr><td>鉗子</td>ファイン<td>サイエンスツール</td><td>&nbsp;11008-13</td><td>マウス/組織解剖</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td>G7528</td><td>NYCIII 培地 G. vaginalis 増殖用</td></tr><tr><td>ハンドヘルドホモジナイザー</td><td>ISC Bio</td><td>3305500</td><td>組織均質化</td></tr><tr><td>ヘミン</td><td>シグマ</td><td>51280</td><td>CDC 嫌気性培地 P. bivia 増殖用、コロンビア培地 F. nucleatum 増殖用</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td>NYCIII 培地 G. vaginalis 用成長</td></tr><tr><td>馬血清</td><td>Hemostat</td><td>SHS500</td><td>NYCIII 培地 G. vaginalis 成長用</td></tr><tr><td>水素ガス混合物 (5% 水素、10% CO2、85% 窒素)</td> <td>嫌気性チャンバー用</td><td>マセソン</td><td></td>ガス</tr><tr><td>イソフルオラン</td><td>VetOne</td><td>502017</td><td>マウスの麻酔薬</td></tr><tr><td>犠牲 L-システイン</td><td>Sigma</td><td>C1276</td><td>CDC P. bivia 成長用嫌気性培地</td></tr><tr><td>L-グルタミン酸</td><td>Sigma</td><td>G1626</td><td>CDC 嫌気性培地 P. bivia 増殖用</td></tr><tr><td>Milli-Q 浄水器</td><td>Millipore</td><td>IQ-7000</td><td>培地製造と均質化用</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>NYCIII 培地 G. vaginalis 増殖用</td></tr><tr><td>NaOH 錠剤</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>CDC 嫌気性培地 P. bivia 増殖用</td></tr><tr><td>窒素ガス</td><td>&nbsp;エアガス</td><td></td><td>&nbsp;嫌気性チャンバー用ガス</td></tr><tr><td>p-200 フィルターチップ</td><td>ISC Bio</td><td>&nbsp;P-1237-200</td><td>膣洗浄および細菌接種</td></tr><tr><td>カゼインの膵臓消化</td>物 <td>Sigma</td><td>70169</td><td>CDC P. bivia growth</td></tr><tr><td>プロテオース・ペプトン用培地 #3</td><td>Fisher</td><td>DF-122-17-4</td><td>G. vaginalis growth のための NYCIII 培地</td></tr> は<tr><td>さみ</td><td>Fine Science Tools</td><td>&nbsp;14084-08</td><td>マウス/組織解剖</td></tr><tr><td>ゴマ油</td><td>フィッシャー</td><td>&nbsp;</td><td>マウスのICN15662191エストロゲン化</td></tr><tr><td>シングルエッジ外科用炭素鋼カミソリブレードVWR</td><td></td><td>55411-050</td><td>組織解剖</td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td>シ<td>グマS3014</td><td></td><td>CDC嫌気性培地P.ビビア成長</td></tr><tr><td>用分光光度計</td><td>BioChrom</td><td>80-3000-45</td>細菌<td>OD600</td></tr><tr><td>ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>11860038</td><td>寒天培地に追加して作る選択プレート</td></tr><tr><td>ツベルクリン スリップチップ 1mlシリンジ</td><td>BD</td><td>309659</td><td>マウスのエストロゲン化</td></tr><tr><td>Vitaim K3</td><td>Sigma</td><td>M5625</td><td>コロンビア培地 F. nucleatum成長</td></tr><tr><td>ビタミンK1</td><td>Sigma</td><td>95271</td><td>CDC 嫌気性培地 P. bivia成長</td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>フィ</td><td>ッシャーDF0127-17-9</td><td>NYCIII培地 G. vaginalis成長用</td></tr></tbody></table>

嫌気性増殖細菌によるマウス膣コロニー形成モデル

Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria

哺乳類の膣は、多くの細菌分類群によってコロニーを形成することができます。ヒトの膣内微生物叢は、多くの場合、 ラクトバチルス 種によって支配されていますが、女性の4人に1人は、低レベルの乳酸菌が多様な嫌気性細菌の異常増殖を伴う細菌性膣炎を経験しています。この状態は、生殖および性的健康へのリスクを含む多くの健康上の合併症と関連しています。ヒトの膣の健康における微生物相互作用の複雑な性質を示す証拠が増えていますが、これらの異なる嫌気性細菌の個々の役割は完全には理解されていません。これは、嫌気性的に増殖した膣内細菌を研究するための適切なモデルの欠如によって複雑になります。マウスモデルにより、これらの生物の生体内および病原性を調べる ことができます。膣内細菌接種の他のマウスモデルが以前に記載されている。ここでは、従来飼育したC57Bl/6マウスにおける嫌気性増殖菌の接種方法とその生残回収方法について述べる。膣の接種と洗浄のための新しい、ストレスの少ない手続き方法も説明されています。 ガードネレラ の接種と生存可能な回復について詳細に概説し、 プレボテラビビア や フソバクテリウム核 などの追加の嫌気性菌の戦略について説明します。

実験例の概略図は、説明されているプロトコルを実行する方法のいくつかを示しています(図1)。
一部の動物は、非選択培地上で成長する膣内微生物叢に内因性微生物を運びます。ここに記載されている方法は、内因性細菌に対して選択するために、ストレプトマイシンを含む選択培地とともに、研究対象の細菌株のストレプトマイシン耐性分離株に依存しています(図2A、B)。ストレプトマイシン耐性は自然に発症する可能性があるため、感染前(0日目の洗浄)にマウスをチェックすると、これが問題である可能性があるかどうかを確認するのに役立ちます。
膣洗浄液からの生菌の回収は、寒天培地での段階希釈とメッキによって達成されます。標準的なペトリ皿は、5 μLスポットの最大6 x 6アレイを保持できるため、10倍の段階希釈を使用すると、各サンプルの6桁にわたる6つのレプリカスポットからの細菌力価を列挙できます(図3A)。この方法は、ガードネレラからプレボテラおよびフソバクテリウムまでの細菌の力価を列挙するために使用できます(図3B-D)。
一緒に、これらの方法は、仮説をテストし、女性の生殖管の細菌のコロニー形成/感染についての解釈をすることを可能にします。例えば、膣洗浄液および膣組織ホモジネート中のガードネレラ力価の比較は、これらの方法間の一致を示した(図4A)。同様に、膣同時接種モデルでは、子宮組織中のプレボテラの力価は、プレボテラ単感染と比較してガードネレラ同時感染中に有意に高かった(約20倍)(図4B)。最後に、これらのモデルで野生型細菌株と変異菌株を比較して、生殖管のコロニー形成/感染の過程で特定の遺伝子とその産物が果たす役割を確立することができます。例えば、炭水化物シアル酸を輸送および消費する能力を欠くフソバクテリウムの変異株は、接種後3日までにコロニー形成のレベルを低下させた(図4C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig01.jpg"> 図1:実験例の概略図 33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig02.jpg"> 図2:選択的寒天培地と非選択的寒天培地での内因性マウス膣微生物の増殖。 5匹の雌C57Bl/6マウス(1-5)の膣洗浄液を2つの異なるNYC III寒天プレートにストリークし、嫌気的にインキュベートした。(A)左側のプレートには抗生物質が含まれておらず、マウス膣管からの内因性嫌気性細菌の増殖を可能にします。(B)右側のプレートには1 mg/mLのストレプトマイシンが含まれており、内因性細菌の増殖に対して選択します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig03.jpg"> 図3:膣洗浄からの生存可能なG.膣、P.ビビア、およびF.核CFUの回復。 (A)G.膣JCP8151B-SmR接種源のCFU、NYC III寒天培地に希釈系列としてレプリカメッキ。(B-D)単感染動物の膣洗浄からの生存可能な(B)G.膣24、(C)P.ビビア25、および(D)F.核26の回収。各グラフ(B−D)について、2つの独立した実験からのデータを、実験当たり10〜15匹のマウスで組み合わせる24、25、26。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig04v2.jpg"> 図4:マウス膣接種モデルにおける嫌気性細菌コロニー形成のさらなる分析。 (A)膣洗浄液中のG.膣力価は、接種後24時間および72時間で膣組織ホモジネートから回収されたG.膣力価と相関する(2つの独立した実験の組み合わせ、それぞれn=10。スピアマンの順位相関検定によって決定される有意性)24。(B)G.膣との同時感染は、接種後48時間でP.ビビアモノ感染動物と比較した場合、子宮角組織におけるP.ビビア力価の増加をもたらす(2つの独立した実験の組み合わせ、それぞれグループあたり6〜10匹のマウス。 有意性はマン・ホイットニーU検定によって決定され、**p = 0.0017)25。(C)シアル酸トランスポーター(Ω SiaT)を破壊したF. nucleatum変異体は、接種後72時間で野生型のF. nucleatumと比較して、単感染マウスの膣洗浄における力価が低下した(2つの独立した実験の組み合わせ、それぞれ1群あたり10匹のマウスを用いた)。有意性はマン・ホイットニーU検定、**p &lt; 0.01)26によって決定されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig04largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:嫌気条件下で増殖するさまざまな膣細菌に使用される方法の例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032_SupplementalFile.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、嫌気的に培養されたヒト膣細菌による膣コロニー形成のマウスモデルを提示します。ガード ネレラ膣に焦点を当て、 プレボテラビビア と フソバクテリウム核の提案を含めます。このプロトコルは、膣接種および他の嫌気性増殖細菌の生存可能な回復のためのガイドとしても使用できます。

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four ...

この方法は、研究者が女性の生殖管に生息し、感染症を引き起こす嫌気性細菌の生物学と病態生理学を研究するのに役立ちます。マウス膣接種の以前のモデルは、好気性条件下で増殖および回収された細菌に焦点を当てていました。私たちの方法は、酸素曝露を最小限に抑えるための追加の戦略を必要とする義務的な嫌気性細菌の接種と回収を指示します。それらがどれほど潔癖であるかに応じて、このモデルで使用される新しい細菌株は、特定のステップの変更を必要とする場合があります。原稿の表1に潜在的な変更の提案を提供しました。まず、嫌気性チャンバー内の800マイクロリットルの新鮮な培地を入れた1.5ミリリットルのキュベットに、200マイクロリットルの16時間前の細菌培養物を加えます。その後、分光光度計で600ナノメートルで希釈した培養物の光学濃度(OD)を測定し、ブランクとして培地のみを有する別のキュベットを用いた。培養物の実際のOD値を取得するには、分光光度計の読み取り値に5を掛けてから、実験に必要な接種材料の体積を決定し、必要な接種材料密度を達成するために必要な細菌培養物の量を計算します。次に、必要量の細菌培養物を滅菌マイクロ遠心チューブにピペットで入れ、16, 000倍Gで1〜3分間遠心分離します。上清を除去した後、ペレットを嫌気性PBSに再懸濁して、前に計算された必要量の接種材料を達成します。調製した接種材料中の細菌コロニー形成単位の数を決定するには、まず、10マイクロリットルの細菌懸濁液を使用してPBSでいくつかの段階希釈を行い、マルチチャンネルピペットを使用して寒天プレート上のプレート接種材料希釈物を見つけます。同時に、70マイクロリットルの滅菌嫌気性PBSをマウス番号でラベル付けされた1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにピペッティングすることにより、嫌気室で膣洗浄チューブを準備します。チューブをしっかりと閉じて、チャンバーから取り出します。膣洗浄を行うには、まず、前足でつかむことができるケージの上にマウスを置きます。次に、尾の中央部分をそっとつかみ、後肢がわずかに上昇して膣口が露出するように持ち上げます。ラベルの付いた洗浄チューブから50マイクロリットルのPBSを引き出した後、ピペットチップを膣内腔に2〜3ミリメートル静かに挿入し、3〜4回ピペッティングしてPBSで洗浄します。次に、残りの20マイクロリットルの未使用のPBSとともに、洗浄材料を元の洗浄チューブに戻します。この膣洗浄の直後に、20マイクロリットルの細菌懸濁液またはビヒクルコントロールを経膣移すことによって各マウスに接種する。2つの異なる細菌株の同時接種実験では、事前に菌株を混合するのではなく、各細菌懸濁液10マイクロリットルを別々に接種します。投与された量が膣のイントロイトにすぐに蓄積するのを防ぐために、マウスの後部を10〜20秒間保持し続けます。.接種したマウスを新しいケージまたはすでに接種したケージメイトに移し、他のマウスで手順を繰り返します。全てのマウスに接種した後、接種材料の段階希釈液を嫌気性チャンバーにプレーティングすることにより接種後コロニー形成単位を得る。マウスの臓器を採取するには、膣および子宮頸部用の各チューブに1ミリリットルの滅菌嫌気性PBSを加えて、嫌気室に5ミリリットルの臓器採取チューブを準備します。子宮角用にマークされたチューブに750ミリリットルのPBSを追加します。犠牲で最終的な洗浄を収集するために、前に示したように膣洗浄チューブの別のセットを準備します。また、解剖器具のすすぎや滅菌には、50ミリリットルの脱イオン水ビーカーと70〜90%エタノールの50ミリリットルのビーカーを用意してください。マウスを屠殺する直前または直後に、前に示したように最終洗浄を行う。犠牲後、マウスの腹部と背中に70%エタノールをスプレーします。次に、エタノール滅菌および乾燥したハサミを使用して、マウスの腹腔を垂直方向の切り傷で開きます。次に、鉗子を使用して皮膚を引き戻します。生殖管を露出させるには、腸を体腔からオープンフィールドの側面にそっと押し出し、マウスから膀胱を取り外して生殖管の下部にアクセスします。その後、膣を切らずにハサミで恥骨の中心をクリップします。次に、2セットの鉗子を使用して骨盤の両側をつかみ、骨盤を横方向に開いて、下の膣の下部を露出させます。鉗子で子宮頸部をそっとつかみ、引き上げて結腸を露出させます。その後、小さなハサミを使って膣を外部結合組織から解放します。腸管を穿刺せずに結腸から膣を慎重に解放します。膣が結腸から完全に解放されたら、ハサミを使用してイントロイトで膣の側面を移動し、次に切り取ってマウスの体から取り除きます。子宮頸部を優しく握ったまま引き上げて子宮角を目立たせ、左右の卵巣の真下を切って子宮角を解放します。次に、マウスの体から生殖管を取り外し、滅菌ペトリ皿に入れます。次に、かみそりの刃を使用して、子宮角、子宮頸部、および膣を分離します。各組織をそれぞれのラベル付き収集チューブに入れます。臓器を均質化するには、バイオセーフティキャビネットにハンドヘルドホモジナイザーを用意します。まず、各臓器をホモジナイズした後、ホモジナイザーブレードを洗浄するために、それぞれ脱イオン水、70%エタノール、およびPBSを入れた50ミリリットルチューブ3本のセットを準備します。ホモジナイザーを清掃するには、ブレードを水管に浸し、約3秒間フルスピードでマシンの電源を入れます。次に、ペーパータオルでブレードを振って余分な水分を取り除きます。ブレードを70%エタノールとPBSで連続してすすぎます。最初のすすぎの後、ホモジナイザープローブを臓器の入ったチューブの底まで下げて、下の組織をトラップします。次に、ホモジナイザーの電源を入れて組織を粉砕し、プローブを水没させたまま約5回ゆっくりと上下に動かします。ホモジナイザーの電源を切って取り外し、組織が完全に破壊されていることを視覚的に確認します。均質化後、サンプルを嫌気性チャンバーに戻し、CFU回収のために段階希釈を行います。このプロトコルに従って、生菌の回収と膣洗浄からのコロニー形成ユニットの列挙は、細菌株、ガードネレラ膣、プレボテラビビア、およびフソバクテリウムヌクレアタムに対して正常に行うことができます。さらに、膣洗浄から得られたガードネレラ膣コロニー形成単位の数は、膣組織ホモジネートから回収されたものと相関した。また、この方法では、ガードネレラ膣との同時感染時とプレボテラ単感染時のプレボテラ・ビビア力価とマウス子宮組織が有意に高かった。さらに、この方法は、変異型フソバクテリウム核株の膣持続性を、接種後24時間および72時間における野生型のそれと比較することに成功しました。膣内細菌接種に対する免疫応答を調べるために、サイトカインアッセイを組織ホモジネートで実行できます。あるいは、炎症の兆候を評価するための組織学的検査のために組織を保存することもできます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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嫌気性増殖細菌によるマウス膣コロニー形成モデル

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