カスタマイズされた灌流バイオリアクターにおけるブタ血管化フラップの調達と灌流-脱細胞化

この方法は、3つの血管新生ブタフラップの外科的調達およびそれに続く灌流脱細胞化を記載する。この方法は、組織の脱細胞化および再細胞化アプローチを使用してブタフラップを再生する取り組みを支援することができます。この技術の主な利点は、組み立てが簡単なバイオリアクターセットアップで、さまざまな血管化されたブタフラップにわたって大量の脱細胞化を達成できる汎用性です。

ここで説明する技術は、再建手術におけるブタフラップを使用する潜在的な組織工学ソリューションとして、他の血管化フラップに広く適用できます。まず、LS50プラチナコーティングされたシリコンチューブを約16センチメートル測定して、流入チューブと流出チューブを作成します。一方の端を黄色の3ストップポンプチューブに接続し、もう一方の端を滅菌2ミリリットルの血清学的ピペットに接続して、灌流液を洗剤リザーバーからバイオリアクターチャンバーに運びます。

チャンバーとチューブを個包装された滅菌包装でオートクレーブします。大網フラップの調達のために、12週齢の麻酔をかけたヨークシャー豚を仰臥位に置き、通常の無菌状態で腹部を準備します。剣状臍帯開腹術を行って腹部に入り、胃頭筋を動員し、大網を手術野に入れます。

左胃大網動脈が脾動脈に結合する大曲率の左側から始めて、まっすぐなスティーブンス腱切開ハサミを使用して左胃大網動脈と静脈を骨格化します。次に、外科用タイまたはクリップを使用して両方を別々に結紮および分割します。胃の大きな湾曲に沿って左から右に進み、大網から生じる短い血管枝を結紮して分割し、胃のより大きな湾曲を供給します。

右胃大網血管と胃十二指腸動脈の接合部に遭遇するまで、大網の動員を続ける。次に、右胃大網動脈と静脈を結紮して分割し、大網フラップを解放し、後でフラップカニューレ挿入を可能にします。テンソル筋膜ラタフラップの調達では、ブタを外側褥瘡の位置に置きます。

前上腸骨棘(ASIS)から外側膝蓋骨に向かって内側のフラップ境界をマークし、尾側に約8〜10センチメートルの後方境界をマークします。メスを使用して、膝蓋骨の遠位縁を鋭く切開します。皮下組織を通して切開を深め、大腿直筋を覆う筋膜に到達し、マークされた境界に沿ってASISに向かって切開を続けます。

筋膜フラップのみを分離するには、下にある筋膜層から上にある皮膚成分を取り除きます。次に、小さな穿孔血管を皮膚に結紮または焼灼します。フラップの遠位境界に戻り、深い筋膜を切開します。

下にある外側広筋から筋膜をASISに向かって動員します。椎弓根を大腿骨深部血管に向かってなぞった後、筋膜フラップを供給する外側回旋大腿動脈と静脈を骨格化します。次に、フラップ血管を近位に結紮して分割し、そこで深部大腿血管に結合し、後でカニューレ挿入できるようにします。

放射状の前腕フラップを調達する場合は、伸ばした豚の前腕の放射状の側面に3 x 3センチメートルの正方形をマークします。近位フラップマージンの中点と肘前窩の間に線を引き、橈骨動脈茎のおおよその経過を示します。触診で動脈の経過を確認します。

次に、上腕前筋膜までの深さの遠位側でメスを使用して皮膚を切開します。遠位橈骨動脈とその大静脈に遭遇するまで、腱切開ハサミで鈍く解剖します。次に、動脈と静脈を外科用タイまたはクリップで結紮して分割します。

マークされた皮膚の正方形の橈骨および尺骨縁の皮膚切開を続けます。次に、下にある橈骨からフラップを手術用ブレードまたは焼灼器で動員し、尺骨から橈骨方向に進み、皮膚フラップを肘前窩に向かって近位に上げます。腱切開ハサミを使用して、橈骨動脈と大静脈を肘前窩で近位に骨格化し、そこでそれぞれ上腕動脈と静脈に結合します。

周囲の線維脂肪組織から血管を解剖して、血管茎を分離します。次に、動脈と静脈を別々に結紮して分割し、橈骨前腕フラップを解放します。次に、3-0の絹のネクタイで固定された20〜24ゲージの血管カテーテルで椎弓根血管をカニューレします。

明確な静脈流出が観察されるまで、ヘパリン化生理食塩水をフラップ動脈カニューレに洗い流します。.層流バイオセーフティキャビネットで作業しながら、バイオリアクター組織チャンバーにフラップを配置します。滅菌ヘパリン処理生理食塩水を使用したプライム流入チューブは、残留空気を除去し、フラップ動脈カニューレとオスルアーコネクタを接続できるようにフラップを配置します。

次に、滅菌止血剤を使用して、動脈カニューレをコネクタにねじ込みます。次に、ヘパリン処理生理食塩水を活栓に通して、ルアー接続に漏れがないこと、およびフロップに静脈流出の証拠を灌流できることを確認します。ティッシュチャンバーの蓋を閉じた後、黄色の3ストップポンプチューブを備えた流入チューブをティッシュチャンバーの流入活栓に接続します。

また、流入3方向活栓にインライン圧力センサトランスデューサを取り付けて、灌流圧力を監視します。次に、流入蠕動ポンプをオンにし、初期画面で矢印を使用して3番目のタブに移動し、チューブIDを1.85ミリメートルに設定します。次に、2番目のタブから灌流率を設定します。

配送モードとしての入力レートは、毎分2ミリリットルに設定されています。フローの方向が画面に表示されているとおりに正しいことを確認します。互換性のあるカセットを使用して、3ストップポンプチューブを蠕動ポンプにロードします。

流出ポンプの設定を毎分4ミリリットルの速度に設定します。黄色の3ストップポンプチューブを備えた流出チューブをティッシュチャンバーの流出活栓に接続します。次に、3ストップポンプチューブを蠕動ポンプにロードし、各ポンプの電源ボタンを押して両方のポンプの流れを開始します。

組織室でヘパリン化生理食塩水でフラップの灌流脱細胞化を15分間開始し、保持された血栓を除去します。完了したら、残りの生理食塩水を500ミリリットルのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の脱細胞化溶液と交換して、フラップを沈めます。次に、流入チューブをSDS溶液に移し、組織を大量に注入します。

SDS脱細胞化後、残りのSDSを吸引してから、フラップをPBSで1日間灌流します。SDS灌流脱細胞化後、フラップをDNA溶液で2時間、PBSで1日間順次灌流した後、流入チューブを蒸留水中の過酢酸とエタノールに移し、3時間灌流してフラップを滅菌します。完了したら、フラップを無菌的に取り外し、1%抗生物質抗真菌剤を含むPBSの2回の洗浄にそれぞれ15分間浸します。.

再セル化の準備ができるまで、フラップを摂氏4度で保管します。3〜10ミリメートルのパンチ生検ツールを使用して、脱細胞化フラップを評価するための組織サンプルを取得します。手動制御下でフラッシュされた単離された脱細胞化フラップは、大網、テンソル筋膜、および橈骨前腕フラップの自由に排出される静脈カニューレからの流出の証拠を示しました。

在来大網、テンソル筋膜ラタ、および橈骨前腕フラップの肉眼的形態は、調達直後にピンク色に見えました。比較すると、脱細胞化組織は、外観が特徴的に白色または不透明であった。ヘマトキシリンおよびエオシンを用いた天然組織の組織学的検査は、青色核の存在を示した。

脱細胞化フラップでは、組織学的染色により、青色核染色なしで細胞物質の喪失が明らかになり、無細胞組織足場が示されました。DNA含有量の追加定量は、天然組織と比較して無細胞足場のDNAの有意な減少を示した。最も重要な考慮事項は、調達中に使用される外科的技術であり、その後の灌流脱細胞化を可能にするためにフラップ茎の損傷を避けるように注意する。

灌流脱細胞化に続いて、得られたフラップは、天然の組織区画を再生するために組織特異的細胞集団で再細胞化され得る。