Name: げっ歯類の心臓におけるウイルス導入遺伝子発現と心不整脈リスクの評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: 学ぶウイルス導入による遺伝子発現と心不整脈リスク評価法。ラットとマウスの心臓に超音波ガイド下で直接注射し、Langendorff灌流と電気刺激で心室不整脈の感受性を評価する最小侵襲技術です。

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この研究は、カナダ衛生研究所(CIHR)プロジェクト助成金(PJT-148918およびPJT-180533、WL)、CIHR早期キャリア研究者賞(AR8-162705、WL)、カナダ心臓脳卒中財団(HSFC)マクドナルド奨学金および新研究者賞(S-17-LI-0866、WL)、学生奨学金(JWおよびYXへ)、およびオタワ大学心臓基金からのポスドクフェローシップ(ALへ)心臓研究所。著者は、リチャード・シーモア氏の技術サポートに感謝します。 図 2 は、承認されたライセンスを持つ Biorender.com で作成されました。

記載されているすべての方法と手順は、オタワ大学の動物研究倫理審査委員会およびオタワ大学心臓研究所のバイオセーフティ審査委員会によって承認されました。開発された安全プロトコルには、組換えアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)を扱うすべての手順がレベルIIのバイオセーフティキャビネットで実行されたことが含まれます。実験後、ウイルスと接触したすべてのアイテムを完全に除染しました。Ctnnb1フロックス/フロックスおよびαMHC-MerCreMerマウス(8〜12週齢、性別のいずれか)およびSprague-Dawleyラット(200〜250g、雄)を本研究に使用しました。動物は商業的な供給源から入手した(材料表を参照)。動物を扱うすべての手順は、機関の規制委員会によって訓練され承認されたスタッフによって実行されました。すべての手順で適切な個人用保護具が使用されました。
1. げっ歯類の心室組織におけるウイルス導入遺伝子発現
注:Ad-GFP(1 x 10 10 PFU / mLの力価)またはAAV9-GFP(力価1 x10 13 GC / mL)などの標的遺伝子と対応するコントロールウイルスを発現する組換えアデノウイルスまたはAAV( 材料の表を参照)を-80°Cの冷凍庫に保管します。
<ol><li>ウイルス注射の日に、氷上でウイルスを解凍します。標的遺伝子を発現するウイルスとコントロールウイルスを30 G 1/2針で2本の別々のシリンジ(容量=50 μL)に吸引し、使用するまで氷上に保ちます。 注意: シリンジと針の気泡は慎重に取り除く必要があります。</li>
	<li>ブプレノルフィンをラットまたはマウスに投与し(ラットの場合は0.05 mg / kg、マウスの場合は0.1 mg / kg、皮下)、1時間後に3%イソフルランを使用して麻酔を誘発し、その後の手順ではイソフルランを2%(100%酸素で0.5〜1.0 L / minの流速で)に維持します。.</li>
	<li>動物の体(尾など)を鉗子でそっとつまみ、動物が体の動きでつまんで反応しない場合は、適切な麻酔を確認します。</li>
	<li>電気加熱パッドを使用して体温を37°Cに維持します。バリカンを使用して胸部の毛を剃ります。 注意: 電気加熱パッドを使用するときは、熱分布が不均一になる可能性があるため、注意が必要です。</li>
	<li>角膜の乾燥を防ぐために両眼に眼科用軟膏を塗布します。</li>
	<li>動物を仰臥位に保ち、前臨床イメージングシステム( 材料の表を参照)を使用して、動物の心臓を短軸方向に超音波イメージングします。 注:次の手順は、無菌環境を提供するレベルIIのバイオセーフティキャビネットで実行されます。安全な針の取り扱いを含む標準的な安全手順が採用されています。</li>
	<li>動物の左下胸部を、ヨウ素ベースまたはクロルヘキシジンベースのスクラブとアルコールを交互に3回円を描くように滅菌します。</li>
	<li>超音波画像ガイダンスの下で、ステップ1.1で準備したウイルスを含むシリンジの30 G 1/2針を挿入します。体の左下胸側を介して動物の胸に。</li>
	<li>針先を左心室前部自由壁に近づけ、10〜15μLのウイルスをゆっくりと注入します。針の先端近くの明るさを高めることにより、超音波画像への注入が成功したことを確認します。 注:心筋組織への物理的損傷を防ぐために、各部位に注入されるウイルスの量は15μL以下です。</li>
	<li>心臓から針を引き出し、左心室の他の領域に挿入して、同量のウイルスを2回目と3回目に注射します。 注:注射部位の総数は、実験計画によって決まります。限局性導入遺伝子発現が必要な場合は、1回の注射のみが必要です。より拡散的な導入遺伝子発現が必要な場合は、通常、複数の注射部位(3〜5)が必要です。</li>
	<li>注射が完了したら、動物をケージに戻します。</li>
	<li>動物が胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで動物を注意深く監視し、飼育室に戻します。</li>
	<li>ブプレノルフィンHCl(0.1 mg / kg、マウスの場合は1日2回、0.05 mg / kg、ラットの場合は1日2回、皮下)を次の2日間動物に投与します。.動物をビバリウムに戻し、痛みや苦痛の異常な兆候がないか毎日監視し、見つかった場合は、施設動物管理委員会のプロトコルに従って動物を治療します。</li>
</ol>2.心不整脈感受性の評価
注:アデノウイルス注射後4〜6日およびAAV注射後1〜2週間で、動物の心臓の心不整脈に対する感受性を評価します 手順2.1.-2.2に従います。
<ol><li>ラットまたはマウスの心臓のランゲンドルフ灌流を行う。<ol><li>1 Lの水に以下を加えてタイロード溶液を調製します:NaCl、7.9 g(最終= 135 mM);KCl, 0.37 g (5.0 mM);CaCl2, 0.27 g (1.8 mM);MgCl 2, 0.24 g (1.2 mM);ヘペス, 2.38 グラム (10 ミリメートル);グルコース、1.8 g(10 mM)。NaOHでpHを7.40に調整します(材料表を参照)。</li>
		<li>溶液を0.2μmのフィルターでろ過し、ステップ2.1.6.〜2.2.8の間、100%O2 で連続的に泡立てます。</li>
		<li>ヘパリンをラットまたはマウスに投与し(500 U / kg、腹腔内注射)、10分後に3%イソフルランで動物を麻酔します。.体を優しくつまんで適切な麻酔をかけてください。</li>
		<li>メスを使用して、左開胸術のために鎖骨中央線に1〜1.5 cmの垂直切開を行い、心臓を露出させます。</li>
		<li>大動脈弓レベルでハサミで切って心臓を集め、すぐに心臓を氷のように冷たいタイロード溶液に入れます。 注意: 心臓の収集中に心臓を傷つけないように注意してください。</li>
		<li>固定流量モードで修正されたランゲンドルフ灌流システム( 材料の表を参照)に接続された鈍い針(ラットの場合は18 G、マウスの場合は23 G)で心臓の大動脈をカニュレーションします。灌流圧力を70〜80mmHgに保つように流量を調整します。 注意: 大動脈カニューレ挿入の前に、灌流針の気泡を取り除く必要があります。解剖顕微鏡を使用すると、カニューレ挿入が容易になります。</li>
		<li>カニューレ付き心臓を左心室を上に向けてシリコーンエラストマーでコーティングされた9、10 cmのプラスチック皿に入れ、心臓9,12をO2バブルタイロード溶液で37°Cに灌流します。</li>
		<li>最初の2〜3回の心拍中の心臓からの血液の洗い流しと、心臓の色が赤から淡い色に変化するのを観察することにより、灌流開始時の正しい大動脈カニュレーションを確認します。</li>
		<li>小動物のECGシステム( 材料の表を参照)の電極を皿のシリコーンエラストマーコーティングに挿入して、心臓の周りに配置します(図1)。互換性のあるソフトウェアを使用してECGを記録します。</li>
	</ol></li>
	<li>アドレナリン受容体刺激とプログラムされた電気刺激を実行して、心室頻脈性不整脈を誘発します。<ol><li>大動脈カニューレ挿入が成功した後、心臓の準備を安定させるために、Tyrode溶液で心臓を20分間灌流し続けます。</li>
		<li>ステップ2.2.3.-2.2.8で心臓灌流に使用するタイロード溶液に1μMイソプロテレノール( 材料の表を参照)を追加します。</li>
		<li>イソプロテレノール灌流を10分間行った後、電気刺激装置に接続された2つの白金電極で心臓を頂点で刺激します( 材料の表を参照)。</li>
		<li>刺激手順(図2)から始め、10回の連続した刺激(S1、5 V、100ミリ秒間隔)が含まれ、その後に80ミリ秒の初期間隔で追加の刺激(S2)が続きます。心拍をキャプチャできなくなるまで(つまり、心臓の有効不応期であるERPに達するまで)13、S2間隔を毎回2ミリ秒ずつ繰り返し短縮します。</li>
		<li>ECGによって誘発された心室頻脈性不整脈(心室頻拍および細動を含む)を監視します。.</li>
		<li>上記の手順で不整脈が誘発されない場合は、ERPに達するまで、S2の後に同じ初期(80ミリ秒)とデクリメント(2ミリ秒)間隔で別の刺激(S3)を追加します。</li>
		<li>それでも心室頻脈性不整脈が誘発されない場合は、ERPに達するまで、S3の後に同じ初期間隔と減少間隔でもう1つの刺激(S4)を追加します。</li>
		<li>心室頻脈性不整脈がまだ誘発されない場合(コントロール健康な心臓で予想されるように)、電気刺激プロトコルを停止し、心臓は非誘導性であると考えてください。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update%3A+A+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139(2020).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte-specific+deletion+of+%CE%B2-catenin+protects+mouse+hearts+from+ventricular+arrhythmias+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction.</a> Scientific Reports. 11 (1), 17722(2021).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+exercise+training+on+the+FNDC5%2FBDNF+pathway+in+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats.</a> Physiological Reports. 7 (24), 14323(2019).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+Nod1%2FRIP2+signaling+is+essential+for+cardiac+hypertrophy+but+requires+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+for+signal+transductions+and+energy+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance.</a> Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).</li>
<li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+expression+associates+with+inflammation+in+early+atherosclerosis+in+humans+and+can+be+therapeutically+silenced+to+reduce+NF-%CE%BAB+activation+and+atherogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice.</a> Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).</li>
<li>Gharibeh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+is+a+regulator+of+sinus+node+development+and+heart+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118(2021).</li>
<li>Lu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+suppression+of+Scn5a+gene+expression+mediates+cardiac+Na%2B+channel+inhibition+by+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling.</a> Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).</li>
<li>Liang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phosphoinositide+3-kinase+%7Balpha%7D%2C+protein+kinase+C%2C+and+L-type+Ca2%2B+channels+in+mediating+the+complex+actions+of+angiotensin+II+on+mouse+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility.</a> Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).</li>
<li>Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+quiescent+cardiomyocytes+to+pacemaker+cells+by+expression+of+Tbx18%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18.</a> Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).</li>
<li>Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+complete+atrioventricular+block+recapitulates+clinical+indices+of+bradycardia+and+provides+a+platform+to+test+disease-modifying+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6930(2019).</li>
<li>Cingolani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+to+inhibit+the+calcium+channel+beta+subunit%3A+Physiological+consequences+and+pathophysiological+effects+in+models+of+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy.</a> Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).</li>
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<li>Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ventricular+refractoriness.+Effects+of+cycle+length%2C+pacing+site+and+atropine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine.</a> Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).</li>
<li>Segel, L. D., Ensunsa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+improves+stability+and+longevity+of+perfluorochemical-perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts.</a> The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).</li>
<li>Hong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+inflammasome+as+a+potential+treatment+in+ischemic+stroke+concomitant+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121(2019).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-NLRP3+inflammasome+activation+exacerbates+cardiac+dysfunction+after+ischemic+stroke+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes.</a> Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral-cardiac+syndrome+and+diabetes%3A+Cardiac+damage+after+ischemic+stroke+in+diabetic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state.</a> Frontiers in Immunology. 12, 737170(2021).</li>
<li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li>
<li>Allison, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroconductive+nanoengineered+biomimetic+hybrid+fibers+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).</li>
<li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+human+cardiac+myocytes+for+medical+research%3A+Promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges.</a> Stem Cells International. 2017, 4528941(2017).</li>
<li>Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-based+treatment+of+acquired+heart+block%3A+The+battle+for+tomorrow+has+begun%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331(2017).</li>
<li>McLaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+human+recombinant+collagen+matrices+limit+adverse+remodeling+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 4866(2019).</li>
<li>Villanueva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxalase+1+prevents+chronic+hyperglycemia+induced+heart-explant+derived+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction.</a> Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).</li>
<li>Kanda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+paracrine+repair+of+injured+myocardium+using+microfluidic-based+cocooning+of+heart+explant-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells.</a> Biomaterials. 247, 120010(2020).</li>
</ol>

著者は競合する金銭的利益を持っていません。

ランゲンドルフ灌流された単離心臓製剤の成功には、いくつかのステップが重要です。まず、心臓採取中の心臓への損傷を避けることが重要です(たとえば、誤って絞ったり、はさみで切ったりすることによる)。第二に、これは心拍を停止し、心臓の酸素消費量を減らすため、収集した心臓をできるだけ早く冷たいタイロード溶液に入れることが重要です。第三に、大動脈への針の挿入は深すぎてはいけません—理想的には、針の先端が大動脈弁レベルに近いため、心臓は冠状動脈を通して十分に灌流されます。最後に、灌流針の気泡は大動脈カニュレーションの前に除去する必要があります—通常、カニューレ挿入の直前にポンプを数秒間オンにして、針の先端の気泡を除去すると便利です。
ランゲンドルフ灌流心臓製剤は、動物におけるin vivo試験に比べていくつかの利点があります。第一に、心臓に適用される薬物(例えば、この研究で使用されるイソプロテレノール)の濃度および持続時間を正確に制御することができる。第二に、刺激(例えば、この原稿の頂点での電気的ペーシング)または生理学的信号記録(例えば、Ca2+感受性ま...

心血管疾患は世界の主要な死因であり、2017年だけで1,800万人の命を奪っています1。げっ歯類、特にマウスおよびラットは、取り扱いが容易であり、様々なトランスジェニック過剰発現またはノックアウトラインが利用可能であるため、心血管研究において最も一般的に使用されるモデルとなっている。げっ歯類モデルは、疾患メカニズムを理解し、心筋梗塞2、高血圧3、心不全4、およびアテローム性動脈硬化症5の潜在的な新しい治療標的を特定するための基礎となっています。しかしながら、心不整脈の研究におけるげっ歯類の使用は、ヒトまたは大型動物モデルと比較して、心臓のサイズが小さく、心拍数が速いために制限されている。したがって、心筋梗塞後のマウスまたはラットにおける自然発生的致死性不整脈はまれです2。研究者は、不整脈負荷または不整脈促進傾向に意味のある変化を示すことなく、線維症や遺伝子発現などの不整脈支持の基質を反映する可能性のある間接的な二次的変化に焦点を当てることを余儀なくされています。この制限を克服するために、遺伝子改変6、7 または心筋梗塞2 後の心室頻脈性不整脈に対するマウスおよびラット心臓の感受性の信頼できる評価を可能にする方法が、本プロトコルに記載されている。この方法は、アドレナリン受容体刺激とプログラムされた電気刺激を組み合わせて、孤立したランゲンドルフ灌流8 匹のマウスとラットの心臓に心室頻脈性不整脈を誘発します。
げっ歯類の心筋組織におけるウイルス遺伝子導入のための標準的なアプローチは、しばしば開胸術9,10,11による心臓の曝露を含み、これは侵襲的処置であり、処置後の動物の回復の遅延と関連している。この記事では、導入遺伝子の過剰発現に対する超音波画像ガイダンスの下でウイルスを直接心筋内注射する方法について説明します。この侵襲性の低い手順は、開胸術と比較して、ウイルス注射後の動物の回復を早め、組織損傷を減らし、動物の術後の痛みや炎症を軽減し、したがって、トランスジェニック遺伝子の影響をより適切に評価することができます心機能。

<table><tbody><tr><td>30 G 1/2 PrecisionGlide Needle</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>アデノ随伴ウイルス (AAV9-GFP)</td><td>Vector Biolabs</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>アデノウイルス (Ad-GFP)</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>アデノウイルス (Ad-Wnt3a)</td><td>Vector Biolabs</td><td>ADV-276318</td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット (レベル II)</td><td>Microzone Corporation</td><td>N/A</td><td>モデル #: BK-2-4</td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td>獣医</td><td>DIN 02342510</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102378</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>バリカン</td><td>WAHL Clipper Corporation</td><td>78001</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン シリンジ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20701</td><td>705 LT, volume 50 &mu;L</td></tr><tr><td>の暖房パッド</td><td>の生命ブランド</td><td>E12107</td><td></td></tr>の<tr><td>ヘパリン</td><td>のフレゼニウスKabi</td><td>のDIN 02264315</td><td></td></tr><tr><td>のHEPES</td><td>のΣAldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>のイソフルラン</td><td>のFresenius Kabi株式会社</td><td>M60303</td><td></td></tr><tr><td>イソプロテレノール塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1351005</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 8 ソフトウェア</td><td>ADInstruments Inc.</td><td>ECG記録用の</td><td>バージョン8.1.5</td></tr>塩化<tr><td>マグネシウム六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>マウス(Ctnnb1flox/flox)</td><td>Jackson Labs</td><td>4152</td><td></td></tr><tr><td>マウス(&alpha;MHC-MerCreMer)</td><td>Jackson Labs</td><td>5650</td><td></td></tr><tr><td>Lens</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>for Langendorff system</td></tr><tr><td>MS400 transducer</td><td>VisualSonic Inc.</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>眼科軟膏</td><td>シスタン</td><td>DIN 02444062</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>圧力計</td><td>NETECH</td><td>DigiMano 1000</td><td>Langendorffシステム</td></tr><tr><td>用 ポンプ</td><td>Cole-Parmer</td><td>UZ-77924-65</td><td>Langendorffシステム</td></tr><tr><td>用 ラット(Sprague-Dawley、男性)</td><td>Charles River</td><td>400</td><td></td></tr><tr><td>メスの刃</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>メスのハンドル</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10007-12</td><td></td></tr><tr><td>シリコーンエラストマー</td><td>ダウン株式会社</td><td>Sylgard 184</td><td>ランゲンドルフシステム</td></tr><tr><td>小動物心電図システム</td><td>ADInstruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>刺激装置</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>VEVO3100 前臨床イメージングシステム</td><td>VisualSonic Inc.</td><td></td><td>該当なし</td></tr></tbody></table>

げっ歯類の心臓におけるウイルス導入遺伝子発現と心不整脈リスクの評価

Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk

心臓病は、世界中の罹患率と死亡率の主な原因です。取り扱いが容易でトランスジェニック株が豊富であるため、げっ歯類は心血管研究に不可欠なモデルになっています。しかし、心臓病患者の死亡を引き起こすことが多い自然発生的な致死性心不整脈は、心臓病のげっ歯類モデルではまれです。これは主に、ヒトとげっ歯類の心臓の電気的特性の種の違いによるものであり、げっ歯類を用いた心不整脈の研究に課題をもたらします。このプロトコルは、組換えウイルス(アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)の心エコー検査ガイド下筋肉内注射を使用して、マウスおよびラットの心室心筋における効率的な導入遺伝子発現を可能にするアプローチについて説明しています。この研究では、アドレナリン作動性とプログラムされた電気刺激の両方を備えた単離されたランゲンドルフ灌流マウスおよびラット心臓を使用して、不整脈に対する心臓感受性の信頼性の高い評価を可能にする方法についても概説しています。これらの技術は、心筋梗塞などの損傷後の有害な心臓リモデリングに関連する心臓リズム障害を研究するために重要です。

ここで説明するプロトコル(図1)に従って灌流すると、単離されたラットまたはマウスの心臓は、少なくとも4時間、リズミカルかつ安定して鼓動します。実験デザインでより長い期間の心臓灌流が必要な場合は、長時間灌流後の心筋浮腫の発生を減らすために、灌流溶液にアルブミンを添加することが有用です14。灌流溶液にイソプロテレノールを含めると、心筋梗塞や心不全などの多くの不整脈病で発生する交感神経系の活性化を模倣します。.プログラムされた電気刺激の間、心臓の成功したペーシングは、(1)連続したS1刺激中の心拍の1:1キャプチャと(2)S1ペーシング中の長時間の(またはより広い)QRS複合体によって検証されます(図3 および 図4)。後者は、心臓が頂点でペースを合わせており、心室組織における活性化の伝導が遅いとQRS複合体の持続時間が長くなるためです。
公表されたデータ<sup...

本プロトコルは、心エコー検査ガイダンスの下でのウイルスの直接心筋内注射によるラットおよびマウス心臓における導入遺伝子発現の方法を記載する。孤立したランゲンドルフ灌流心臓のプログラムされた電気刺激による心室性不整脈に対する心臓の感受性の評価方法もここで説明されています。

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents ...

このプロトコルにより、ユーザーは心室心筋で効率的な導入遺伝子発現を達成でき、心室組織における心不整脈と機能を調べるための遺伝子発現研究が容易になります。ウイルス導入遺伝子発現の技術は、動物にとって侵襲性が低く、開胸術を伴う従来のアプローチよりも損傷が少なく、回復時間が短縮されます。小さなげっ歯類の心臓に不整脈を誘発する技術は、心臓病の小動物モデルにおける不整脈に対する感受性を評価するのに役立ちます。手順を実演するのは、研究室のポスドクであるアリス・ルー博士です。まず、麻酔をかけたマウスの左下胸部を、ヨウ素ベースまたはクロルヘキシジンベースのスクラブを交互にアルコール中で円を描くように3回滅菌します。超音波画像ガイダンスの下で、ウイルスを含む注射器の針を動物の胸に挿入します。針先を左心室前部自由壁に近づけ、10〜15マイクロリットルのウイルスをゆっくりと注入します。針の先端近くの明るさを高めることにより、超音波画像への注入が成功したことを確認します。心臓から針を引き出し、左心室の他の領域に挿入して、同量のウイルスを2回目と3回目に注射します。マウスの心臓のランゲンドルフ灌流を行うには、左心室を上に向けて、カニューレをシリコンエラストマーでコーティングされた10センチメートルのプラスチック皿に入れます。定流量モードで修正されたランゲンドルフ潤水システムに接続された鈍い針で心臓の大動脈をカニューレします。摂氏37度の酸素泡立ちタイロード溶液で心臓を灌流します。灌流の開始時に、最初の2〜3回の心拍の間に心臓からの血液の洗い流しを観察し、心臓の色を赤から淡い色に変更することにより、正しい大動脈カニュレーションを確認します。灌流圧力を70〜80ミリメートル水銀柱に保つように流量を調整します。確認後、小動物のECGシステムの電極を皿のシリコーンエラストマーコーティングに挿入して心臓の周りに配置します。次に、互換性のあるソフトウェアを使用してECGを記録します。次に、アドレナリン受容体刺激を行い、イソプロテレノールとタイロード溶液で心臓を灌流します。10分後、電気刺激装置に接続された2つの白金電極で頂点の心臓を刺激することにより、プログラムされた電気刺激を実行して心室頻脈性不整脈を誘発します。最初の10回の連続した刺激S1で刺激手順を開始し、続いて80ミリ秒の初期間隔で追加の刺激S2を開始します。次に、心拍をキャプチャできなくなるか、心臓の有効不応期(ERP)に達するまで、S2間隔を毎回2ミリ秒ずつ繰り返し短縮します。心室頻拍や細動を含む誘発された心室頻脈性不整脈をECGで監視します。.不整脈が誘発されない場合。ERPに達するまで、S2の後に同じパラメータで別の追加の刺激S3を追加します。それでも心室頻脈性不整脈が誘発されない場合は、電気刺激を停止し、心臓を非誘導性と見なします。プログラムされた電気刺激の間、心臓の成功したペーシングは、連続したS1刺激中の心拍の1対1のキャプチャとS1ペーシング中の延長されたQRS複合体によって検証されます。これらのアドレナリン作動性刺激と電気刺激の組み合わせは、健康な偽手術の野生型マウス心臓、または対照アデノウイルスGFP注射ラット心臓において心室頻脈性不整脈を誘発しなかった。対照的に、同じプロトコルは、心筋梗塞後の野生型マウス心臓の77%およびAd-Wnt3aの心筋内注射後のラットの4人中3人において心室頻脈性不整脈を誘発した。針を挿入するときは、針の先端が心室の内側ではなく、自由壁内に埋め込まれていることを確認してください。また、心臓の大動脈を固定してカニューレ挿入することは最も重要なステップです。これらの手順に続いて、心臓は標準的な組織学的研究または分子生物学的アッセイに使用することができる。あるいは、単一細胞電気生理学研究を行うために生細胞を単離することができる。

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JoVE Journal

Biology

生物学

遠隔測定心電図は心​​臓の不整脈や心臓突然死のために動物モデルを評価する上で不可欠なツールとして浮上している。ここで、我々は、マウスの長期的、ホルター心電図モニタリングのアプリケーションのための測定ECG記録への段階的なガイドを提示する。...

マウスにおけるホルター心電図の記録

虚血性心不全の治療のための遺伝子導入法は、心筋梗塞の豚モデルを使用して記述されます。私たちのシンプルで再現性のある方法は、私たちは容易に非常にシンプルかつ再現可能な方法で様々な遺伝子の転送の有効性を評価することができます。...

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組換えアデノ随伴ウイルスベースの遺伝子導入:げっ歯類モデルにおける導入遺伝子導入および心臓特異的発現のための技術

このプロトコルは、共焦点回転ディスク顕微鏡を用いたレンチウイルスおよびアデノウイルス形質導入後の初代ラット新生児心筋細胞を用いた生細胞イメージングの方法を説明しています。これにより、生きた心筋細胞の細胞過程を詳細に観察することができます。...

ディスク顕微鏡スピニング共焦点の使い方アデノウイルスやレンチウイルス形質導入後の初代ラット新生児心筋細胞の生細胞イメージング

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マウスハーツでの遺伝子を過剰発現またはノックダウンするrAAV9の調製

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シンプルで効率的なマウスの心筋内注入による生体内の心臓特異的遺伝子操作法

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心臓電気生理学、不整脈原性Ex Vivo蛍光システムで心臓内のニューロンの影響

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マウス心臓における光遺伝学的マルチサイト光刺激の適用による高度な心調律管理

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マウス胚性心臓における遺伝子導入のための効率的なトランスジェネシスアプローチ

学ぶウイルス導入による遺伝子発現と心不整脈リスク評価法。ラットとマウスの心臓に超音波ガイド下で直接注射し、Langendorff灌流と電気刺激で心室不整脈の感受性を評価する最小侵襲技術です。

げっ歯類の心臓におけるウイルス導入遺伝子発現と心不整脈リスクの評価

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