マウスにおけるリゾホスファチジルコリン誘発局所脱髄モデルの安定的に確立された2点注射
2022年5月11日
本プロトコールは、マウスにおいて安定かつ再現可能な脱髄モデルを生成するための定位フレーム を介した リゾホスファチジルコリンの2点注射を記載する。
私たちのモデルは、脱髄疾患、特に多発性硬化症に非常に関連しています。また、関連する臨床的に関連する研究の進展に貢献することができます。これは、外科的処置によってマウスに迅速かつ安定して重度の脱髄を直接引き起こす可能性のある詳細なプロトコルです。
この手法を初めて試すときは、辛抱強く、座標が正確であることを確認してください。32ゲージの針を5マイクロリットルの注射器に接続することから始めます。注射の準備のために5マイクロリットルのLPC溶液を回収する。
次に、呼吸が滑らかな状態での足指挟み反射の欠如によりマウスの麻酔深度を確認します。背側を上にしてマウスを脳定位固定装置フレームに配置し、ノーズコーンと歯のクランプで頭を固定します。マウスを両側のイヤーバーで固定装置に固定します。
イヤーバーが水平で、頭が水平で安定していることを確認してください。ヨードフォアで拭いて頭の皮膚を消毒します。次にメスを使用して、頭皮の正中線に沿って約1.5センチメートルに小さな切開を切り、頭蓋骨を露出させます。
ブレグマ、ラムダ、および後部泉門が露出するまで、1%過酸化水素に浸した綿棒でスキルを拭きます。注射器を定位固定装置に置きます。動物の頭の水平位置を確認し、脳梁を見つけます。
注射部位が決まったら、座標を記録し、頭蓋骨にマーカーで印を付けます。マークされた部位を頭蓋骨ドリルでそっと開けます。出血しないように注意してください。
針を指定された座標までゆっくりと動かします。脳梁脱髄を誘発するには、各注射部位に毎分0.4マイクロリットルの速度で2マイクロリットルのLPC溶液を注入します。注射後、針をさらに10分間各部位に保ちます。
最後に、4-0縫合糸で皮膚を縫合し、動物が10分以内に目覚めるのを待ちます。代表的な画像は、ルクソール高速青色染色による白質軍団の検出を示しています。この結果から、注射後10日目および28日目に脳梁の安定した脱髄が見られる。
異なる時点での脱髄領域の定量化をここに示す。免疫蛍光染色により、分解されたミエリン塩基性タンパク質は、注射後10日目にLPC注射群でdMBPの顕著な増加が観察され、これは脳梁のミエリン喪失を表しています。ミエリン塩基性タンパク質、またはMBPのウエスタンブロット分析は、発現がLPCの注射後にMBPの有意な喪失を示した。
ベータアクチンは、ベースライン発現を測定するための負荷対照として使用されました。電子顕微鏡画像は、偽群とLPC注入群の脳梁における有髄超微細構造を確認します。GST-piは、希突起膠細胞前駆細胞(OPC)の分化成熟のマーカーです。
LPC注射の10日後、GST-piは偽群と比較して減少した。同時に、希突起膠細胞の増殖能力は、増殖する希突起膠細胞と全希突起膠細胞系統細胞の比率によって反映され得る。より高い比率は、注射後10日後の希突起膠細胞のより多くの増殖を表す。
代表的な画像は、各グループ、プラットフォームの存在下、およびプラットフォームを取り外した後のマウスの水泳経路を示しています。結果は、脱髄マウスの空間記憶が2点LPC注射モデルで著しく損なわれていることを示唆しています。この手順を試みるときは、注入速度が正確であることを確認し、針をさらに10分間各部位に保持します。
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概要
本プロトコルでは、脳定位固定装置を用いてリゾホスファチジルコリン（LPC）を2点注入し、マウスに安定した脱髄モデルを作製する方法を詳述します。これは、脱髄疾患、特に多発性硬化症の研究に関連する手法であり、脱髄のメカニズムとその影響に関する研究を可能にします。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 脱髄研究
- 疾患マウスモデル
背景
- 脱髄のメカニズムを理解することは、多発性硬化症などの疾患の治療法を開発する上で極めて重要です。
- 本手順は、実験室環境において迅速かつ再現性のある脱髄を誘導することを目的としています。
- 本処置を成功させるには、正確な手術手技が重要となります。
- モデルの評価には、ルクソール高速ブルー染色などの組織学的解析が用いられます。
研究目的
- 脱髄のメカニズムを研究するための信頼性の高いモデルを確立すること。
- 脱髄に関連する疾患に対する潜在的な治療介入の研究を促進すること。
- 定量的な結果を得ることができる詳細な手術プロトコルを提供すること。
使用された手法
- このモデルでは、LPC注入のために脳定位固定術による手術アプローチを用います。
- マウスの正確な解剖学的部位、具体的には脳梁を標的としてLPC溶液を注入します。
- 各注入では、2 µLのLPCを制御された速度で投与します。
- 術後10日目と28日目の評価により、主要なアウトカム指標を測定します。
- 髄鞘喪失を解析するために、免疫蛍光染色やウェスタンブロッティングなどの組織学的手法を用います。
主な結果
- 脳梁における安定した脱髄が達成され、複数のタイムポイントにおける組織学的染色によって観察された。
- さまざまな分析を通じて、脱髄を示すマーカーの増加が確認された。
- 行動評価により、脱髄後の空間記憶における有意な障害が示された。
- 結果は、LPC処理に応じてオリゴデンドロサイトの増殖および分化が変化することを示唆している。
結論
- 本研究により、脱髄のダイナミクスおよび潜在的な治療戦略を探索するためのモデルを構築することに成功しました。
- これらの知見は、脱髄の根底にある神経メカニズムおよびオリゴデンドロサイトの役割についての洞察を与えるものです。
- このモデルは、多発性硬化症および同様の疾患の理解を前進させる可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
安定的に確立された2点LPC注入モデルにより、マウスにおいて局所的な脱髄を迅速かつ再現性高く誘導することが可能となり、多発性硬化症などの脱髄疾患における探索段階の研究を直接的に支援します。本モデルは、メカニズムのリスク低減、ターゲットバリデーション、および髄鞘の喪失と修復の定量的な評価のための堅牢なプラットフォームを提供します。その再現性と定量的なアウトプットにより、神経炎症性疾患のパイプラインにおける前臨床評価およびポートフォリオの選別における重要なツールとして位置づけられます。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 疾患に関連するシステムにおける脱髄メカニズムおよび経路の関与の解析を可能にします。
- 髄鞘喪失およびオリゴデンドロサイトの反応を定量化することで、機能的なターゲット検証をサポートします。
- 神経炎症性疾患に対する治療仮説の検証において、予測的な信頼性を高めます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 髄鞘再形成または神経保護を標的とした、下流の化合物スクリーニングのための検証済みin vivoシステムを提供します。
- 定量的組織学的および行動学的アッセイに適した、標準化され再現性のある脱髄を誘導します。
- 測定可能なエンドポイントを用いて、候補となる介入法の信頼性の高い評価を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 多発性硬化症で観察される疾患関連の病理と一致しており、トランスレーショナルなバイオマーカー開発を支援します。
- メカニズムの解明から治療戦略の前臨床検証までの一貫性を確保します。
- in vivoで急性脱髄と機能障害をモデル化することで、生物学的リスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本モデルは、初期のメカニズム研究と脱髄疾患におけるトランスレーショナルリサーチを橋渡しし、創薬から前臨床に至る一連の流れに統合されます。
- 探索生物学：定量的な脱髄およびオリゴデンドロサイト分析を通じて、仮説検証および経路の解明を支援します。
- スクリーニング：化合物の評価および用量反応試験に適した、アッセイ可能な再現性の高いアウトプットを提供します。
- 分析：比較分析のために、髄鞘喪失、タンパク質発現、および行動欠損の定量的な測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：バイオマーカーの整合および前臨床検証に向けた、疾患関連エンドポイントをモデル化します。
- 企業的再利用：複数の神経炎症研究プログラムに適用可能な、標準化された再利用可能なin vivoプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 脱髄研究における予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用の価値： プログラム横断的に利用可能な、標準化され再現性のあるスケーラブルなin vivoモデリングを提供する。
- 戦略的価値： 強固な前臨床データを提供することで、go/no-go判断の質と資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響： 神経炎症性疾患アセットのリスク調整済み優先順位付けおよび推進を可能にする。
実施上の留意点
- マウスにおける定位手術および精密な解剖学的標的決定の専門知識が必要です。
- 組織学的解析、免疫蛍光染色、および行動解析のためのインフラストラクチャへのアクセスが必須となります。
- 再現性を確保するため、注入座標および注入速度についてチーム間での標準化が必要です。
- 他のCNS領域や疾患モデルに適用する場合は、プロトコルの最適化が必要となる場合があります。
- 本モデルは主に急性脱髄を反映しており、慢性的な状態や再髄鞘化の研究にはさらなる検証が必要な場合があります。
