Name: 生理学的条件下でのα-シヌクレイン構造ダイナミクスの研究のためのミリ秒水素/重水素交換質量分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学ぼう、ミリ秒水素/重水素交換質量分析法を用いて生理学的条件下でα-シヌクレインの構造ダイナミクスを解析する方法。この技術は本質的に無秩序なタンパク質のコンホメーション変化をリアルタイムで評価し、神経変性疾患のメカニズム解明に貢献します。

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NSは、大学評議会ダイヤモンドジュビリー奨学金によって資金提供されています。JJPはUKRIフューチャー・リーダーズ・フェローシップ[助成金番号:MR/T02223X/1]の支援を受けています。

1. aSynのタンパク質発現と精製
<ol><li>以前に公開されたレポートに従ってaSynを準備します 9.</li>
	<li>安全な貯蔵緩衝液(例えば、トリス、pH7.2)に透析する。</li>
	<li>必要に応じて、サンプルを濃縮します(例えば、スピンフィルター微量遠心チューブは、3kDaMWCO、14,000 x g を約10〜30分間使用し、 材料表を参照)。 注:過度に集中しないことをお勧めします。モノマーアンサンブルの完全性は、25μMを超えて検証されていない。</li>
	<li>アリコートと-80°Cでの保存 注:aSynモノマータンパク質は、これらの保存条件下で最大1年間安定です。</li>
</ol>2. HDXバッファーの準備
メモ:Trisは温度係数が高いため、HDX反応が行われる温度(このプロトコルでは20°C)に合わせてpH測定を調整する必要があります。
<ol><li>100mLのLC-MSグレードの水に0.002モルのトリスを秤量して、状態Aおよび状態Bの平衡緩衝液を調製する。状態Bの場合、29.8mgのKCl、14.2mgのMgCl2、36.8gのCaCl2、および836mgのNaClをトリス緩衝液に加える。pHを7.40±0.05に調整します。 注: 平衡バッファーには、aSyn を研究対象とする条件が含まれている必要があります。この場合、pH 7.4 +/−塩で20 mMトリスである。</li>
	<li>100 mLの重水素化水に0.002 molのTrisを計量して、状態Aおよび状態Bの標識バッファーを調製する。状態Bの場合、29.8mgのKCl、14.2mgのMgCl2、36.8gのCaCl2、および836mgのNaClをTris標識バッファーに加える。標識緩衝液のpDは、平衡緩衝液のpHに対応する。pH = pD - 0.41なので、pHメーターが6.99 ± 0.0523,24と表示されるように調整してください。 注: 標識バッファーは、重水素化水を使用して調製される点を除いて、平衡バッファーと同じ成分を持つ必要があります。</li>
	<li>0.010 mol のトリスと 0.050 mol の尿素を秤量して急冷バッファーを調製し、LC-MS グレードの水で最大 100 mL にします。0.5°CでpHを2.50±0.05に調整する。 メモ:目的のタンパク質に最適なクエンチバッファーを特定するには、HDX実験の前にクエンチバッファースクリーンを実行する必要があります。変性剤(尿素および塩酸グアニジニウムなど)および還元剤(例えば、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン)の異なる濃度および組み合わせを、トラップ体積および温度などの物理的パラメータとともにスクリーニングし、クエンチされたタンパク質を効果的に展開および消化する。pH 2.50で100 mM Trisおよび0.5 M尿素を含むクエンチバッファーが本研究に最適である。</li>
	<li>デュランガラス瓶に0.125 molの塩酸グアニジニウムを秤量して消化カラム洗浄バッファーを調製する。25 mLのメタノールと250 μLのギ酸を加える。LC-MSグレードの水で最大250mLを作ります。 注: Enzymate BEH ペプシンカラム( 材料表を参照)には、0.5 M 塩酸グアニジニウム、10% (v/v) メタノール、および 0.1% (v/v) ギ酸のカラム洗浄バッファーを使用します。</li>
	<li>0.5 μLのギ酸を249.5 mLのLC-MSグレードの水にピペッティングして、シリンジ弱洗浄を調製する。</li>
	<li>等量のLC-MSグレードの水、メタノール、アセトニトリル、およびイソプロパノールを混合してシリンジ強洗浄液を調製する。ギ酸を最終的な2%(v / v)濃度に加える。 注:さまざまなバッファーとタンパク質の間の交差汚染を防ぎ、注入ポートの洗浄を可能にするには、シリンジ洗浄溶液を調製し、バルブ(しばしば「洗浄ライナー」と呼ばれる)への流路が液体で完全にプライミングされていることが重要です。ギ酸は、シリンジ弱洗浄のためにオプションである。</li>
</ol>3. ペプチドマッピング手順
<ol><li>以下の工程に従ってサンプルを調製する。<ol>
<li>0.22 μmシリンジフィルターで-80°Cの冷凍庫から解凍したaSynタンパク質ストックをフィルターでろ過します。濾過したストックタンパク質の吸光度を280nmで測定し、ビール・ランバートの法則により濃度を求めた。平衡緩衝液中でタンパク質を5μMの濃度に希釈する(ステップ2.1。 注: ビール・ランバートの法則: A = εcl、ここで A は吸光度、ε は測定された波長 (ここでは 280 nm) におけるタンパク質の吸光係数を単位 M-1 cm-1、c は M 単位のタンパク質濃度、l はパス長 (cm) です。 野生型 aSyn26 の場合、ε = 5960 M−1 cm−1 である。</li>
	</ol></li>
	<li>液体クロマトグラフィー法を設定します。<ol>
<li>7000-9000psiの圧力で3分間のローディング/トラップ時間で入口ファイルを作成し、続いて7分間で5%アセトニトリルから40%アセトニトリルへの勾配、続いて5%-95%アセトニトリル - 水の洗浄ステップを10分間繰り返します。</li>
		<li>ロックスプレー(例えば、ロイシンエンケファリン、 材料表を参照)が2000psiで流れ、質量分析計のソースロックスプレープローブに接続されていることを確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>質量分析 MSE メソッドを設定します。 メモ:MSE は、前駆体の質量絶縁のない広帯域のデータに依存しない集録方法です。したがって、選択されたm/z範囲内のすべてのイオンは、衝突誘起解離(CID)27を使用してさらに断片化される。<ol>
<li>MSメソッドファイルで、 MSE Continuum を選択し、2~10分、エレクトロスプレーソース、および正分解能モードの間で集録時間を設定します。50~2000Daを超えるMSE を集録し、0.3秒ごとにスキャンします。</li>
		<li>機能1(低エネルギー)の場合、トラップと転送衝突エネルギーを4Vに設定します。関数2(高エネルギー)の場合、マッピングエネルギーレベルごとに、ランプ転送衝突エネルギーを4Vで一定に設定し、トラップ衝突エネルギーを 表1 に示すように設定します。 注:イオンモビリティMSE 法も使用できます。代替マッピング方法(例えば、データ依存集録またはDDA)は、ユーザの裁量で使用することができる。</li>
	</ol></li>
	<li>オートサンプラーロボットを設定します( 材料表を参照)。<ol>
<li>50 μLの5 μMタンパク質を総回収バイアルに加える。バイアルをHDXの右チャンバー内のサンプル位置に置きます。このチャンバーが0.5°Cであることを確認してください。</li>
		<li>平衡バッファーの試薬バイアルを 1 つ、標識バッファーの試薬バイアルを 2 つ、HDX 左チャンバー内の試薬位置 1、2、および 3 に追加します。ペルチェ温度コントローラを設定して、このチャンバが20°Cであることを確認します( 材料表を参照)。クエンチバッファーの試薬バイアルを1つの試薬バイアルをHDX右チャンバー内の試薬位置1つに加える。</li>
		<li>HDX左チャンバーの反応位置に8つの合計回収バイアルを追加し、HDX右チャンバーの反応位置に最大8つの最大回収バイアルを追加します。 注:完全な洗浄と分注量の再現性を最大限に高めるために、オートサンプラーシリンジでシリンジ洗浄とプライム洗浄を実行することをお勧めします。たとえば、マッピング実験を開始する前に、(1) 弱洗浄、(2) 強洗浄、(3) 弱洗浄のシーケンスを実行します。このシーケンスは広範囲に繰り返すことができ、最大20倍まで、またはシリンジが完全に濡れるまで行うことをお勧めします。</li>
		<li>スケジューリングソフトウェアで適切なLCおよびMSメソッドを使用してサンプルリストを設定し、スケジュールを開始します。 注:本研究では、Chronosがスケジューリングソフトウェアとして使用されています( 資料表を参照)。</li>
	</ol></li>
	<li>マッピング・データを処理します。<ol>
<li>適切なソフトウェアを使用してマッピング実験ファイルからペプチドを同定する( 材料表を参照)。</li>
		<li>最小強度 = 5000、最小配列長 = 0、最大配列長 = 40、最小産物 = 1、アミノ酸あたりの最小産物 = 0.25、最小連続産物 = 2、産物の最小合計強度 = 0、最小スコア = 0、および最大 MH+ 誤差 (ppm) = 0 を使用して、ペプチド同定データを DynamX ( 材料表を参照) にインポートします。 注:あるいは、推奨ワークフロー28に従って最適化された設定を導出する。</li>
		<li>メニューから [データ ]を選択し、[ PLGS結果のインポート]をクリックします。 [追加] をクリックして、スペクトル割り当てに関連するデータファイルを選択します。すべて追加されたら、[ 次へ ]をクリックし、上記のフィルタ設定を入力します。次に、[ 完了]をクリックします。</li>
		<li>同位体割り当てを手動でキュレーションして、DynamX の aSyn の最終的なペプチドカバレッジマップを取得します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. ミリ秒水素・重水素交換研究
<ol><li>HDXの実験を開始する前に、FastHDXプロトタイプ機器( 材料表を参照)をクリーニングしてください。<ol>
<li>互換性のあるHDXソフトウェアのGUIを開き、システムを初期化します。</li>
		<li>サンプルチャンバーの温度を20°C、クエンチャンバーを0.5°Cと入力します。[設定]をクリックして、新しい温度を適用します。</li>
		<li>遠心分離管をすべての入口にLC-MSグレードの水でセットアップします。</li>
		<li>滴定装置配管の配送タブで、左右のシリンジの両方を確認し、[プライム]をクリックしてチューブ内の潜在的な気泡を取り除きます。すべてのバブルがなくなるまで繰り返します。</li>
		<li>[マクロ]タブで、シリンジのすべてのチェックボックスをオンにします。[シリンジのホームポジションを校正]をクリックします。「洗浄シリンジロードループ」をクリックします。「すべてのミキシングループボリュームを洗浄」をクリックします。</li>
		<li>手順 4.1.5 を繰り返します。1倍以上。</li>
		<li>バッファーシリンジに気泡が現れた場合は、シリンジを取り外し、気泡を垂直に噴出させて脱気します。シリンジを交換し、ゼロ位置まで再較正します。</li>
	</ol></li>
	<li>HDX実験用のFastHDXプロトタイプ機器をセットアップします。<ol>
<li>ろ過した5 μM aSynを合計回収バイアルに500 uL加え、卓上冷蔵庫の中に入れて、温度誘発性のオリゴマー化と凝集を防ぎます。</li>
		<li>50 mL の平衡バッファー、標識バッファー、およびクエンチバッファーを各バッファーに加えます (2.HDX緩衝液調製工程1〜3)入口を左右のチャンバー内に配置。</li>
		<li>50 mL のカラム洗浄バッファー (2.HDX緩衝液調製工程4)をペプシン洗浄入口に行う。</li>
		<li>タンパク質とカラムの洗浄ラインを1xにプライミングするには、 滴定装置配管デリバリー タブで左右両方のシリンジを確認し、 プライムを1回クリックします。 注:その後Primeをクリックすると、プライムプロセスがさらに繰り返され、大量のタンパク質サンプルが消費されます。ボタンのクリックが試みられた後にソフトウェアに遅延がある場合でも、これを避けるように注意することをお勧めします。</li>
		<li>手順 4.1.5 を繰り返します。1x。</li>
		<li>「手動クエンチ・フロー」タブで、ステップ 4.2.7.-4.2.10 で説明されている必要な設定を入力します。</li>
		<li>時間経過実験の場合は、[ 記号ドット] ボタンを使用してミリ秒単位で時刻を入力します。反復が必要な場合は、同じ時点を複数回追加します(たとえば、50ミリ秒の3連の場合、50 50 50を入力する必要があります)。質量分析計ソフトウェアのサンプルリスト(MassLynxはここで使用されています、 材料の表を参照)は、これらの時点を正確に一致させる必要があります。 メモ: 質量分析計のサンプルリストファイル名および/またはサンプルテキストを使用して、FastHDXソフトウェアGUIに入力された時間に対応するHDXラベリング時間を永続的に記録する必要があります。各サンプル実行のラベル付け時間は、他の場所には保存されません。</li>
		<li>トラップ時間(分)をトラップ時間の長さに設定します。ここでは、3.00です。</li>
		<li>HPLC の待機 (分) = (トラップ時間 + 実行時間 + 1.5 分) を設定します。 注: たとえば、トラップが 3 分、グラデーションが 17 分の実験の場合、これは 21.50 分になります。</li>
		<li>[ 空白の実行] ボックスは、サンプルの実行と実行の間に空白の実験を実行する場合にのみクリックします。「はい」の場合は、各サンプル実行後にブランク実行の項目 (つまり、サンプル・リストの有効な行) をソフトウェアに入力してください。</li>
		<li>ソフトウェアでサンプルリストの準備ができたら、適切なエントリを強調表示し、ソフトウェアの 再生 ボタンと FastHDX をクリックしてソフトウェアで実行を開始します。 注:水素/重水素スクランブルにより、MSのみの方法またはソフトフラグメンテーション技術(電子移動解離、電子捕捉解離、および紫外線光解離)は29しか使用できません。生理学的pHが7.40のaSynの場合、50ミリ秒から300秒の範囲のタイムポイントが最も適用可能であり、これらは重水素取り込み曲線8全体をカバーする。</li>
	</ol></li>
</ol>5. データ処理
<ol><li>ペプチドマッピング実験からスペクトル的に割り当てられたペプチドのファイルをロードします。 [ファイル ]メニューを開き、DynamXソフトウェアで [開く ]をクリックします( 材料表を参照)。</li>
	<li>生ファイルを好みの質量測定ソフトウェア(DynamX、HDExaminerなど)にインポートします。[データ]メニューを開き、[ MSファイル]をクリックします。 [新しい 状態]をクリックして、研究した各タンパク質状態の状態を作成します。<ol>
<li>[ 新しい露出] をクリックして、各HDXタイムポイントを追加します。[ 新しいRAW ]をクリックして、.rawファイルをインポートします。各.rawファイルを正しい位置にドラッグします。完了したら[ OK ]をクリックします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>最初に同位体を自動的に割り当て(これは上記の手順5.2に続く自動です)、次に同位体割り当てを手動でキュレーションして、高いデータ品質を確保します。</li>
	<li>クラスター・データを、タンパク質名、配列開始番号、配列終了番号、配列、修飾、フラグメント、最大取り込み可能、モノアイソトピック種の質量、状態名、暴露時間、ファイル名、電荷、保持時間、強度、重心の順の列を含む.csvファイルにエクスポートします。</li>
	<li>質量測定ソフトウェアの [データ ]メニューを開き、[ クラスタデータのエクスポート]をクリックします。</li>
</ol>6. データ解析
<ol><li>エクスポートしたクラスターデータを優先HDX分析ソフトウェアにロードします。ここでは、HDfleXは30 個使用されている( 材料表を参照)。</li>
	<li>すべてのペプチドと状態の実験データを適合させ、適切な逆交換補正法を選択して、HDX反応の観測速度定数を取得します。</li>
	<li>推奨される方法(HDfleXはこれに対するいくつかのオプションをサポートしています)によってグローバル有意性しきい値を計算し、ハイブリッド有意性検定を実行して、31,32と比較した州間の有意差を決定します。 注: 観測された差がグローバルしきい値より大きく、p値が選択した信頼水準(95%など)より小さい場合、差は有意であると見なされます。</li>
</ol>

著者らは、競合する利益を宣言していない。

本稿では、(1)単量体aSynのペプチドマッピング実験を実行して最高の配列カバレッジを得ること、(2)生理学的条件下で単量体aSynに関するミリ秒間のHDX-MSデータを取得すること、および(3)得られたHDX-MSデータのデータ分析および解釈を実行する手順について説明します。提供される手順は一般的に実行が簡単で、各ラベリング実験は通常、3回の反復と8つのタイムポイントに対して約8時間しか続かず、マッピング実験は約2時間しか続きません。ここで使用されている完全に自動化されたインストルメンテーションを使用すると、完全なデータセットを1日で取得できます。ただし、サンプルの取り扱いやバッファーの調製時には、測定値が目的の状態で弱く安定なタンパク質(またはタンパク質領域)に由来するように注意する必要があります。重要なことに、以前の研究は、凍結および凍結乾燥などの異なる貯蔵条件が異なるaSynモノマーコンフォーマーをもたらし、aSynモノマー立体配座アンサンブル10に対するサンプル処理の潜在的な影響を特徴付けることが重要であることを示した。実際、HDX-MSは、このような立体構造摂動の高感度尺度であ...

パーキンソン病(PD)は、世界中の何百万人もの人々が罹患している神経変性疾患です1。これは、脳の黒質パースコンパクタ領域におけるレビー小体およびレビー神経突起として知られている細胞質封入物の形成によって特徴付けられる。これらの細胞質封入体は、本質的に障害のあるタンパク質aSyn2の凝集体を含有することが見出されている。PDおよび他のシヌクレイノパシーにおいて、aSynは可溶性障害状態から不溶性で高度に構造化された罹患状態に変化する。その天然形態において、単量体aSynは、そのN末端およびC末端間の長距離静電相互作用およびそのC末端および非アミロイドベータ成分(NAC)領域との間の疎水性相互作用によって安定化される広範囲の立体構造を採用する3,4,5,6。突然変異、翻訳後修飾、および局所環境の変化など、それらの安定化相互作用の中断は、モノマーのミスフォールディングにつながり、したがって凝集のプロセスを引き起こす可能性がある7。
aSyn 8,9,10,11のオリゴマー型およびフィブリル型に関する膨大な量の研究が存在するが、タンパク質のモノマー型を研究し、どのコンフォーマーが機能的であり(そしてどのように)、どのコンフォーマーが凝集しやすいかをよりよく理解することが極めて重要である8,9,10,11.本質的に無秩序であり、サイズがわずか14kDaであり、結晶化が困難なaSynモノマーは、ほとんどの構造生物学的技術に順応性がない。しかし、単量体aSynの立体構造ダイナミクスを測定できる技術の1つはミリ秒HDX-MSであり、これは最近、そうでなければ得ることが困難または不可能であろう重要な構造観察を生成している12,13,14。ミリ秒のHDX-MSは、アミド水素での同位体交換を監視することによってタンパク質立体構造アンサンブルの平均を敏感に測定し、ミリ秒の時間スケールでの特定のタンパク質領域の溶媒アクセス性と水素結合ネットワークの関与を示します。HDX-MSのミリ秒の側面を強調する必要があるのは、そのネイティブに展開された準安定な性質のために、aSynは従来のHDX-MSシステムの下限をはるかに下回る非常に高速な水素交換動力学を示すためです。例えば、aSyn分子の大部分は、細胞内条件下で1秒未満で水素を重水素と完全に交換した。現在、いくつかの研究所が高速混合計装を構築しています。この場合、デッドタイム50ms、時間分解能1msのHDX-MSを実行できる高速混合クエンチフロー装置のプロトタイプを使用します15。ミリ秒のHDX-MSは最近、aSynの研究において非常に重要になっていますが、本質的に障害のあるタンパク質/領域をより広く研究し、ループ/領域が弱くしか安定していない多数のタンパク質を研究する上で価値があります。例えば、ペプチド薬(例えば、インスリン;GLP-1/グルカゴン;チルゼパチド)およびペプチド融合タンパク質(例えば、HIV阻害剤FN3-L35-T1144)は、溶液相の構造および安定性情報が医薬品開発の決定に重要な入力となり得る主要な薬物フォーマットであり、それでも、ペプチド部分は、しばしば、HDX-MSによって秒単位のタイムスケール16、17、18、19、20で弱く安定で難治性である。.秒/分ドメインに標識を有する創発的なHDX-MS法は、DNA G-四重鎖の構造情報を導出することが示されているが、ミリ秒のHDX-MS21の適用によって、これをより多様なオリゴヌクレオチド構造に拡張することが可能であるはずである。
HDX-MS実験は、(1)ボトムアップ(標識タンパク質がタンパク質分解的に消化される)、(2)ミドルダウン(標識タンパク質がタンパク質分解的に消化され、得られたペプチドがソフトフラグメンテーション技術によってさらにフラグメント化される)、および(3)トップダウン(ソフトフラグメンテーション技術によって標識タンパク質を直接フラグメント化する)の3つの異なるレベルで行うことができる22。.したがって、サブ分子HDX-MSデータにより、タンパク質の特定の領域に交換挙動を局在化することができ、そのような実験に適切な配列カバレッジを持つことが不可欠です。HDX-MS実験の構造分解能は、消化時またはソフトフラグメンテーション時にタンパク質に由来するタンパク質分解ペプチドまたはフラグメントの数にそれぞれ依存します。上記で概説した3つの実験タイプのそれぞれにおいて、各ペプチド/断片におけるアミド交換の変化は、タンパク質の一次構造にマッピングされ、タンパク質の局在領域の挙動を示す。最高の構造分解能はソフトフラグメンテーションによって達成されますが、これらの実験の説明は、aSynモノマー立体配座の測定に焦点を当てた現在の研究の範囲外です。ここで説明する一般的に適用される「ボトムアップ」ワークフローを使用すると、優れた結果を得ることができます。
ここでは、(1)aSynサンプルおよびHDX-MSバッファーを調製および処理する方法、(2)ボトムアップHDX-MS実験のためのペプチドマッピングを実行する方法、(3)生理学的条件下で、具体的にはミリ秒の時間領域で単量体aSynに関するHDX-MSデータを取得する方法(カスタムビルドの機器を使用して;ミリ秒標識のための代替機器も記載されている)、 (4)HDX-MSデータの処理方法と分析方法ここでは、2つの溶液条件下で生理学的pH(7.40)で単量体aSynを使用する方法が例示される。aSynの研究において極めて有用であるが、これらの手順は、任意のタンパク質に適用することができ、本質的に障害のあるタンパク質に限定されない。

<table><tbody><tr><td>1 &times; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &mu;m C18コラム&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>186002346</td><td>分析カラム</td></tr><tr><td>アセトニトリル HPLC グレード >99.9% HiPerSolv</td><td>VWR</td><td>20060.420</td><td>LC 移動相用</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>HDX バッファー用塩</td></tr><tr><td>Chronos</td><td>Axel Semrau (ウォーターズコーポレーションから購入)</td><td>667006090</td><td>複数のHDX-MSサンプル注入を自動的に行うスケジューリングソフトウェア。代替ソフトウェアは、HDXDirector または LEAP Shell</td></tr><tr><td>塩化重水素</td><td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td><td>DLM-2-50</td><td>HDX ラベリングバッファー用</td></tr><tr><td>酸化重水素 (99.9% D2O)</td><td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td><td>DLM-4</td><td>重水素化水</td></tr><tr><td>DynamX 3.0</td><td>Waters Corporation</td><td>176016027</td><td>同位体の割り当てと重水素取り込みの計算</td></tr><tr><td>Enzymate BEH ペプシンカラム</td><td>ウォーターズコーポレーション</td><td>186007233</td><td>ペプシン消化カラム</td></tr><tr><td>ギ酸、99.0% LC/MS グレード</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>10596814</td><td>LC移動相用</td></tr><tr><td>塩酸グアニジニウム</td> シ<td>グマ アルドリッチ</td><td>RDD001-500G</td><td>ハウトロープ/変性剤</td></tr><tr><td>HDfleX</td><td>エクセター大学</td><td>N/A</td><td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td></tr><tr><td>KCl Sigma</td><td>Aldrich</td><td>P3911</td><td>HDXバッファー用塩</td></tr><tr><td>LEAP HDX-2 CTC PALサンプリングロボット</td><td>ウォーターズコーポレーション</td><td>725000637</td><td>オートサンプラーロボット</td></tr><tr><td>ロイシン エンケファリン</td><td>ウォーターズコーポレーション</td><td>186006013</td><td>質量分析ロックスプレー校正用。</td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Waters Corporation</td><td>667004007</td><td>インレットメソッドと質量分析計を制御するソフトウェア</td></tr><tr><td>最大回収バイアル</td><td>Waters Corporation</td><td>600000670CV</td><td>100パック キャップを含む - LEAP HDX-2</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>HDXバッファー用塩</td></tr><tr><td>ミリポア 0.22 & マイクロ;m シリンジフィルター</td><td>ミリポア</td><td>N9CA7069B</td><td>シリンジフィルター</td></tr><tr><td>ms2min</td><td>Applied Photophysics Ltd</td><td>N/A</td><td>fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>HDX buffers</td></tr><tr><td>Peltier temperature controller</td><td>LEAP Technologies Inc.</td><td>HP115-COOL/D</td><td>LEAPロボットのチャンバーの温度を正確に設定するためのペルチェコントローラー。</td></tr><tr><td>ProteinLynx Global Server 3.0</td><td>ウォーターズコーポレーション</td><td>715001030</td><td>ペプチド同定ソフトウェア。代替ソフトウェアは、他のベンダーから入手できます。</td></tr><tr><td>試薬ポットキャップ</td><td>Waters Corporation</td><td>186004632</td><td>100パック</td></tr><tr><td>LEAP HDX-2用試薬ポット</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td>186001420 100パック キャップを除く - LEAP HDX-2</td></tr><tr><td>重水素ナトリウム (99.5% in D2O)</td><td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td><td>DLM-57</td><td>HDX標識バッファー用</td></tr><tr><td>スピンフィルター微量遠心チューブ (3 kDa MWCO)</td><td>アミコン(Merck Sigma Aldrich)</td><td>UFC5003</td><td>タンパク質を濃縮するためのマイクロ遠心チューブ。これにより、HDX-MS実験のバッファー交換と正確なサンプルローディングが容易になります。</td></tr><tr><td>Synapt G2-Si 質量分析計</td><td>ウォーターズコーポレーション</td><td>176850035</td><td>質量分析計</td></tr><tr><td>総回収バイアル</td><td>ウォーターズコーポレーション</td><td>600000671CV</td><td>100パック キャップを含む - LEAP HDX-2</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253-250G</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T60040-B2005</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>尿素</td><td>シグマAldrich</td><td>U5378-1KG</td><td>Chaotrope/Denaturant</td></tr><tr><td>VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 カラム&nbsp;</td><td>ウォーターズコーポレーション</td><td>186004623</td><td>トラップ脱塩カラム</td></tr></tbody></table>

生理学的条件下でのα-シヌクレイン構造ダイナミクスの研究のためのミリ秒水素/重水素交換質量分析

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

α-シヌクレイン(aSyn)は、パーキンソン病の特徴であるレビー小体および神経突起に線維凝集体が豊富に存在する本質的に障害のあるタンパク質である。しかし、その生物学的活性の多くは、その凝集と同様に、タンパク質の可溶性モノマー形態を中心的に含む。aSyn生物学や病態生理学の分子機構の解明には、構造的に高度に解像された方法が必要であり、生物学的条件に敏感である。そのネイティブに展開された準安定構造は、単量体aSynを多くの構造生物学技術にとって扱いにくくする。ここでは、そのようなアプローチの1つの適用が説明されています:aSynのような低い熱力学的安定性と弱い保護因子を有するタンパク質の研究のためのミリ秒時間スケールでの水素/重水素交換質量分析(HDX-MS)。ミリ秒の時間スケールでは、HDX-MSデータにはaSynの溶媒アクセス性と水素結合構造に関する情報が含まれており、これらはより長い標識時間で失われ、最終的にアミノ酸レベルまでの構造分解能が得られます。したがって、HDX-MSは、立体構造ダイナミクスと熱力学、分子内および分子間相互作用、および環境条件に対する突然変異または変化の構造的影響に関する情報を高い構造的および時間的分解能で提供することができます。広く適用可能ですが、単量体aSynでミリ秒のHDX-MS測定値を取得、分析、および解釈する方法が示されています。

その本質的に無秩序な性質のために、生理学的pHでaSynの複雑な構造変化を捕捉することは困難である。HDX-MSは、骨格アミド水素での同位体交換を監視し、タンパク質の立体構造ダイナミクスと相互作用をプローブします。この情報を高い構造的・時間的分解能で取得する数少ない手法の1つです。このプロトコルは、広範囲のタンパク質および緩衝液条件に広く適用可能であり、これは、ステップ2.1.-2.2で定義されているように、状態Aおよび状態B8の2つの異なる溶液条件におけるaSynの交換動態の測定によって例示される。
まず、aSynのマッピング実験を行い、 図1に示すようなペプチドカバレッジマップを得た。このマップはタンパク質配列の 100% をカバーし、平均冗長性は 3.79 です。100%カバレッジ値は、タンパク質中のすべてのアミノ酸がタンパク質消化物中に見出されたことを示し、aSynの交換挙動の包括的な分析を可能にする。冗長性値は、重複するペプチドの数を示す。より高い冗長性値は、最終マ...

単量体α-シヌクレインの構造アンサンブルは、その生理学的機能および物理化学的特性に影響を及ぼす。本プロトコルは、ミリ秒の水素/重水素交換質量分析およびその後のデータ分析を実行して、生理学的条件下でこの本質的に無秩序なタンパク質のモノマー上の立体構造情報を決定する方法を記載する。

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

すべての生物はプロテオームに障害があり、最大33%と推定され、これらの領域は水素/重水素交換質量分析によって観察可能ですが、ミリ秒の時間範囲でのみ観察できます。私たちのプロトコルは、これを正常に行う方法を紹介します。これは完全に自動化された分析技術です。あなたはすべてを設定し、希望の時間測定をプログラムし、ゴーとウォークアウトを打つだけです。この技術は、α-シヌクレインなどの本質的に無秩序なタンパク質の特異的な確認を安定化させる化合物をスクリーニングするエキサイティングな機会を開く。ペプチドマッピングのためのサンプル調製を開始するには、まず、マイナス80°Cの冷凍庫から保存されたα-シヌクレインタンパク質ストックのバイアルを取ります。そして解凍したら、0.22マイクロメートルのシリンジフィルターを使用してろ過します。次に、溶液の吸光度を218ナノメートルで測定し、Beer-Lambertの法則を用いてタンパク質濃度を決定し、平衡緩衝液でタンパク質を最終濃度5マイクロモルに希釈する。次に、オートサンプラーロボットをセットアップするには、5マイクロモルのタンパク質溶液を50マイクロリットルの合計回収バイアルに追加し、質量分析計に沿って水素/重水素交換(HDX)ロボットの右側のチャンバーのサンプル位置にバイアルを置きます。次に、左チャンバーの試薬位置1、4、5に平衡バッファーのバイアル1本とペプシン洗浄バッファーのバイアル2本を入れ、HDX右チャンバーの試薬位置1にクエンチバッファーのバイアル1本を入れ、ペルチェ温度コントローラーを使用して温度を摂氏20度に設定した。次いで、HDX左チャンバーおよびHDX右チャンバーの同じ反応位置にそれぞれ等しい数の総回収バイアルおよび最大回収バイアルを追加する。次に、スケジューリングソフトウェアで適切なLCおよびMSメソッドでサンプルリストを設定し、スケジュールを開始します。最終的なペプチドカバレッジマップを取得するには、DynamX HDXデータ分析ソフトウェアで同位体割り当てを手動でキュレーションします。Fast HDXプロトタイプ計測器をクリーニングした後、互換性のあるHDXソフトウェアのグラフィカルユーザーインターフェイスを開き、システムを初期化します。サンプルチャンバーとクエンチチャンバーの温度としてそれぞれ20°Cと0.5°Cを入力し、次に「設定」をクリックして新しい温度を適用します。装置を洗浄して準備するには、すべての入口にLC / MSグレードの水を入れた遠心分離管をセットアップし、滴定器配管供給タブで左右のシリンジの両方を確認し、チューブ内のすべての潜在気泡がなくなるまでプライムをクリックし続けます。シリンジのすべてのボックスをチェックするには、まずマクロタブに移動し、キャリブレーションシリンジホームポジションをクリックし、次に最初にシリンジロードループの洗浄をクリックし、続いてすべての混合ループボリュームを洗浄します。バッファーシリンジに気泡がある場合は、シリンジを取り外し、垂直に気泡を噴出させて脱気します。ゼロ位置に再較正する前に、シリンジを交換してください。HDX実験用のFast HDXプロトタイプ機器をセットアップするには、まず左の滴定入口チューブをトータルリカバリバイアルに挿入します。温度によるオリゴマー化と凝集を防ぐために、チューブを卓上冷蔵庫に入れます。次に、50ミリリットルの平衡、標識、急冷、およびペプシン洗浄バッファーを、装置の左右チャンバー内のそれぞれのバッファー入口に加え、続いて、50ミリリットルのカラム洗浄バッファーをペプシン洗浄入口に加えます。タンパク質とカラム洗浄ラインをプライミングするには、滴定器配管デリバリータブで左右のシリンジを確認し、プライムを1回クリックします。前述のようにシリンジのすべてのボックスをチェックしたら、手動急冷フロータブに移動して必要な設定を入力します。タイムコースの実験では、記号ドットボタンを使用してミリ秒単位で時間を入力します。次に、トラップ時間を 3 に設定し、HPLC がトラップ時間プラス実行時間 + 1.5 分になるまで待機します。サンプル実行の間に空白の実験を実行する場合は、各サンプル実行後に取得ソフトウェアに空白の実行のエントリを確認してから、[実行]空白ボックスをクリックします。サンプルリストの準備が整い、適切なエントリが強調表示されたら、ソフトウェアで[再生と高速HDX]をクリックして実行を開始します。データ処理の場合は、ペプチドマッピング実験からスペクトル的に割り当てられたペプチドのファイルのファイルメニューを開き、DynamXソフトウェアで開くをクリックしてから、生ファイルをDynamXソフトウェアにインポートします。データメニューを開いたら、[MSファイル]をクリックします。研究中の各タンパク質状態の状態を作成するには、新しい状態をクリックします。各HDXタイムポイントを追加するには、新しい露出をクリックしてから、[新しい生]をクリックします。raw ファイルをインポートするには、各ファイルを正しい位置にドラッグし、完了したら「OK」をクリックします。同位体を自動的に割り当てた後、高いデータ品質を確保するために、同位体割り当てを手動でキュレーションします。クラスタデータをcsvファイルにエクスポートし、原稿に記載されているように列順に記述します。質量測定ソフトウェアでデータメニューを開き、クラスタデータのエクスポートをクリックします。データ分析の場合は、まずエクスポートしたクラスター化データをHDX分析ソフトウェアHDfleXにロードします。すべての実験と状態の実験データを適合させるには、適切な逆交換補正方法を選択して、HDX反応の観測された速度定数を取得します。次に、HDfleX の推奨方法を使用してグローバル有意性しきい値を計算し、ハイブリッド有意性検定を実行して、比較された状態間の有意差を決定します。α-シヌクレインのマッピング実験では、タンパク質配列の100%を平均冗長性3.79でカバーするペプチドカバレッジマップが生成されました。さらに、このプロトコルは、α-シヌクレインの異なるペプチドの重水素取り込み曲線の生成を可能にし、それを適合および逆交換補正グラフとして表現した。α-シヌクレインにおけるほとんどの水素/重水素交換が1秒で行われたことは明らかであった。α-シヌクレインの状態Aと状態Bの間の立体構造の違いは、ペプチドおよびアミノ酸レベルの両方で状態Bによるより高い重水素取り込みからも明らかであった。このような高感度の手法では、データを比較するときに堅牢な統計的有意性検定を使用することが重要です。ここでは、ソフトウェアHDfleXを使用しました。

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初代胚性マウスドーパミンニューロンにおけるα-シヌクレイン蓄積の研究

タンパク質の立体構造とダイナミクスは、タンパク質の構造と機能の関係を理解するための鍵となります。高分解能質量分析と組み合わせた水素の交換は、タンパク質のコンフォメーションのダイナミクスを研究だけでなく、接触インタフェースおよびアロステリック効果を含むタンパク質 - リガンドとタンパク質 - タンパク質相互作用を特徴付けるための汎用的な方法である。...

水素交換質量分析法を用いてタンパク質のダイナミクスを分析する

コンフォメーションの柔軟性は、タンパク質の機能に重要な役割を果たしています。本明細書において、我々は、規則及び不規則タンパク質に機能を駆動急速な構造変化をプロービングするための水素 - 重水素交換に結合された時間分解エレクトロスプレーイオン化質量分析法の使用を記載しています。...

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

このプロトコルの目的は、生体内でα-シヌクレインの形成を複製するセルベースのシステムを集約を提供することです。細胞内の α-シヌクレイン介在物は一次ニューロンに内面化することによって播かれ、伝搬の外因性投与罹患 α-シヌクレイン遺伝子組換えマウスから隔離されたネイティブのミクロソームによる...

線維形成の強力な細胞モデルとして α-シヌクレインのミクロソーム関連付けられた集計一次ニューロンの外因性投与

ランチペプチド合成酵素は、ペプチド天然物の生合成中に多段階反応を触媒する。ここでは、ランチペプチド合成酵素の立体ダイナミクス、ならびにペプチド天然物生合成に関与する他の同様の酵素を研究するために使用できる、連続的なボトムアップ、水素重水素交換質量分析(HDX-MS)ワークフローについて述べています。...

ペプチド生合成酵素を調べた水素重水素交換質量分析(HDX-MS)プラットフォーム

ここでは、一次マウスドーパミンニューロンにおけるニューロンα-シヌクレイン蓄積を研究するための詳細なプロトコルを提示する。リン酸化されたα-シヌクレイン凝集体は、ニューロン内で、あらかじめ形成されたα-シヌクレイン線維で誘導される。免疫蛍光標識細胞の自動イメージングと偏りのない画像解析により、この堅牢なプロトコルは、α-シヌクレイン蓄積を阻害する薬剤の中~高スループットスクリーニングに適しています。...

原発性胚マウス中脳ドーパミンニューロンにおける前形成線維誘導α-シヌクレイン蓄積の研究

時間分解された単一分子タンパク質誘導蛍光増強は、タンパク質の局所的な構造変化に敏感な蛍光分光性近接センサとして有用である。ここでは、より長い範囲のFRET定規を使用して測定した場合、球状に非構造化および不安定として知られているα-Synucleinの安定した局所的な立体構造を発見するために使用できることを示す。...

時間分解タンパク質誘導蛍光強化を利用して、一度に1つのαシヌクレインモノマーの安定した局所構造を同定する

ここでは、キャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換(HDX)アプローチとトップダウン質量分析を組み合わせたプロトコルを紹介します。このアプローチは、同時差動HDXおよび電気泳動分離を行うことによって、異なる状態および異なるプロテオ形態のタンパク質を含む、異なるタンパク質種間の高次構造の違いを特徴付ける。...

トップダウン質量分析によるタンパク質の立体構造特性評価のためのキャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換

中性子後方散乱分光法は、タンパク質とその水和水のps-nsダイナミクスへの非破壊でラベルフリーのアクセスを提供します。このワークフローには、アミロイドタンパク質に関する2つの研究、すなわち凝集中のリゾチームの時間分解ダイナミクスと、繊維形成時のタウの水和水ダイナミクスに関する研究が提示されています。...

タンパク質と水和水のピコ秒ナノ秒ダイナミクスを研究するための高分解能中性子分光法

パーキンソン病は、農薬への暴露に関係している。ここでは、所望の濃度と腸神経系ではα-シヌクレインの蓄積で、その効果を分析する方法で胃管を使って殺虫剤を提供する方法を示しています。...

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学ぼう、ミリ秒水素/重水素交換質量分析法を用いて生理学的条件下でα-シヌクレインの構造ダイナミクスを解析する方法。この技術は本質的に無秩序なタンパク質のコンホメーション変化をリアルタイムで評価し、神経変性疾患のメカニズム解明に貢献します。

生理学的条件下でのα-シヌクレイン構造ダイナミクスの研究のためのミリ秒水素/重水素交換質量分析

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