Name: 遺伝子治療アプリケーションのための造血幹細胞および前駆細胞のCRISPR/Cas9遺伝子編集 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学ぶ造血幹細胞および前駆細胞のCRISPR/Cas9遺伝子編集法。サイトカインと小分子を用いた培養条件で幹細胞性を保持し、遺伝子修飾細胞の生体内移植効率を向上させる最適化プロトコルを解説する。

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著者らは、CSCRのフローサイトメトリー施設および動物施設のスタッフに感謝したい。A.C.はICMR-SRFフェローシップ、K.V.K.はDST-INSPIREフェローシップ、P.B.はCSIR-JRFフェローシップから資金提供を受けています。 この研究は、インド政府のバイオテクノロジー省によって資金提供されました(助成金番号BT / PR26901 / MED/ 31/377 / 2017およびBT / PR31616 / MED/ 31/408/2019)

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<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
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<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2r%CE%B3-%2F-+Kit%28W41%2FW41%29+%28NBSGW%29+mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
<li>Leonard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+busulfan+reduces+human+CD34%2B+cell+doses+required+for+engraftment+in+c-kit+mutant+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).</li>
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<li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc-receptors+as+regulators+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Fc-receptors as regulators of immunity.</a> Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).</li>
<li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li>
<li>Ngom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UM171+enhances+lentiviral+gene+transfer+and+recovery+of+primitive+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).</li>
<li>Park, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+proliferation+of+human+umbilical+cord+blood-derived+CD34%2B+hematopoietic+stem+cells+by+a+combination+of+hyper-interleukin-6+and+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214(2022).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-based+gene+therapy+of+hematopoietic+stem+cells+in+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Rai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cell+culture+conditions+promote+ex-vivo+manipulation+and+expansion+of+primitive+hematopoietic+stem+cells+for+therapeutic+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益は存在しないと宣言している。

HSPC遺伝子治療の成功は、主に移植片中の生着可能な造血幹細胞の質と量に依存しています。ただし、HSCの機能特性は、遺伝子操作手順に関連するin vitro培養や毒性など、遺伝子治療製品の準備段階で大きな影響を受けます。これらの制限を克服するために、エクスビボ培養でCD34 + CD133 + CD90 + HSCのステム性を保持する理想的なHSPC培養条件を特定しました。多くの研究グループは、SR1またはUM171または他の分子をスタンドアロン分子として使用して、in vitroで臍帯血(UCB)HSPCを拡張しています23,24。以前の研究では、SR1とUM171の両方の組み合わせを使用していました25。培地の低分子およびサイトカインは、動員された成人HSPCおよび自家遺伝子治療におけるそれらの応用のために特別に最適化されました。スクリーニング実験によ...

同種異系移植環境におけるヒト白血球抗原(HLA)マッチングドナーへのアクセスの難しさと、汎用性が高く安全な遺伝子工学ツールの急速な開発により、自家造血幹細胞移植(HSCT)は遺伝性血液疾患の治癒的治療戦略となっています1,2。自家造血幹および前駆細胞(HSPC)遺伝子治療には、患者のHSPCの収集、遺伝子操作、疾患の原因となる突然変異の修正、および遺伝子修正されたHSPCの患者への移植が含まれます3,4。ただし、遺伝子治療の成功結果は、移植可能な遺伝子改変移植片の品質に依存しています。HSPCの遺伝子操作ステップとエクスビボ培養は、長期造血幹細胞(LT-HSC)の頻度を低下させることにより移植片の品質に影響を与え、大量の遺伝子操作HSPCの注入を必要とします2,5,6。
SR1およびUM171を含むいくつかの低分子は、現在、臍帯血HSPCを堅牢に拡張するために使用されています7,8。成人HSPCの場合、動員で得られる細胞収量が高いため、堅牢な拡張は必要ありません。しかし、分離されたHSPCの幹細胞性をex vivo培養で保持することは、その遺伝子治療アプリケーションにとって非常に重要です。そこで、レスベラトロール、UM729、SR1(RUS)7の低分子を組み合わせて造血幹細胞(HSC)の培養濃縮に焦点を当てたアプローチを開発しています。最適化されたHSPC培養条件は、造血幹細胞の濃縮を促進し、その結果、in vivoでの遺伝子改変造血幹細胞の頻度が増加し、大量のHSPCを遺伝子操作する必要性を減らし、費用対効果の高い遺伝子治療アプローチを促進します8。
ここでは、HSPC培養のための包括的なプロトコルを、 in vivoでの遺伝子編集細胞の注入と分析とともに説明します。

<table><tbody><tr><td>4D-ヌクレオフェクター&reg;Xユニット</td><td>ロンザバイオサイエンス</td><td>AAF-1003X</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector&trade;Xキット(16ウェルNucleocuvette&trade;ストリップ)</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD45 APC</td><td>BD BIOSCIENCE&nbsp;</td><td>555485&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>反ヒトCD13 PE</td><td>BDバイオサイエンス</td><td></td><td></td></tr>555394 <tr><td>反ヒトCD19 PerCP</td><td>BDバイオサイエンス</td><td></td><td></td></tr>340421 <tr><td>反ヒトCD3 PE-Cy7</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>557749</td><td></td></tr><tr><td>反ヒトCD90 APC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 561971 <tr><td>反ヒトCD133/1&nbsp;</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-113-673</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD34 PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 348057 <tr><td>抗マウス CD45.1 PerCP-Cy5</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>560580</td><td></td></tr><tr><td>血液照射器-2000</td><td>&nbsp;BRIT(インドバイオテクノロジー省)</td><td>BI 2000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養ディッシュ (デルタ表面処理 6 ウェルプレート)</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>140675 <tr><td>CrysoStor CS10</td><td>BioLife solutions</td><td>#07952</td><td></td></tr><tr><td>Busulfan</td><td>CELON LABS (60mg/10mL)</td><td>-&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ガイド-it 組換えCas9</td><td>タカラバイオ</td><td>632640</td><td></td></tr><tr><td>Cas9-eGFP</td><td>SIGMA</td><td>C120040&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;遠心分離管-15ml</td><td>CORNING</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;遠心分離管-50ml</td><td>NUNC(THERMO SCIENTIFIC)339652</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DMSO</td><td>MPBIO</td><td>219605590</td><td></td></tr><tr><td>DNAase</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>6469</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime;リン酸緩衝生理食塩水 - 1X</td><td>HYCLONE</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade;ヒトCD34ポジティブセレクションキット II</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>17856</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 磁石</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>電気泳動ユニット</td><td>ORANGE INDIA</td><td>HDS0036</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td></td><td></td></tr> 10270106 <tr><td>Flow cytometer &ndash;ARIA III</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>-&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>フロージョ&nbsp;</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>Flt3-L</td><td>PEPROTECH</td><td>300-19-1000</td><td></td></tr><tr><td>ゲルイメージングシステム</td><td>CELL BIOSCIENCES</td><td>11630453</td><td></td></tr><tr><td>HighPrep DTR 試薬</td><td>MAGBIOGENOMICS</td><td>DT-70005</td><td></td></tr><tr><td>Human BD Fc Block</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PEPROTECH</td><td>200-06-50</td><td></td></tr><tr><td>IMDMmedia</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>赤外線ランプ</td><td>MURPHY</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器 6mm 31G</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 324903 <tr><td>ケタミン</td><td>ケトミン 50</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ローディング色素 6X</td><td>TAKARA BIO</td><td>9156</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>7851</td><td></td></tr><tr><td>マウス レストレーナー</td><td>AVANTOR</td><td>TV-150</td><td></td></tr><tr><td>ナノドロップ分光光度計</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>ノイバウアー細胞計数室</td><td>ロヘムインスツルメンツ</td><td>CC-3073</td><td></td></tr><tr><td>NOD.CG-PRKDCSCID Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)</td><td>ジャクソン研究所</td><td>RRID:IMSR_JAX:005557</td><td></td></tr><tr><td>NOD,B6.SCID Il2r&gamma;&minus;/&マイナス;キットW41/W41 (NBSGW)</td><td>ジャクソン研究所</td><td>RRID:IMSR_JAX:026622</td><td></td></tr><tr><td>Nunc delta 6-well plate</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン丸底チューブ</td><td>BD</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>P3 初代細胞 核吸収溶液</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>PBP3-02250</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>FISHER SCIENTIFIC</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>PCRクリーンアップキット</td><td>TAKARA BIO</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Pie Cage</td><td>FISCHER SCIENTIFIC</td><td>50-195-5140</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン丸底チューブ (12 x 75 mm)</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>38007</td><td></td></tr><tr><td>Primer3</td><td>Whitehead Institute for Biomedical Research</td><td><a href="https://primer3.ut.ee/">https://primer3.ut.ee/</a></td><td></td></tr><tr><td>クイックエクストラクト&トレード;DNA抽出ソリューション</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td></td></tr><tr><td>Reserveratrol</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72862</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>300-07-1000</td><td></td></tr><tr><td>SFEM-II</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>9655</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA</td><td>SYNTHEGO-&</td><td>nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SPINWIN</td><td>TARSON</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StemReginin 1</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72342</td><td></td></tr><tr><td>ICE分析ツール</td><td>SYNTHEGO</td><td><a href="https://ice.synthego.com/">https://ice.synthego.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA緩衝液(TE) 1X</td><td>SYNTHEGO</td><td>gRNA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td>APPLIED BIOSYSTEMS</td><td>4375305</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PEPROTECH</td><td>300-18-1000</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>HIMEDIA LABS</td><td>TCL046</td><td></td></tr><tr><td>UM171</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72914</td><td></td></tr><tr><td>UM729</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72332</td><td></td></tr><tr><td>キシラ</td><td>ジン キシラキシン - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝子治療アプリケーションのための造血幹細胞および前駆細胞のcrispr/cas9遺伝子編集

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9は、さまざまな遺伝子変異を修正するために広く採用されている、汎用性が高く効率的な遺伝子編集ツールです。造血幹および前駆細胞(HSPC)のin vitro での遺伝子操作の実現可能性により、HSPCは遺伝子治療の理想的な標的細胞になります。しかし、HSPCは、 ex vivo 培養において生着および多系統再増殖の可能性を適度に失う。本研究では、HSPCの生着を改善し、 in vivoで遺伝子改変細胞の数を増加させる理想的な培養条件について説明します。現在のレポートには、培地の種類、独自の低分子カクテルの補給、サイトカイン濃度、細胞培養プレート、培養密度など、最適化された in vitro 培養条件が表示されます。それに加えて、最適化されたHSPC遺伝子編集手順と、遺伝子編集イベントの検証が提供されます。 in vivo 検証のために、マウスレシピエントにおける遺伝子編集HSPC注入および生着後分析が表示されます。結果は、培養系がin vitroで機能的な造血幹細胞の頻度を増加させ、その結果 、in vivoで遺伝子編集細胞の強力な生着をもたらすことを実証しました。

本研究では、エクスビボ培養におけるCD34 + CD133 + CD90 + HSCの保持を促進する理想的なHSPC培養条件を特定します。遺伝子改変造血幹細胞の増強とともに造血幹細胞の培養濃縮を実証するために、PBMNC単離、CD34+細胞精製、培養、遺伝子編集、移植、生着の特性評価、およびin vivoでの遺伝子改変細胞のための最適化された手順が提供されています(図1)。精製後、HSPCマーカーを確認するためにフローサイトメトリー評価を行い、HSPCを72時間培養した。培養72時間後、HSPCをCas9 RNPで核形成し、さらに2日間培養した。RUSカクテルを含む最適化された培養条件は、CD34+CD133+CD90+ HSCの生存率の増加と頻度の増加、および遺伝子編集頻度の増加を示しました(図2)。最適化された培養条件が...

本プロトコルは、 in vivoでの遺伝子編集細胞の堅牢な生着のために最適化された造血幹および前駆細胞(HSPC)培養手順を記載しています。

遺伝子治療アプリケーションのための造血幹細胞および前駆細胞のCRISPR/Cas9遺伝子編集

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

生体外培養は、造血幹および前駆細胞の再増殖の可能性を妨げる可能性があります。私たちのプロトコルは、培養中に幹細胞性を維持し、したがって、in vivoでの遺伝子改変細胞の頻度を改善します。造血幹細胞遺伝子治療は現在、単一遺伝子疾患やHIVなどの感染症に採用されています。HSPC遺伝子治療プロトコルは、生体外培養に大きく依存しています。私たちのプロトコルは、ex vivo培養を使用するあらゆる手順と互換性がある必要があります。このプロトコルを実証するのは、私の研究室の博士課程の学生であるVigneshwaran Venkatesanです。HSPCを単離した後、サイトカインおよび低分子レスベラトロール、UM729、およびStemRegenin1を含む幹細胞培養培地で培養します。遺伝子編集の前に、サーモミキサーを摂氏 37 度に設定してガイド RNA を再構成し、TE バッファーを摂氏 37 度で 10 分間予熱します。合成化学修飾sgRNAバイアルを摂氏4度で1分間11, 000倍gで遠心分離し、1.5ナノモルの凍結乾燥sgRNAを含むバイアルに15マイクロリットルのTEバッファーを加え、穏やかな旋回で混合して、マイクロリットルあたり100ピコモルの最終濃度を得ます。バイアルをサーモミキサーで、摂氏37度で30〜40秒間最小限の振とうでインキュベートします。バイアルの側面を軽くたたき、バイアルを回転させて15マイクロリットルのsgRNAを収集します。1マイクロリットルのアリコートを作り、摂氏マイナス80度で最長1年間保管します。ヌクレオフェクションの場合は、室温で200倍gで5分間遠心分離することにより10個目の細胞を2回〜5個目にペレット化する。上清が廃棄されたら、ペレットを20マイクロリットルのバッファーに再懸濁します。気泡を避けて、細胞懸濁液を調製したRNP複合体と穏やかに混合する。次に、懸濁液を市販のヌクレオフェクションストリップに移し、パルスコードDZ-100を選択して4D-Nucleofectorを使用して細胞をエレクトロポレーションします。ニュークレオフェクションストリップ内のエレクトロポレーションされた細胞に、100マイクロリットルのプレインキュベート培養培地を加え、細胞を室温で10分間乱さないままにします。インキュベーションの最後に、実験要件に従って内容物を培養プレートに移します。HSPC移植の6〜8時間前にNSGマウスをパイケージに入れます。市販の照射器を用いて3.5グレイのマウスに照射する。NBSGWの場合、HSPC移植の48時間前に体重1キログラムあたり12.5ミリグラムの用量でブスルファンを腹腔内注射することにより、6〜8週齢の雄および雌マウスを予め条件付けた。1匹のマウスを注入する場合は、200倍gで5分間遠心分離することにより1.5ミリリットルのチューブに10〜5番目の細胞を6回ペレット化する。室温で。ペレットを乱すことなく上清を静かにピペットで取り出し、細胞ペレットを100マイクロリットルのPBSに再懸濁します。予め調整したNSGまたはNBSGWマウスをマウス拘束装置に入れ、尾静脈注射によってHSPCを注入します。マウスの尾を持ち、プラグをそっと押してマウスを拘束します。マウスの尾を70%エタノールでそっと拭きます。31ゲージのインスリンシリンジを使用して、100マイクロリットルの細胞懸濁液を吸引する。次に、赤外線ランプからの光を30〜40秒間尾に向け、マウスの体の領域をティッシュペーパーのひだで覆います。シリンジで尾をプレーナー軸に維持するには、左人差し指で持ち上げます。針の斜角部分を左右の尾尾静脈に20度の角度でそっと挿入します。プランジャーを押して細胞懸濁液を静脈に注入し、ティッシュペーパーで穴を開けた領域の近くに穏やかな圧力をかけ、針を引き抜きます。麻酔後、動物を腹側横臥状態に置き、マウスをそっとこすって目を開き、目の球がわずかに突き出るようにします。牧草ピペットを30〜45度の角度で、ニクテーティング膜の下の目の内側眼窩にそっと挿入します。パスツールピペットを適切な位置に置いた後、チューブにわずかな圧力を加え、チューブを穏やかに回転させ始めます。50〜80マイクロリットルの末梢血を採取した後、眼の内側眼窩からピペットを静かに引き出します。安楽死後、尿道の1センチメートル上に垂直切開を行い、横隔膜から1センチメートル下まで伸ばします。切開部の角を水平に切り、腹部を開きます。大腿骨と脛骨を解剖した後、ハサミを使用して大腿骨と脛骨に付着した軟組織を取り除き、ティッシュペーパーで骨をそっとこすります。メスを使用して、0.5ミリリットルの微量遠心チューブの底に直径0.2センチメートル以下の小さな穴を開けます。メスで骨の近位端を取り除き、切断面を0.5ミリリットルの微小遠心チューブの穴に向けて骨を置きます。次に、100マイクロリットルの滅菌PBSを含む1.5ミリリットルのチューブに骨を入れた0.5ミリリットルのチューブを置きます。蓋を閉め、室温で無菌条件下で200倍gで3分間チューブを回転させ、骨髄腔が空の骨を含む0.5ミリリットルのチューブを廃棄する。骨髄を含む1.5ミリリットルの反応管に、1ミリリットルのPBSを加え、次に1ミリリットルのピペットを使用して、細胞を10回静かに再懸濁します。1ミリリットルの細胞懸濁液を、9ミリリットルのRBC溶解バッファーを含む15ミリリットルのチューブに移します。2分ごとにチューブを静かに反転させて、細胞を氷中で7分間インキュベートします。インキュベート後、チューブを室温で200倍gで5分間遠心分離し、透明な淡い白色ペレットが観察されるまで洗浄を繰り返します。生細胞およびCD34陽性、CD90陽性細胞の頻度は、核放出の48時間後にRUS群において増加した。72時間後、DMSO治療群と比較して、RUS治療群でインデルの割合と頻度が増加し、遺伝子編集の増加が示唆されました。CD34陽性、CD90陽性細胞、および総有核細胞の絶対数は、編集後48時間で有意に高くなっています。NSGマウスのヒトCD45陽性細胞のフローサイトメトリー分析では、培養条件での生着の増加が示されました。マウスBM細胞における遺伝子編集頻度の分析は、RUS添加培養条件における遺伝子編集HSPCの生着の増加を示した。HSPCを1mLあたり200, 000細胞の合流点で培養することは、機能的な幹細胞を改善するために重要です。臍帯血幹細胞とiSPC由来幹細胞の増幅は、このプロトコルがテストされている新しい領域です。

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学ぶ造血幹細胞および前駆細胞のCRISPR/Cas9遺伝子編集法。サイトカインと小分子を用いた培養条件で幹細胞性を保持し、遺伝子修飾細胞の生体内移植効率を向上させる最適化プロトコルを解説する。

遺伝子治療アプリケーションのための造血幹細胞および前駆細胞のCRISPR/Cas9遺伝子編集

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