Name: カスタマイズされた灌流バイオリアクターにおけるブタ血管化フラップの調達と灌流-脱細胞化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 学ぶ ブタの血管化フラップの外科的採取と灌流脱細胞化の手法。カスタマイズされたバイオリアクターを用いて、組織工学と再建外科における多様な血管化組織の脱細胞化を実現します。

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<ol><li>Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+Forearm+Flap+Donor-Site+Complications+and+Morbidity%3A+A+Prospective+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).</li>
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<li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).</li>
<li>Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+systems+and+devices%3A+State-of-the-art%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularization systems and devices: State-of-the-art.</a> Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).</li>
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著者は開示する利益相反を持っていません。

提案されたプロトコルは、低濃度SDSの灌流を使用して、ブタ由来のフラップの範囲を脱細胞化します。この手順により、低濃度SDSを支持するプロトコルを使用して、無細胞大網、テンソル筋膜ラタ、および橈骨前腕フラップを正常に脱細胞化できます。予備的な最適化実験により、2日から5日の間の低濃度(0.05%)のSDSは、組織学的手法で分析した場合、大網、大動脈筋膜、および橈骨前腕皮弁の細胞物質を除去できることがわかりました(補足図1、補足図2、補足図3)。この方法は、短期間でリーズナブルなコストで脱細胞化を達成する簡単なアプローチを提供します。私たちの経験では、ブタフラップの脱細胞化と滅菌には2〜5日かかり、密度の高い組織(例:.、5日の前腕皮膚対2日の大網)には、より長い期間の脱細胞化が必要です。さらに、このプロトコルで使用される低濃度のSDSは、0.05%の低濃度のSDSがSDSの臨界ミセル濃度(約0.2%21)を下回り、したがって界面活性剤が重要な生理活性ECM成分をそのまま残しながら細胞膜を効果的に可溶化できるという理論的根拠に基づいて選択されました。このプロ...

外傷性損傷および腫瘍除去は、大きくて複雑な軟部組織の欠陥を引き起こす可能性があります。これらの欠陥は、患者の生活の質を損ない、機能の喪失を引き起こし、永続的な障害を引き起こす可能性があります。自家組織フラップ移植などの技術が一般的に実施されてきましたが、フラップの利用可能性とドナー部位の罹患率に関する問題は大きな制限です1、2、3。血管化複合同種移植(VCA)は、筋肉、皮膚、血管系などの複合組織を単一のユニットとしてレシピエントに移す有望な代替手段です。しかし、VCAは長期的な免疫抑制を必要とし、それは薬物毒性、日和見感染、および悪性腫瘍につながります4,5,6。
組織工学的無細胞足場は、これらの制限に対する潜在的な解決策です7。非細胞組織足場は、基礎となる細胞外マトリックス(ECM)マイクロアーキテクチャを維持しながら、天然組織から細胞物質を除去する脱細胞化法を使用して得ることができる。組織工学における合成材料の使用とは対照的に、生物学的に誘導された足場の使用は、生体適合性および臨床翻訳の可能性を可能にする生体模倣ECM基質を提供する8。脱細胞化に続いて、レシピエント特異的細胞を用いた足場のその後の再細胞化は、免疫原性がほとんどまたはまったくない機能的な血管新生組織を生成することができる9,10,11。灌流脱細胞化技術を使用して無細胞組織を得るための効果的なプロトコルを開発することにより、幅広い組織タイプを操作できます。次に、この技術に基づいて構築することで、より複雑な組織への適用が可能になります。これまでに、げっ歯類12、ブタ13、ヒトモデル14の全層筋膜皮膚皮弁などの単純な血管新生組織、ならびにブタ腹直筋骨格筋15を用いて、血管化軟組織の灌流脱細胞化が研究されてきた。さらに、複雑な血管新生組織は、ブタおよびヒト耳16、17モデルおよびヒト全面移植モデル18において実証されるように灌流脱細胞化もされている。
ここでは、プロトコルは、生物学的に誘導されたECM足場を用いた血管化遊離フラップの脱細胞化を記載する。臨床的に関連する3つのフラップの脱細胞化を提示します:1)大網、2)テンソル筋膜ラタ、および3)橈骨前腕、これらはすべて再建手術で日常的に使用される主力フラップの代表であり、組織脱細胞化の文脈の中で動物実験で以前に調べられていませんでした。これらのバイオエンジニアリングフラップは、汎用性が高く、すぐに利用できるプラットフォームを提供し、大きな軟部組織の欠陥の修復と再建の分野で使用するための臨床応用の可能性を秘めています。

<table><tbody><tr><td>0.2 &マイクロ;m細孔Acrodisk</td><td>フィルターVWR</td><td>CA28143-310</td><td></td></tr><tr><td>0.9 % 塩化ナトリウム溶液(通常の生理食塩水)</td><td>Baxter</td><td>JF7123</td><td></td></tr><tr><td>20 Lポリプロピレンカーボー</td>イ<td>コールパー</td><td>マーRK-62507-20</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Sofsilk非吸収性外科用ネクタイ</td><td>Covidien</td><td>&nbsp;LS639</td><td></td></tr><tr><td>3ウェイストップコック</td><td>コールパー</td><td>マーUZ-30600-04</td><td></td></tr><tr><td>広告鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌溶液、100X</td><td>Wisent450-115-EL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アトロピン硫酸塩15mg / 30ml</td><td>垂木8製品</td><td>238481</td><td></td></tr><tr><td>BD血管20ゲージ</td><td>VWR</td><td>BD381134</td><td></td></tr><tr><td>BD Angiocath 22-Gauge</td><td>VWR</td><td>BD381123</td><td></td></tr><tr><td>BD Angiocath 24-Gauge</td><td>VWR</td><td>BD381112</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td> ウシ膵臓由来の <td>DNAse 補因子</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 10X</td><td>Wisent</td><td>311-415-CL&</td><td>nbsp;Ca++/Mg++</td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン、1000 I.U./mL</td><td>Leo Pharma A/S</td><td>453811</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine Hydrochloride&nbsp; 5000 mg/50 ml</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>612316 Ismatec ポンプ タイゴン 3 ストップ チューブ</td><td>コールパーマー</td><td>RK-96450-40</td><td>内径:&nbsp; 1.85 mm</td></tr><tr><td>Ismatec REGLO 4 チャンネル ポンプ</td><td>コールパーマー</td><td>78001-78</td><td></td></tr><tr><td>イスマテック チューブ カセット</td><td>コールパーマー</td><td>RK-78016-98</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン 99.9%、250 ml</td><td>カナダ製薬パートナーズ</td><td></td><td></td>2231929</tr><tr><td>LB 寒天 レノックス</td><td>バイオショップ カナダ</td><td>LBL406.500</td><td>無菌試験寒天プレート</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>DNAse 補因子</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 16 チューブ</td><td>コールパーマー</td><td>RK-96410-16</td><td></td></tr><tr><td>ミダゾラム 50 mg/10 ml</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td></td><td></td>2242905</tr><tr><td>モノポーラ 焼灼ペンシル</td><td>Valleylab</td><td>E2100</td><td></td></tr><tr><td>ノーマル バッファード ホルマリン、10%</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>N&deg;11メスの刃</td><td>スワン・モートン</td><td>303</td><td></td></tr><tr><td>パパイヤラテックスからのパパイン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P3125</td><td></td></tr><tr><td>過酢酸</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>269336</td><td></td></tr><tr><td>1/4 インチから 1/8 インチのプラスチック有刺鉄線コネクタ</td> マク<td>マスター・カー</td><td>5117K61</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック有刺鉄線チューブ 90&deg;エルボーコネクター</td><td>McMaster-Carr</td><td>5117K76</td><td></td></tr><tr><td>プラスチッククイックターンチューブプラグ</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K143</td><td>オス ルアー</td></tr><tr><td>プラスチッククイックターンチューブソケット</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K293</td><td>メス ルアー</td></tr><tr><td>パンチ生検ツール</td><td>インテグラ ミルテックス</td><td>3332</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム 40 mEq/20 ml</td><td>ホスピーラ ヘルスケア コーポレーション</td><td>37869</td><td></td></tr><tr><td>ポビドン-ヨウ素、10%</td><td>Rougier</td><td>833133</td><td></td></tr><tr><td>Serological Pipet、2mL</td><td>Fisher Science</td><td>13-678-27D</td><td></td></tr><tr><td>スナップ蓋 気密容器</td><td>SnapLock</td><td>142-3941-4</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>外科用金属結紮クリップ、小型</td><td>テレフレックス</td><td>001200</td><td></td></tr><tr><td>スティーブンス腱切開はさみ、115 mm、ストレート</td><td>B. Braun</td><td>BC004R</td><td></td></tr><tr><td>TruWave 圧力監視セット</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>PX260</td><td></td></tr></tbody></table>

カスタマイズされた灌流バイオリアクターにおけるブタ血管化フラップの調達と灌流-脱細胞化

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

大量の軟部組織の欠陥は機能障害につながり、患者の生活の質に大きな影響を与える可能性があります。外科的再建は、自家遊離皮弁移植または血管新生複合同種移植(VCA)を用いて行うことができるが、そのような方法には欠点もある。ドナー部位の罹患率や組織の利用可能性などの問題は、自家の自由皮弁移植を制限しますが、免疫抑制はVCAの重要な制限です。脱細胞化/再細胞化法を用いた再建手術における人工組織は、可能な解決策を表しています。脱細胞化組織は、基礎となる細胞外マトリックス(ECM)マイクロアーキテクチャを維持しながら、天然の細胞物質を除去する方法を使用して生成されます。これらの無細胞足場は、その後、レシピエント特異的細胞で再細胞化することができる。
このプロトコルは、ブタモデルで無細胞足場を達成するために使用される調達および脱細胞化方法を詳述している。さらに、灌流バイオリアクターの設計とセットアップの説明も提供します。フラップには、ブタ大網、テンソル筋膜ラタ、および橈骨前腕が含まれます。脱細胞化は、低濃度ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)洗剤の ex vivo 灌流とそれに続くDNase酵素処理およびカスタマイズされた灌流バイオリアクターでの過酢酸滅菌によって行われます。
成功した組織脱細胞化は、巨視的にフラップの白色不透明な外観によって特徴付けられる。無細胞フラップは、組織学的染色で核が存在しないこと、およびDNA含有量の有意な減少を示す。このプロトコルは、ECMおよび血管マイクロアーキテクチャが保存された脱細胞化軟部組織足場を生成するために効率的に使用できます。このような足場は、その後の再細胞化研究に使用することができ、再建手術における臨床翻訳の可能性を秘めています。

血管化されたブタフラップを脱細胞化するためのこのプロトコルは、カスタマイズされた灌流バイオリアクター内のフラップ血管系を介したイオンベースの洗剤SDSの灌流に依存しています。脱細胞化に先立ち,ブタ模型の3つの血管化フラップを調達し,主供給容器に従ってカニューレ挿入した。フラップは、特許、灌流可能な血管系を維持するために、調達後すぐにフラッシュされ、脱細胞化が成功しました。気密スナップ蓋容器を使用して、カスタマイズされたバイオリアクターは、密閉された環境内でフラップ灌流を可能にするように設計されました。バイオリアクター内のフラップの灌流は、組織チャンバーに接続された2つの蠕動ポンプを使用してシングルパス方式で達成されました。灌流圧力はインライン圧力センサーで監視した。
脱細胞化中、SDS曝露の持続時間は、処理される組織の種類に依存していた。記載された灌流脱細胞化技術を用いて、大網、テンソル筋膜、および橈骨前腕フラップを、それぞれ0.05%SDSで2日間、3日間、および5日間脱細胞化した。脱細胞化後の滅菌の成功は、フラップを拭き取り、寒天プレート上で綿棒を14日間培養した後、微生物コロ...

プロトコルは、カスタマイズされた灌流バイオリアクター内のフラップ血管系を介したドデシル硫酸ナトリウム界面活性剤の灌流による血管化ブタフラップの外科的調達とその後の脱細胞化について説明しています。

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

この方法は、3つの血管新生ブタフラップの外科的調達およびそれに続く灌流脱細胞化を記載する。この方法は、組織の脱細胞化および再細胞化アプローチを使用してブタフラップを再生する取り組みを支援することができます。この技術の主な利点は、組み立てが簡単なバイオリアクターセットアップで、さまざまな血管化されたブタフラップにわたって大量の脱細胞化を達成できる汎用性です。ここで説明する技術は、再建手術におけるブタフラップを使用する潜在的な組織工学ソリューションとして、他の血管化フラップに広く適用できます。まず、LS50プラチナコーティングされたシリコンチューブを約16センチメートル測定して、流入チューブと流出チューブを作成します。一方の端を黄色の3ストップポンプチューブに接続し、もう一方の端を滅菌2ミリリットルの血清学的ピペットに接続して、灌流液を洗剤リザーバーからバイオリアクターチャンバーに運びます。チャンバーとチューブを個包装された滅菌包装でオートクレーブします。大網フラップの調達のために、12週齢の麻酔をかけたヨークシャー豚を仰臥位に置き、通常の無菌状態で腹部を準備します。剣状臍帯開腹術を行って腹部に入り、胃頭筋を動員し、大網を手術野に入れます。左胃大網動脈が脾動脈に結合する大曲率の左側から始めて、まっすぐなスティーブンス腱切開ハサミを使用して左胃大網動脈と静脈を骨格化します。次に、外科用タイまたはクリップを使用して両方を別々に結紮および分割します。胃の大きな湾曲に沿って左から右に進み、大網から生じる短い血管枝を結紮して分割し、胃のより大きな湾曲を供給します。右胃大網血管と胃十二指腸動脈の接合部に遭遇するまで、大網の動員を続ける。次に、右胃大網動脈と静脈を結紮して分割し、大網フラップを解放し、後でフラップカニューレ挿入を可能にします。テンソル筋膜ラタフラップの調達では、ブタを外側褥瘡の位置に置きます。前上腸骨棘(ASIS)から外側膝蓋骨に向かって内側のフラップ境界をマークし、尾側に約8〜10センチメートルの後方境界をマークします。メスを使用して、膝蓋骨の遠位縁を鋭く切開します。皮下組織を通して切開を深め、大腿直筋を覆う筋膜に到達し、マークされた境界に沿ってASISに向かって切開を続けます。筋膜フラップのみを分離するには、下にある筋膜層から上にある皮膚成分を取り除きます。次に、小さな穿孔血管を皮膚に結紮または焼灼します。フラップの遠位境界に戻り、深い筋膜を切開します。下にある外側広筋から筋膜をASISに向かって動員します。椎弓根を大腿骨深部血管に向かってなぞった後、筋膜フラップを供給する外側回旋大腿動脈と静脈を骨格化します。次に、フラップ血管を近位に結紮して分割し、そこで深部大腿血管に結合し、後でカニューレ挿入できるようにします。放射状の前腕フラップを調達する場合は、伸

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

灌流細胞化は、臓器の細胞外マトリックスの組成とマイクロアーキテクチャを保持する全体の肝臓の足場を生成する新規な手法です。ここで、肝細胞で灌流細胞化およびその後の再投入を使って臓器全体の足場を準備する方法について説明する。機能性と移植肝移植は、このテクニックを使用して生成することができます。...

全肝臓の細胞化とRecellularization

迅速かつ完全に逆行灌流を通して無傷ブタ心臓から細胞成分を除去するための方法が記載されている。この方法は、複数の臨床アプリケーションで使用するための可能性を秘めているサイト固有心筋細胞外マトリックス足場が得られます。...

逆行性冠灌流によってブタ心臓の脱細胞化するための手順

全臓器の脱細胞化は、再生医療に使用できる可能性のある天然の生物学的足場を生成します。肺全体の細胞が脱細胞化され、血管循環と液体媒体の換気を促進するバイオリアクターで成体幹細胞と内皮細胞が播種される肺再生の非ヒト霊長類モデルの説明が提示されます。...

非ヒト霊長類の肺脱細胞化と特殊大型臓器バイオリアクターを用いた再細胞化

ここでは、二重播種部分的人工多能性幹細胞がマウスにグラフトするための機能的な組織工学血管移植片を生成するためのプロトコルを提示する（PiPSC）は - 脱細胞化血管足場バイオリアクターに由来内皮細胞 - 平滑筋細胞およびPiPSC由来。...

マウスモデルにおける組織工学血管の生成とグラフト

今日まで、厚い組織の欠陥は通常、自家組織フラップまたは人工組織を適用することによって再構築されています。このプロトコルでは、自家皮弁の代わりとして機能するために、自家椎弓根を持つ血管新生組織皮弁をエンジニアリングするための新しい方法を提示します。...

操作された血管柄マッスルフラップ

私たち独自のデバイスを使用した肝臓採取、カニューレ挿入、灌流のための提示された技術は、ラット肝臓の脱細胞化と再細胞化実験を改善するための洗練された灌流セットアップを可能にします。...

振動圧力潅流装置内のラット肝臓の脱細胞化のための手順

本プロトコルは、ブタ筋膜皮膚皮弁モデルおよび血管新生複合組織研究におけるその潜在的な使用について説明しています。...

血管化複合同種移植片バイオエンジニアリング研究のための信頼性の高いブタ筋膜皮膚フラップモデル

複合ラット後肢の手術手技と脱細胞化プロセスについて説明します。脱細胞化は、 ex vivo マシン灌流システムを介して低濃度ドデシル硫酸ナトリウムを使用して行われます。...

血管化複合同種移植のための 生体外 灌流ベースのバイオリアクターを用いたラット後肢の調達と脱細胞化

このプロトコルは、灌流中の血管の ex vivo 培養のために、新たに開発された3Dプリントされたバイオリアクターのセットアップと操作を示しています。このシステムは、他のユーザーが簡単に採用できるように設計されており、実用的で手頃な価格で、基礎生物学や薬理学的研究などのさまざまな実験アプリケーションに適応できます。...

Ex Vivo(エクス・ビボ )3Dプリントされたバイオリアクターでの大血管の灌流培養

ここでのプロトコルは、同種移植片の ex vivo 灌流を利用した循環死後の提供後の心臓移植の高忠実度ブタモデルについて説明しています。...

循環器死後の提供後の同所性心臓移植の高忠実度ブタモデル

このプロトコルは、実験研究を目的とした、深部下腹上動脈脚に基づくヒト穿孔皮弁モデルの外科的収穫技術を説明しています。...

血管化複合同種移植および遊離フラップの保存戦略を調査するための実験的ヒトDIEPフラップモデル

学ぶ ブタの血管化フラップの外科的採取と灌流脱細胞化の手法。カスタマイズされたバイオリアクターを用いて、組織工学と再建外科における多様な血管化組織の脱細胞化を実現します。

カスタマイズされた灌流バイオリアクターにおけるブタ血管化フラップの調達と灌流-脱細胞化

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