Name: 二次アドヒアランス法によるラット骨からの単球-マクロファージ系譜細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 19 s
Description: 学ぶ二次アドヒアランス法によるラット骨髄単球-マクロファージ系譜細胞の単離と培養法。骨破壊細胞への分化を誘導し、骨粗鬆症の病態研究に有用な細胞モデルを構築する実験技術です。

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この研究は、浙江省自然科学財団の支援を受けました(助成金番号。LY19H060001)および浙江省漢方薬科学技術計画プロジェクト(番号2022ZB093)。

本試験における全ての実験は、浙江省中国医科大学実験動物研究センターの動物実験ガイドライン(承認番号:IACUC-20181029-11)に従って実施した。
1. 細胞抽出
<ol><li>Sprague-Dawleyラット(SDラット、生後1〜10日、雄または雌)をCO2 で満たされた安楽死ケージに、30%〜70%の容器容量/分のバランスのとれた速度で入れる。ラットが意識を失った後(20〜60分)、頸部脱臼によってラットを安楽死させ、痛みのない死を確実にする。</li>
	<li>消毒のためにラットを75%アルコールに10分間浸漬する。</li>
	<li>はさみと鉗子でラットのすべての四肢を慎重に取り除き、ピペットを使用してPBSで吸引し、四肢に付着した血液を洗い流す。</li>
	<li>500mLのDMEMに5mLのペニシリン/ストレプトマイシン溶液を加え、よく混ぜる。50 mLの滅菌遠沈管を取り、5 mLのFBSおよび45 mLのDMEM培地を加え、十分に混合して、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を含む10%FBS DMEMを得た。上記の培養液2 mLを5 mLチューブに加える。</li>
	<li>四肢の骨を5mLチューブに移す。はさみを使用してチューブ内の四肢の骨を小片(1〜3mm)に切断し、ホモジネートを混合して骨髄細胞を培養液に再懸濁させる。組織断片がチューブの底に落ち着くまで5分間放置する。</li>
	<li>100 mLの10%FBS DMEMを100 mm培養皿に加え、上清を培養皿に移した。上清を吸引するときは、組織破片を培養皿に移さないでください。</li>
	<li>37°Cおよび5%CO2で約24 時間インキュベートする。このインキュベーション時間の後、間葉系幹細胞の大部分は培養皿壁に接着し、ゆっくりと増殖するが、ほとんどのBMMは依然として培養培地中に懸濁される。</li>
	<li>100 mm培養皿の細胞懸濁液を新しい25 cm 2 フラスコに移し、37°Cおよび5%CO2 でさらに24時間細胞を培養し続ける。古い培地を慎重に取り除き、BMMがフラスコ壁に付着した後、新鮮な培地と交換してください。</li>
	<li>フラスコ内の細胞が80%〜90%コンフルエントに達したときの継代培養。 注:全ての細胞を37°Cおよび5%CO2で培養した。培養中、細胞形態は徐々に統一された。細胞は大きく、不規則な形をしており、放射状に成長し、複数の核が観察できるディスクの形でフラスコに付着していた。</li>
</ol>2. 細胞のFACS染色
<ol><li>市販のトリプシン1~2mLを37°Cで5%CO2 で5分間使用してトリプシン消化し、二次付着細胞をカウントして最終細胞数100,000/サンプルを確保した(ノイバウアー血球計で細胞をカウント)。</li>
	<li>細胞を3つの群に分割する(500μLのPBSは100,000個の細胞を含む):(1)染色されていない細胞を含むブランク対照群;(2)前記アイソタイプ対照群;(3)実験群(CD11b/c染色)とした。</li>
	<li>一次抗体(ブランク対照群は抗体なし;アイソタイプ対照群は抗CD11アイソタイプ対照、0.6 μLの抗体/サンプル、1 μg/サンプル;実験群は抗CD11b/c、抗体/サンプル1 μL、1 μg/サンプル)を氷上で30分間インキュベートする。</li>
	<li>300-350 x g で5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を500 μLのPBSで再懸濁する。上記の手順を 1 回繰り返して、結合していない一次抗体が洗い流されるようにします。</li>
	<li>対応する二次抗体(ブランク対照群には抗体なし;アイソタイプ対照群および実験群にはヤギ抗ウサギIgG、0.25 μL抗体/サンプル、1:2,000)を氷上で暗所で30分間インキュベートする。</li>
	<li>300-350 x g で5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を500 μLのPBSで再懸濁する。上記の手順を 1 回繰り返して、結合していない第 2 抗体が洗い流されるようにします。</li>
	<li>フローサイトメトリー(10,000細胞/サンプル)でCD11b/c陽性細胞を検出し、ソフトウェア(FlowJo 7.5など)でデータを分析します。 注:CD11b/c+細胞の最終百分率を得るために、以下の式を使用した:実験群におけるCD11b / c +細胞の割合−アイソタイプ対照群におけるCD11 +細胞の割合。</li>
</ol>3. ライト・ギムザ染色
<ol><li>35mm2細胞クライミングシート(1×106細胞/ウェル)上に3回継代した付着性二次細胞を播種し、37°Cおよび5%CO2で24時間培養する。</li>
	<li>培養液を捨て、PBSで3回洗浄する。</li>
	<li>ライト・ギムザ色素溶液(0.5 mL~0.8 mL)を細胞クライミングシートに1分間加える。</li>
	<li>染料を蒸留水(0.5mL〜0.8mL)と綿棒で混合し、10分間静置する。</li>
	<li>色素溶液を蒸留水で洗浄し、次いで1〜3分間乾燥させる。顕微鏡下で観察する。</li>
</ol>4. トラップ染色
<ol><li>35mm2細胞クライミングシート(1×106細胞/ウェル)上に3回継代した付着性二次細胞を播種し、37°Cおよび5%CO2で24時間培養する。</li>
	<li>古い培地を、核因子-κBリガンド(RANKL)の50ng/mL受容体活性化剤および30ng/mLのマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を添加した10%FBS DMEMまたは破骨細胞誘導培地と交換し、37°Cおよび5%CO2 でさらに7日間培養する。</li>
	<li>製造元のプロトコールに従ってTRAP染色キットで細胞を染色し、顕微鏡下で観察する。 注:TRAP陽性細胞は破骨細胞と定義され、これは光学顕微鏡下で紫色であった。TRAP陽性細胞の数は、ImageJソフトウェアを用いて測定した。</li>
</ol>5. ウェスタンブロット
<ol><li>35mm2細胞クライミングシート(1×106細胞/ウェル)に3回継代した付着性二次細胞を播種し、24時間培養する。</li>
	<li>古い培地を新鮮な10%FBS DMEMまたは破骨細胞誘導培地(50ng/mLのRANKLおよび30ng/mLのM-CSF)と交換し、37°Cおよび5%CO2でさらに7日間培養する。</li>
	<li>RIPA緩衝液で全細胞タンパク質を抽出し、10%SDS−PAGEにより分離し、ポリフッ化ビニリデン膜18、19に転写する。</li>
	<li>5%脱脂粉乳(25mL)で2時間ブロックし、TBS-Tween 20(TBST)で3回、毎回10分間洗浄します。</li>
	<li>一次抗体を4°Cで一晩インキュベートし(抗βアクチン、抗TRAP、および抗カテプシンK;すべての一次抗体を1:1,000に希釈し、10mL希釈抗体/バンド)、TBSTで3回洗浄した。</li>
	<li>二次抗体(ヤギ抗ウサギIgG、1:2,000希釈、10mL希釈抗体/バンド)を室温で2時間インキュベートし、TBSTで3回洗浄する。現像液を用いてタンパク質バンドを可視化する。 注:上記のタンパク質の発現レベルをβ-アクチンに正規化した。</li>
</ol>

<ol><li>Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+differentiation+and+antigen-presenting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte differentiation and antigen-presenting functions.</a> Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).</li>
<li>Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+mechanisms%2C+and+significance+of+macrophage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity.</a> Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Ono, T., Nakashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+osteoclast+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in osteoclast biology.</a> Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%C3%9F-catenin-mediated+p53+suppression+is+indispensable+for+osteogenesis+of+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells.</a> Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).</li>
<li>Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-206+is+required+for+osteoarthritis+development+through+its+effect+on+apoptosis+and+autophagy+of+articular+chondrocytes+via+modulating+the+phosphoinositide+3-kinase%2Fprotein+kinase+B-mTOR+pathway+by+targeting+insulin-like+growth+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).</li>
<li>Li, Z., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+for+investigating+how+bone+marrow+adipocytes+influence+bone+and+hematopoietic+cellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research.+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity.</a> Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).</li>
<li>Horowitz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">marrow adipocytes.</a> Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).</li>
<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+frommice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).</li>
<li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).</li>
<li>Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+interstitial+macrophages+from+the+lungs+using+different+digestion+enzymes+and+staining+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).</li>
<li>Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+culture+approach+to+study+osteoclast+differentiation+from+nonadherent+porcine+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).</li>
<li>Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+consistent+method+to+identify+and+isolate+mononuclear+phagocytes+from+human+lung+and+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes.</a> Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).</li>
<li>Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+osteoclast+precursor+populations+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).</li>
<li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li>
<li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-speed+western+blot+using+immunoreaction+enhancing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (163), e61657(2020).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759(2008).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycyrrhizic+acid+suppresses+osteoclast+differentiation+and+postmenopausal+osteoporosis+by+modulating+the+NF-%CE%BAB%2C+ERK%2C+and+JNK+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmocology%22%5BJournal%5D)">Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways.</a> European Journal of Pharmocology. 859, 172550(2019).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRc17+controls+BMSC+senescence+via+mitophagy+and+inhibits+the+therapeutic+effect+of+BMSCs+on+ovariectomy-induced+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss.</a> Redox Biology. , (2021).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioacetamide+promotes+osteoclast+transformation+of+bone+marrow+macrophages+by+influencing+PI3K%2FAKT+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways.</a> Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).</li>
</ol>

著者らは、競合する利害関係はないと宣言している。

破骨細胞は、骨疾患の発生および発症に関与する最も重要な細胞型の1つであり、骨疾患研究の主要な目的の1つである20。単球/マクロファージは破骨細胞に分化することができる。単核マクロファージ(RAW264.7細胞)は高価すぎて購入できず、培養中に活性化されやすいため、この細胞株を用いた 体外 分化実験を行うことは困難である。骨髄から単球/マクロファージを抽出するために、密度勾配遠心分離、コラゲナーゼ消化、ミクロスフェア濃縮およびフローサイトメトリーを含むいくつかの方法が開発されているが(表1)、これらの方法は時間がかかり、高いサンプル量と高価な装置を必要とする。そこで、本研究では、骨髄試料からモノサイト/マクロファージを簡便かつ迅速に抽出する方法を提案することを目指した。
骨髄には、BMMに加えて、BMSC、内皮細胞および免疫細胞を含む多くの細胞集団が存在する。BMSCが骨芽細胞に分化することができ、このプロセスが破骨細胞へのBMMの分化に影響を与えることは誰もが知っているように<sup...

骨髄中に存在する単球・マクロファージ系譜細胞が血液単球や組織マクロファージに分化できることが報告されている1,2。上記の細胞は、骨の成長と発達のバランスをとるために破骨細胞に分化することができ、インビボで破骨細胞を誘導する細胞モデルとして一般的に使用されている3,4。骨髄は、骨髄間葉系幹細胞、骨髄単球 - マクロファージ細胞(BMM)、造血幹細胞、内皮細胞、および免疫細胞を含むがこれらに限定されない、いくつかの異なるタイプの細胞を含む特別な組織である。実際、いくつかの以前の研究は、長骨の骨髄腔から突出した付着細胞が骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、または脂肪細胞に分化する可能性を示唆した5、6、7、8。異なる均質な細胞集団を作製するために、異なる単離および培養方法が使用されてきたが、様々な異なる細胞型からBMMを単離および培養することには依然として大きな課題がある。
骨髄単核球マクロファージ(BMSC)を抽出するためにいくつかの方法が開発されている。しかしながら、これらの方法の大部分は、複雑な9、10、11である。たとえば、密度勾配遠心分離には特殊なキットが必要であり、操作には時間がかかり面倒です。この方法は、大量の血液サンプルからのBMMの単離には適しているが、骨髄サンプル9、12、13からはそうではない。さらに、コラゲナーゼ消化を使用して組織サンプルを抽出することは、複雑で時間のかかる手順です。この方法は、骨髄サンプルからのBMMの単離には推奨されない14、15。さらに、流動分離は高度に精製された単球/マクロファージ集団をもたらす可能性がありますが、非常に大きなサンプルサイズと高い機器および機器要件が必要です10,16。さらに、マイクロビーズ濃縮法は極めて高価であり、一般の実験室17では実現不可能である。
したがって、現在の研究では、骨髄からの単核球マクロファージの単離のために、便利で、速く、そして安価な方法が提案された。異なる時点で接着した骨髄細胞を用いて、二次接着法を用いてBMMを単離した。上記の方法で抽出されたBMMは、 インビトロで破骨細胞の形成を誘導することができ、したがってイン ビトロでの骨粗鬆症の将来の研究のための簡単で便利な細胞モデルを提供する。

<table><tbody><tr><td>35 mm2 細胞上昇スライス</td><td>NEST バイオテクノロジー</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>抗カテプシン K</td><td>Abcam</td><td>ab19027</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>抗 CD11 アイソタイプ制御</td><td>Abcam</td><td>ab172730</td><td>1 &mu;g /テスト、1.675 mg / Ml</td></tr><tr><td>抗CD11b / c</td><td>アブシン</td><td>abs124232</td><td>&nbsp;1&mu;g/test, 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Anti-TRAP</td><td>Abcam</td><td>ab191406</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>アンチβ;-アクチン</td><td>Beyotime</td><td>&nbsp;AF5003</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>細胞クライミングスライス</td><td>NEST バイオテクノロジー</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><td>コーニング</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ</td><td>コーニング</td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの改変イーグル培地 (DMEM)</td><td>ギブコ</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>ギブコ</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td>IF用、1:2,000</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>WB用、1:2,000</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Pepro技術</td><td>400-28</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>バイオシャープ</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Pepro技術</td><td>400-30</td><td></td></tr><tr><td>SDラット</td><td>上海SLAC実験動物有限公司</td><td></td><td>1-10日前</td></tr><tr><td>SDS-PAGE ゲル調製キット</td><td>ソーラーバイオ</td><td>P1200</td><td></td></tr><tr><td>TRAP/ALP 染色キット</td><td>和光</td><td>294-67001</td><td></td></tr><tr><td>トリプシンEDTA溶液</td><td>バイオシャープ</td><td>BL512A</td><td></td></tr><tr><td>ライト・ギムサ溶液</td><td>キーゲン・バイオテック</td><td>KGA225-1</td><td></td></tr></tbody></table>

二次アドヒアランス法によるラット骨からの単球-マクロファージ系譜細胞の単離

Isolation of Monocyte-Macrophage Lineage Cells from Rat Bones by Secondary Adherence Method

骨塩密度が低下すると、骨が骨折する可能性が高くなり、患者の生活の質に悪影響を及ぼします。骨の成長および発達は、主に骨芽細胞および破骨細胞によって調節される。破骨細胞は骨髄単球 - マクロファージ細胞(BMM)に由来することが広く受け入れられている。BMMおよび他の造血幹細胞は、骨髄腔内に位置する。したがって、異なる異種の細胞集団から単一の安定BMMを単離することは大きな課題である。ここでは、二次アドヒアランス法と呼ばれるSDラットからBMMを単離するためのプロトコルを提示する。初代培養で24~48時間培養した付着細胞を回収した。フローサイトメトリー分析により、細胞の約37.94%がCD11b/c+(単球-マクロファージ表面抗原)であることが示された。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色およびウェスタンブロット分析は、BMMが インビトロで破骨細胞に分化できることを実証した。以上の知見は、二次接着細胞が破骨細胞分化研究に好適な細胞モデルと考えられることを示唆した。

二次付着細胞集団は安定かつ均一であった。連続的な細胞増殖に伴い、細胞の大部分は不規則な形状でより大きくなり、放射状の接着円盤に成長した(図2C、D)。フローサイトメトリーは、単球-マクロファージ系譜細胞の表面上の分子マーカーであるCD11b/cを発現する細胞の割合が約37.94%であることを示した(図2A、B)。さらに、CD11b/c陽性細胞が単球-マクロファージ系譜細胞であることを確認するために、RANKLおよびM-CSFによる細胞処理後に二次接着細胞から破骨細胞への分化を誘導した。TRAP染色の結果、対照群と比較して、RANKLおよびM-CSFで誘導された細胞において細胞内紫赤色顆粒の数が有意に増加したことを示した(図2E、F)。さらに、破骨細胞特異的タンパク質TRAPおよびカテプシンKの発...

ここでは、二次アドヒアランス法と呼ばれるSDラットからBMMを単離するためのプロトコルを提示する。

With a decrease of bone mineral density, bones are more likely to fracture, thus negatively affecting a patient's quality of life. The growth and ...

このプロトコールでは、骨髄単球 - マクロファージ細胞は、二次接着法によって抽出される。骨髄単球 - マクロファージ細胞は破骨細胞に分化することに成功し、これはインビトロでの破骨細胞の研究のための安定した細胞モデルを提供する。この方法は、小さな骨髄サンプルに適しており、ハイテクラボ機器を必要とせずに、骨髄から骨髄単球 - マクロファージ細胞を簡単かつ迅速に抽出することができます。破骨細胞の増加は、骨粗鬆症の潜在的な病因であり得る。骨髄単球-マクロファージ細胞は破骨細胞前駆細胞として一定の研究価値を有する。まず、安楽死させたラットを75%アルコールに10分間浸漬して消毒します。ラットのすべての四肢をハサミと鉗子で慎重に取り除いた後、ピペットを使用してPBSで吸引し、四肢に付着した血液を洗い流す。次に、10%FBS DMEMの2ミリリットルで5ミリリットルのチューブに入れます。四肢の骨を5ミリリットルのチューブに移した後、はさみを使用してチューブ内の四肢の骨を小片に切断し、ホモジネートを混合して骨髄細胞を培養液に再懸濁させる。組織断片がチューブの底に落ち着くまで5分間放置する。次に、100ミリの培養皿に10ミリリットルの10%FBS DMEMを加え、上清を培養皿に移す。5%の二酸化炭素中で摂氏37度で約24時間インキュベートする。このインキュベーション時間の後、間葉系幹細胞の大部分は培養皿壁に接着し、ゆっくりと増殖するが、ほとんどの骨髄単球 - マクロファージ細胞は依然として培養培地に懸濁される。100ミリメートル培養皿の細胞懸濁液を新しい25センチメートル四方のフラスコに移し、5%二酸化炭素中で摂氏37度で細胞をさらに24時間培養し続ける。古い培地を慎重に取り除いた後、骨髄単球・マクロファージ細胞がフラスコ壁に付着した後、新鮮な培地と交換する。フローサイトメトリーは、単球-マクロファージ系譜細胞の表面上の分子マーカーであるCD11bおよびcを発現する細胞の割合が約37.94%であることを示した連続的な細胞増殖により、細胞の大部分は不規則な形状内で大きくなり、放射状の付着性ディスクに成長した。TRAP染色の結果から、対照群と比較して、核因子カッパBリガンドおよびマクロファージコロニー刺激因子の受容体活性化剤で誘導された細胞において細胞内紫赤色顆粒の数が有意に増加したことが示された。ウェスタンブロット解析は、破骨細胞特異的タンパク質TRAPおよびカテプシンKの発現レベルが、対照群と比較して処理細胞において有意に増加したことを実証した。この手順で最も重要なことは、初代培養の24〜48時間で二次接着細胞を採取する時間であり、骨髄単球 - マクロファージ細胞は完全に接着し始める。この方法により単離された骨髄単球・マクロファージ細胞は、インビトロで破骨細胞に誘導することができ、骨粗鬆症の研究のための安定な細胞モデルを提供する。

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ラット肝細胞の初代培養からマクロファージを取得するための新しい方法が記載されている。このメソッドは、プラスチック製の皿に選択的付着によって培養フラスコ及び精製の揺れが続く文化におけるマクロファージの増殖を、利用しています。この手法は、効率的に複雑な装置やスキルがなくても肝臓のマクロファージを提供します。...

成人肝細胞の混合初代培養からマクロファージを分離するためにシンプルかつ効率的な方法

私たちは、ヒトマクロファージの生成のための簡単​​かつ効率的なプロトコルを提示する。バフィーコートは、二重密度勾配遠心分離によって処理され、単離された単球は、次いで、テフロンコーティングした細胞培養バッグ中でマクロファージに分化される。これは、マクロファージ収量を最大化し、その後の実験のために細胞の回収を容易にします。...

ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

ここでは、翻訳適用のために不均一な骨髄から大量のマウス単球を生成するプロトコルを紹介します。他の方法と比較して、この新しい方法は、高勾配磁気細胞分離(MACS)などの高価な方法を回避することにより、犠牲になる動物の数を減らし、コストを削減するのに役立ちます。...

単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射

このプロトコルは、酵素消化、密度勾配分離、プラスチック接着およびCD146 +磁気ビーズ選択を使用することにより、ラットから原発性肺常駐間葉系間質細胞を得るための分離技術について説明します。...

CD146の単離<sup&gt; +</supラット肺から&gt;常駐肺間葉系幹細胞

破骨細胞は、造血幹細胞の単球-マクロファージ系統に由来する組織特異的なマクロファージ polykaryons...

ラット骨髄からの破骨細胞前駆体の分離・精製・分化

本稿では、ラット下顎骨から骨髄間葉幹細胞を単離、栽培、選別、同定するための骨髄付着とフローサイトメトリーの選別を組み合わせた方法を紹介する。...

ラットにおける骨髄間葉系幹細胞の単離と培養

ここで提示されるペプチドCD47(pepCD47)をポリビスフォスフォネート化学を用いて金属ステントに付加するためのプロトコルです。pepCD47を用いた金属ステントの機能化は、炎症細胞の付着および活性化を防止し、生体適合性を向上させる。...

CD47由来ペプチド固定化による金属インプラントへの血液媒介性細胞の取り付けの軽減

本プロトコールは、マウスからの骨髄由来マクロファージの単離および培養について記載している。...

マウス由来骨髄由来マクロファージの単離と培養

この研究では、ラットの骨髄から豊富な好中球細胞外トラップ(NET)を単離するための2つの技術について概説しています。1 つの方法は、市販の好中球分離キットと密度勾配遠心分離を組み合わせたもので、もう 1...

同等の容量を持つラット骨髄好中球を単離するためのユニークなアプローチ

このプロトコルは、7-9日齢の新生児マウス骨髄細胞を単離し、L929細胞の上清を顆粒球コロニー刺激因子(M-CSF)の供給源として使用して分化したマクロファージを生成するための非酵素的で簡単な方法を説明しています。骨髄由来マクロファージは、表面抗原F4/80、CD206、CD11b、および機能的コンピテンシーについてさらに分析されました。...

新生児マウス骨髄単離と骨髄由来マクロファージの調製

顎骨髄由来の間葉系幹細胞は、多様な分化、自己複製、免疫調節に重要な機能を持っています。それらは、遺伝子治療、組織工学、および再生医療における前駆細胞の重要な貯蔵庫として浮上しています。ここでは、ラットの顎骨髄間葉系幹細胞を単離する独自の方法を紹介します。...

ラット顎骨髄間葉系幹細胞の単離および培養技術

学ぶ二次アドヒアランス法によるラット骨髄単球-マクロファージ系譜細胞の単離と培養法。骨破壊細胞への分化を誘導し、骨粗鬆症の病態研究に有用な細胞モデルを構築する実験技術です。

二次アドヒアランス法によるラット骨からの単球-マクロファージ系譜細胞の単離

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