Name: 内血網膜バリア透過性を評価する ためのin vitro モデルとしての内皮細胞トランスサイトーシスアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 学ぶ内皮細胞トランスサイトーシスアッセイを用いた内血網膜バリア透過性評価法。ヒト網膜微小血管内皮細胞とホースラディッシュペルオキシダーゼを用いて、血管バリアの分子機構と創薬への応用を探索する。

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この作業は、JCへのNIH助成金(R01 EY028100、EY024963、およびEY031765)によってサポートされました。ZWは、テンプル騎士団アイ財団キャリアスターターグラントによってサポートされました。

すべての動物実験は、ボストン小児病院の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって、光学顕微鏡とEM画像の生成について承認されました(図3)。 インビボ 研究のためのプロトコルは、Wangら24から得ることができる。ヒト網膜微小血管内皮細胞(HRMEC)を含むすべての実験は、ボストン小児病院の施設内バイオセーフティ委員会(IBC)によって承認されました。
1. 試薬の調製
<ol><li>組織培養皿をコーティングするための溶液:1 mLのゼラチンストック溶液(40%-50%)を500 mLの滅菌組織培養グレード1x PBS(pH = 7.4)に溶解することにより、0.1%ゼラチン溶液を調製します。溶液を0.22 μmフィルターでろ過します。0.1%ゼラチン溶液を2〜8°Cで保存します。 無菌状態で無期限に前記温度で保存することができる。</li>
	<li>増殖培地:製造元の指示に従ってEGMサプリメントを内皮細胞増殖基礎培地(EBM)に溶解することにより、500 mLの内皮細胞増殖完全培地(EGM)を調製します。増殖培地を50 mLチューブに分注し、チューブを4°Cで保存します。 増殖培地の貯蔵寿命は4°Cで12ヶ月です。</li>
	<li>トリプシン溶液:0.25%トリプシン-EDTA溶液の場合、ストックバイアルから50 mLチューブに分注し、4°C(最大2週間)または-20°C(最大24か月)で保存します。</li>
</ol>2. HRMECの培養
<ol><li>初期細胞培養<ol><li>細胞培養ペトリ皿(直径100 mm x 高さ20 mm)を5 mLの0.1%ゼラチン溶液で層流フードの下にコーティングし、均一なコーティングのために室温(RT)で30分間フード内で乱されないように保ちます。 注:ディッシュのゼラチンコーティングは細胞の接着を強化します。あるいは、ゼラチン被覆T75培養フラスコも使用することができる。</li>
		<li>細胞を播種する前に、真空ポンプを用いてゼラチン溶液を吸引する。使用したアスピレーターの真空圧は最大724mmHgでした。 注:コーティング溶液の乾燥を防ぐために、細胞を播種する直前に吸引を行う必要があります。</li>
		<li>HRMECの凍結バイアル(液体窒素中での保存中)を、37°Cの水浴を使用するか、温かい増殖培地をバイアルに加えて解凍します。解凍したら、細胞懸濁液を9 mLの増殖培地に移します(解凍したHRMECのバイアルが1 mLであると仮定します)。 注:HRMECは商業的に入手されました(材料表)。細胞に添加する増殖培地は、使用前に常に37°Cに予熱する必要があります。</li>
		<li>細胞を200 x g でRTで5分間回転させ、細胞ペレットが除去されないように上清を注意深く吸引します。</li>
		<li>細胞ペレットを10 mLの増殖培地に再懸濁し、得られた懸濁液をゼラチンコーティングされたペトリ皿に移します。細胞をインキュベーター内で37°Cおよび5%CO2に保つ。典型的には、HRMECは72時間後に70%〜80%コンフルエントである。 注:増殖培地は一日おきに交換されます。</li>
	</ol></li>
	<li>透過性メンブレンインサートでのHRMECの継代培養<ol><li>各インサート(頂端チャンバー)を200 μLの0.1%ゼラチン溶液で層流フード下で30分間コーティングすることにより、HRMECを播種するための細胞培養フィルターインサート(孔径0.4 μmのポリカーボネート膜を備えた6.5 mmインサート、24ウェルプレートに入れます)を準備します。溶液がフィルターインサートの底面全体を覆っていることを確認してください。 注:各ウェルには、多孔質膜で区切られた頂端室と基底側室があります。</li>
		<li>培養したHRMECを含むペトリ皿(ステップ2.1.5)をインキュベーターから取り出し、増殖培地を吸引します。層流フードの下で10 mLの1x PBSで細胞を2回静かにすすぎ、潜在的な浮遊/死細胞を取り除きます。</li>
		<li>細胞を0.5〜1 mLの0.25%トリプシン-EDTA溶液で解離し、ペトリ皿をインキュベーター(37°Cおよび5%CO2)に5分間入れます。</li>
		<li>4.5〜9 mLの増殖培地を加えてトリプシン活性を消光し、10 mLピペットを使用して細胞懸濁液を15 mLチューブに移します。</li>
		<li>細胞を200 x g でRTで5分間スピンさせ、上清を注意深く除去し、ペレットを3 mLの成長培地に再懸濁します。</li>
		<li>手動血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞数をカウントし、フィルターインサートあたり4 x 104 細胞の密度でシードします(つまり、1.25 x 105 細胞/ cm2)。各インサートの細胞懸濁液の容量は250 μLです。</li>
		<li>透過性インサートを含むウェルからコーティング溶液を吸引し、インサート(頂端チャンバー)あたり250 μLの細胞懸濁液を移します。インサートの1つに培地(つまり、セルなし)のみを追加し、TEER測定の「ブランクコントロール」として使用します。同時に、基底外側チャンバーにウェルあたり750 μLの培地も加えます。</li>
		<li>培養細胞が完全にコンフルエントになり、~20 Ω・cm2の所望のTEER値が達成されるまで、透過性インサートを備えた24ウェルプレートをインキュベーター(37°Cおよび5%CO2)に7〜12日間保持します。</li>
		<li>成長培地を一日おきに交換してください。培地交換中は、細胞単層の破壊を最小限に抑えるために培地を注意深く吸引し、ウェルあたりそれぞれ250 μLおよび750 μLの新鮮な培地を頂端室および基底外側チャンバーに追加します。 注:増殖培地は、ウェルの頂端室と基底外側室の両方で変更されます。</li>
	</ol></li>
</ol>3. TEER測定(図4)
<ol><li>細胞播種後14日目(ステップ2.2.9)に、上皮ボルトオームメーター(EVOM)電気抵抗(ER)システム(材料表)を使用してHRMECのTEERを次のように測定します。</li>
	<li>ERシステムをプリチャージし、STX04テスト電極を使用してメーターの機能を確認します。必要に応じて調整します。</li>
	<li>電極をメーターに接続し、最初に70%エタノールに15〜20分間浸してから、細胞培養EGM増殖培地に短時間浸して電極を平衡化します。</li>
	<li>それまでの間、温度平衡化のために、セルを含む24ウェルプレートを層流フード内のRTで15〜20分間保持します。 注:TEER測定は温度の影響を受けるため、平衡化ステップが不可欠です。</li>
	<li>TEER測定では、ウェルの頂端(250 μL)チャンバーと基底外側チャンバー(750 μL)の両方に新鮮な増殖培地を追加します。</li>
	<li>短い方の先端がインサートに入り、長い方の先端がウェルの底に触れるように電極を注意深く浸して、TEER測定を実行します。最初にブランクコントロールの両端の抵抗を測定します。各インサートについて、TEARを三重で測定します。 注:測定の合間に電極をすすぐために、培地が使用されます。安定した読み取りのために、電極がチップの底に対して90°の角度で保持されていることを確認してください。</li>
	<li>TEER =正味抵抗(Ω)xフィルターインサートの表面積(cm2)の式を使用して、単層全体の電気抵抗(Ω・cm2)を計算します。ここで、正味抵抗は、各ウェル(細胞を含む増殖培地)とブランクウェル(増殖培地のみ)の抵抗値の差である。</li>
	<li>TEER値が~20 Ω・cm2に達した後にのみ、細胞のさらなる処理を行います。希望のTEERレベルに達していない場合は、プレートをインキュベーターに保管し、翌日TEERを測定します。 注:HRMECコンフルエントは、典型的な石畳の形態による細胞形状の形態学的検査(顕微鏡下)および/または免疫組織化学染色による細胞接合タンパク質の存在によっても検証できます。</li>
</ol>4.トランスサイトーシスアッセイ
<ol><li>Cy3タグトランスフェリンを用いたクラスリン媒介 in vitro トランスサイトーシスアッセイ(図5)<ol><li>20 Ω·cm2付近のTEER値でコンフルエントに達したら、リガンドで処理する前に、血清は両チャンバー(頂端室:250 μLおよび基底外側チャンバー:750 μL)のEBM(血清還元培地)中の0.5%FBSを使用して、37°Cおよび5%CO2 で24時間細胞を奪います。血清還元EBMをアッセイ全体を通して使用した。</li>
		<li>細胞を(ステップ4.1.1の血清還元培地を使用して)蛍光(シアニン3)タグ付きトランスフェリンリガンド(Cy3-Tf)(最終濃度40 μg/mL)とともに頂端室で37°Cで60分間インキュベートします。 注:Cy3-Tfを含むプレートは、Cy3-Tfの光退色を防ぐために、アルミホイルで包み、ライトをオフにして細胞培養フードで実験を行うことにより、光から保護する必要があります。</li>
		<li>1時間後、プレートを氷上に置き、単層をRTで血清還元培地で4倍(洗浄あたり3〜5分)に単層を尖端および基底外側に洗浄して、遊離の未結合Cy3-Tfを除去します。 注:洗浄は、遊離トレーサー分子を除去し、傍細胞経路からの潜在的な漏出なしにトランスサイトーシスの正確な読み取りを可能にするために不可欠です。</li>
		<li>細胞を含む徹底的に洗浄されたフィルターインサートに新鮮な血清還元培地を追加し(ステップ4.1.1と同様)、事前に温めた血清還元培地を含む24ウェルプレートの新鮮なウェルにインサートを移します。</li>
		<li>細胞をインキュベーター(37°Cおよび5%CO2)内でさらに90分間インキュベートし、次いで基底外側チャンバーから培地を回収する。</li>
		<li>蛍光検出器を用いて基底外側チャンバーからの溶液の蛍光強度を記録する。相対蛍光単位(RFU)として測定された蛍光強度のレベルは、クラスリン依存性トランスサイトーシスを介してHRMEC単層全体でトランスサイトーゼされたCy3-Tf複合体の量を示します。</li>
	</ol></li>
	<li>HRPを用いたカベオラを介した in vitro トランスサイトーシスアッセイ(図6)<ol><li>約20 Ω·cm2のTEER値で完全なコンフルエントに達したら、血清は、処理前に0.5%FBS含有EBM培地(血清還元培地)を使用して、37°Cおよび5%CO2 で24時間細胞を奪います(ステップ4.1.1と同様)。血清還元EBM培地は、アッセイ全体を通して使用した。</li>
		<li>頂端室の細胞を所望の処理およびビヒクルコントロールで処理する。 注:ここでは、HRMECのWntシグナル伝達経路によるカベオラ媒介性トランスサイトーシスの調節を実証するために、例としてWntモジュレーターを使用しました:ヒト組換えノリンおよびWnt阻害剤XAV939。典型的な実験では、細胞をインキュベーター(37°Cおよび5%CO2)で24時間処理し、次の濃度で:ノリン(125 ng / mL)、ノリン(125 ng / mL)+ XAV939(10 μM)、およびビヒクルコントロール溶液。さらに、Wnt3a馴化培地(L Wnt-3A細胞から産生)も使用した。</li>
		<li>頂端チャンバー内の細胞をHRP(5 mg/mL)とともに37°Cで15分間インキュベートします。</li>
		<li>その後、24ウェルプレートを氷上に置き、尖端および基底外側チャンバーをPバッファー(10 mM HEPES pH = 7.4、1 mM ピルビン酸ナトリウム、10 mM グルコース、3 mM CaCl2、145 mM NaCl)で集中的に洗浄して、遊離細胞外HRPを除去します。 注:洗浄は、遊離トレーサー分子を除去し、傍細胞経路からの潜在的な漏出なしにトランスサイトーシスの正確な読み取りを可能にするために不可欠です。</li>
		<li>新鮮な血清還元培地(ステップ4.1.1と同様)を頂端チャンバーに追加し、インサートを予熱した培地を含む新鮮なウェルに移します。</li>
		<li>基底外側チャンバーから培地を回収する前に、37°Cおよび5%CO2 のインキュベーター内で単層をさらに90分間インキュベートします。</li>
		<li>回収した培地に、製造元の指示に従って100 μLのHRP蛍光発生ペルオキシダーゼ基質(材料表)を加え、RTで10分間インキュベートしてから、100 μLのStop溶液で反応を停止します。</li>
		<li>蛍光プレートリーダーを使用して、培地中のHRP基質反応生成物のレベルを検出します。420 nmの発光波長(325 nmの励起時)および相対蛍光単位(RFU)での蛍光強度を測定します。値は、カベオラ媒介性トランスサイトーシスを介してHRMEC層全体にトランスサイトーゼされたHRPのレベルを示します。 注:ここで使用されている蛍光製品(材料表)は光退色しません。光退色に対する光保護は必要ありません。</li>
	</ol></li>
</ol>

著者は、開示する利益相反または金銭的利益を持っていません。

BRBは網膜の健康と病気に不可欠な役割を果たしています。血管透過性を評価するin vitro技術は、バリア(BRB / BBB)の発生と機能に関する研究において重要なツールであることが証明されています。ここで説明する手順は、ECトランスサイトーシスの根底にある分子メカニズムを研究したり、BRB透過性に影響を与える関連する分子調節因子を評価したりするために利用できます。インビトロECトランスサイトーシスアッセイは、血管透過性を評価するために使用されるin vivoアッセイまたは技術に比べて複数の利点があります。これらは高速に高いスループットで実行でき、遺伝的および薬理学的調節の両方を使用して、多くの異なる変数または特定のシグナル伝達経路の単離された分子の影響を分析するために利用できます。純粋なEC培養システムは、インビボでしばしば観察されるような動物の変動を消し去り、他の細胞型による標的分子の可能な修飾またはエンドサイトーシスの影響も制限します32。HRMEC細胞の取り扱いは簡単で、ほとんどの実験室で利用可能な基本的な細...

人間の網膜は、体内で最もエネルギーを要求する組織の1つです。神経網膜が適切に機能するためには、血液網膜関門(BRB)を介して媒介される網膜環境を保護するために、酸素と栄養素の効率的な供給と、他の潜在的に有害な分子の制限されたフラックスが必要です1。中枢神経系の血液脳関門(BBB)と同様に、BRBは眼の選択的障壁として機能し、網膜に出入りするイオン、水、アミノ酸、糖の動きを調節します。BRBはまた、免疫細胞、抗体、有害な病原体などの循環因子への曝露を防ぐことにより、網膜の恒常性とその免疫特権を維持します2。BRB機能障害は、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症(AMD)、未熟児網膜症(ROP)、網膜静脈閉塞症、ブドウ膜炎などのいくつかの血管眼疾患の病態生理に寄与し、血管原性浮腫とその後の視力喪失をもたらします3,4,5。
BRBは、網膜血管系と網膜下の開窓脈絡毛細血管という2つの異なる眼血管ネットワークに対する2つの別々の障壁で構成されています。内側BRB(iBRB)は、主に網膜微小血管系の内側を覆う網膜微小血管内皮細胞(RMEC)で構成され、網膜内神経層に栄養を与えます。一方、網膜色素上皮は、神経感覚網膜と絨毛毛細血管の間にある外側BRBの主要成分を形成しています2。iBRBの場合、RMEC間の分子輸送は、傍細胞経路と経細胞経路の両方を介して行われます(図1)。iBRB全体の高度な物質選択性は、(i)隣接する内皮細胞(EC)間の傍細胞輸送を制限する接合タンパク質複合体の存在、および(ii)低い細胞輸送速度を維持する内皮細胞内のカベオラメディエーター、トランスポーター、および受容体の発現レベルが低いことに依存しています1,6,7,8 .傍細胞フラックスを調節する接合複合体は、タイトジャンクション(クローディン、オクルジン)、アドヘレンスジャンクション(VEカドヘリン)、ギャップジャンクション(コネキシン)で構成されており、水と小さな水溶性化合物の通過を可能にします。小さな親油性分子はRMECの内部を受動的に拡散しますが、より大きな親油性分子と親水性分子の動きは、小胞輸送体や膜輸送体を含むATP駆動の経内皮経路によって調節されています5,9。
水疱性トランスサイトーシスは、カベオリン媒介性カベオラトランスサイトーシス、クラスリン依存性(および受容体媒介性)トランスサイトーシス、およびクラスリン非依存性マクロピノサイトーシスに分類できます(図2)。これらの小胞輸送プロセスにはさまざまなサイズの小胞が含まれ、マクロピノソームが最大(200〜500 nmの範囲)、カベオラが最小(平均50〜100 nm)であり、クラスリンコーティングされた小胞の範囲は70〜150 nm 10です。カベオラは、主にカベオリン足場ドメインを介して脂質膜コレステロールおよび他の構造およびシグナル伝達タンパク質に結合するカベオリン-1で構成される、タンパク質コートを備えたフラスコ型の脂質に富む原形質膜陥入です11。カベオリンは、末梢に付着したキャビンと一緒に働き、原形質膜12におけるカベオラ安定化を促進する。カベオラ膜はまた、インスリン、アルブミン、および高密度リポタンパク質(HDL)および低密度リポタンパク質(LDL)を含む循環リポタンパク質などの他の分子に対する受容体を担持して、内皮細胞を横切るそれらの移動を補助し得る13。発生中、機能的BRBの形成はECトランスサイトーシスの抑制に依存する8。したがって、成熟網膜内皮は、生理学的条件下で他の内皮細胞と比較して、カベオラ、カベオリン-1、およびアルブミン受容体のレベルが比較的低く、そのバリア特性に寄与しています4,9。
iBRBの分解は多くの眼疾患の大きな特徴であるため、網膜血管透過性をin vivoおよびin vitroで評価する方法を開発することが不可欠です。これらの方法は、BRBの完全性の低下のメカニズムに関する可能性のある洞察を提供し、潜在的な治療標的の有効性を評価するのに役立ちます。現在のin vivoイメージングまたは定量的血管漏出アッセイは、典型的には、蛍光(フルオレセインナトリウムおよびデキストラン)、比色(Evans Blue色素および西洋ワサビペルオキシダーゼ[HRP]基質)、または放射性トレーサー14を使用して、顕微鏡イメージングまたは単離された組織ライセート中の血管系から周囲の網膜組織への血管外漏出を検出する。血管の完全性を定量化するための理想的なトレーサーは、不活性で、健康で無傷の毛細血管内に閉じ込められた状態で、侵害された血管に自由に浸透するのに十分な大きさである必要があります。フルオレセインナトリウムまたはフルオレセインイソチオシアネート結合デキストラン(FITC-デキストラン)を生眼底フルオレセイン血管造影(FFA)または単離された網膜フラットマウントに使用する方法は、インビボまたはex vivoでの網膜血管外漏出の定量に広く使用されています。FITCデキストランには、サイズ選択的研究用に4〜70 kDaの範囲の異なる分子量で利用できるという利点があります15,16,17。FITCアルブミン(~68 kDa)は、血管漏出研究に生物学的に関連する代替の大型タンパク質トレーサーです18。心臓内19、眼窩後、または尾静脈20を通して注入されたEvans Blue色素も、内因性アルブミンとの結合に依存して、主に分光光度検出またはあまり一般的ではないがフラットマウント20,21の蛍光顕微鏡によって定量できる大きな分子を形成します。しかしながら、これらの定量的または光イメージング方法論は、しばしば傍細胞輸送と経内皮輸送を区別しない。トランスサイトーシス小胞の微細構造可視化によるトランスサイトーシスの特異的解析のために、HRPなどのトレーサー分子が典型的に使用され、電子顕微鏡下で観察できる内皮細胞内のトランスサイトーシス小胞の位置を特定する22,23,24(図3A-C)。
内皮細胞透過性を評価するためのin vitro iBRBモデルの開発と使用は、in vivo実験を補完し、血管漏出の分子調節因子の研究を支援するための堅牢でハイスループットな評価を提供する可能性があります。タイトジャンクションの傍細胞輸送と完全性を評価するために一般的に使用されるアッセイには、経内皮電気抵抗(TEER)、イオンコンダクタンスの測定値(図4)2,25、および低分子量蛍光トレーサー26を使用したin vitro血管漏出アッセイが含まれます。加えて、BBBをモデル化するトランスフェリンベースのトランスサイトーシスアッセイは、クラスリン依存性トランスサイトーシスを探索するために利用されている27。それにもかかわらず、BRB、より具体的には、インビトロでの網膜ECカベオラートランスサイトーシスを評価するアッセイは限られている。
本研究では、ヒト網膜微小血管内皮細胞(HRMEC)を in vitro モデルとして使用して、iBRB透過性とECトランスサイトーシスを決定するECトランスサイトーシスアッセイについて説明します。このアッセイは、受容体媒介性またはカベオラ依存性トランスサイトーシス経路を介してトランスフェリンまたはHRPを輸送するHRMECの能力に依存しています(図2)。頂端チャンバー(すなわち、フィルターインサート)で完全にコンフルエントになるまで培養したHRMECを蛍光結合トランスフェリン(Cy3-Tf)またはHRPとともにインキュベートし、ECトランスサイトーシスのみを介してボトムチャンバーに転写されたトランスフェリンまたはHRPのレベルに対応する蛍光強度を測定しました。細胞単層のコンフルエンシーは、TEERを測定することにより確認することができ、タイトジャンクション完全性を示す図25。TEERおよびトランスサイトーシスアッセイ技術を実証するために、血管内皮増殖因子(VEGF)28 およびWntシグナル伝達におけるもの(Wntリガンド:Wnt3aおよびNorrin)29を含む、血管透過性およびECトランスサイトーシスの既知の分子調節因子が使用されました。

<table><tbody><tr><td>生物学的安全キャビネット&nbsp;</td><td>サーモエレクトロンコーポレーション、サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養ペトリディッシュ&nbsp;</td><td>ネストバイオテクノロジー</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>遠心チューブ (15 mL)</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>352097 遠心チューブ(50 mL)</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>シアニン3-ヒトトランスフェリン&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>AB_2337082</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)</td><td>ロンザ・バイオサイエンス</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地-2 (EGM-2) SingleQuots supplements</td><td>ロンザ・バイオサイエンス</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td><td>ミリポア</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>ロンザバイオサイエンス</td><td>CC-4102B</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤 (2チップ)</td><td>Bulldog Bio</td><td>DHC-N002</td><td></td></tr><tr><td>西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8250</td><td></td></tr><tr><td>ヒト網膜微小血管内皮細胞 (HRMEC)</td><td>細胞システム</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>サーモエレクトロン(株)、サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>L 細胞 (コントロールコンディショニング培地用)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2648</td><td></td></tr><tr><td>L Wnt-3A セルズ (Wnt3Aコンディショニング培地用)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>マルチモードプレートリーダー</td><td>EnSight、PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)バッファー (1x)</td><td>GIBCO</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15169</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトNorrin (rhNorrin)</td><td>R&D Systems</td><td>3014-NR</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト血管内皮増殖因子 (rhVEGF)</td><td>R&D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター (0.22 &micro;m)</td><td>ミリポア</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>トランズウェルインサート(6.5 mmトランズウェル、0.4 & マイクロ;m孔ポリエステルメンブレンインサート)</td><td>コーニング株式会社</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%) (1x)</td><td>GIBCO</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>プレシジョン、サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>51221060</td><td></td></tr><tr><td>XAV939 (Wnt/&beta;-カテニン阻害剤)</td><td>Selleckchem</td><td>S1180</td><td></td></tr></tbody></table>

内血網膜バリア透過性を評価する ためのin vitro モデルとしての内皮細胞トランスサイトーシスアッセイ

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

血液網膜関門(BRB)の機能不全は、いくつかの血管性眼疾患の病態生理に寄与し、しばしば網膜浮腫およびその後の視力喪失をもたらす。内血網膜関門(iBRB)は、主に生理的条件下での透過性が低い網膜血管内皮で構成されています。低透過性のこの特徴は、隣接する網膜微小血管内皮細胞間の低速度の傍細胞輸送、ならびにそれらを通る経細胞輸送(トランスサイトーシス)によって厳密に調節および維持される。網膜経細胞バリア透過性の評価は、健康と疾患におけるiBRBの完全性に関する基本的な洞察を提供する可能性があります。この研究では、ヒト網膜微小血管内皮細胞(HRMEC)を使用して、iBRB透過性を評価する ためのin vitro モデルとして、内皮細胞(EC)トランスサイトーシスアッセイについて説明します。このアッセイでは、受容体およびカベオラを介した経細胞輸送プロセスにおいてトランスフェリンおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)をそれぞれ輸送するHRMECの能力を評価します。多孔質膜上で培養した完全にコンフルエントなHRMECを、蛍光タグ付きトランスフェリン(クラスリン依存性トランスサイトーシス)またはHRP(カベオラ媒介性トランスサイトーシス)とともにインキュベートし、EC単層全体のトランスサイトーシスレベルを示す、底部チャンバーに転写されたトランスフェリンまたはHRPのレベルを測定しました。iBRBを調節する既知の経路であるWntシグナル伝達を調節して、カベオラを介したHRPベースのトランスサイトーシスアッセイ法を実証しました。ここで説明するECトランスサイトーシスアッセイは、血管病理におけるEC透過性およびiBRB完全性の分子調節因子を調査するための有用なツールを提供し、薬物送達システムをスクリーニングするための有用なツールを提供する可能性がある。

網膜血管内皮のEM画像は、in vivoの内皮細胞における経サイトーシス小胞輸送およびカベオラ小胞を示す。 ECトランスサイトーシスは、光学顕微鏡下でHRP含有血管を反射する暗褐色の沈殿物を有する網膜断面内でin vivoで視覚化することができ(図3A)、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いてHRP含有トランスサイトーシス小胞を示す電子密度の高い沈殿物として(図3B、C)、iBRB全体のECトランスサイトーシスを実証することができます。大きな小胞は潜在的にマクロピノサイトーシスを反映しています(白い矢じり;図3B)、そして小さな小胞はおそらくカベオラ小胞(白い矢じり;図3C)。さらに、網膜血管におけるカベオラの局在は、蛍光顕微鏡下...

このプロトコルは、ヒト網膜微小血管内皮細胞がカベオラ媒介性細胞輸送プロセスにおいて細胞間で西洋ワサビペルオキシダーゼを輸送する能力を測定することにより、内部血液網膜バリア透過性を評価するモデルとしての in vitro 内皮細胞トランスサイトーシスアッセイを示しています。

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

このプロトコルは、内皮トランスサイトーシスに特に焦点を当てた血液網膜や血液脳関門などの選択的血管バリアの機能と透過性を研究するための有用な細胞ベースのモデルを提供します。このアッセイは、生きた動物を必要としないセットアップと使用が簡単です。内皮細胞透過性およびトランスサイトーシスのさまざまな分子調節因子が血液網膜バリアの完全性に影響を与えることを研究するために利用できます。このアッセイは、血管生物学と眼と脳の研究への洞察を提供し、BRB BBB制御の根底にある分子メカニズムをよりよく理解し、障壁を越えた潜在的な薬物送達を探索することができます。まず、ヒト網膜微小血管内皮細胞またはHRMECを播種するための細胞培養フィルターインサートを準備し、各インサートを200マイクロリットルの0.1%ゼラチン溶液で層流フードの下で30分間コーティングします。溶液がフィルターインサートの底面全体を覆っていることを確認してください。培養HRMECを摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートしたペトリ皿を取り、成長培地を吸引します。層流フードの下で10ミリリットルの1X PBSで細胞を2回静かにすすぎ、潜在的な浮遊細胞または死細胞を取り除きます。細胞を0.5〜1ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTA溶液で解離し、ペトリ皿を摂氏37度および5%二酸化炭素のインキュベーターに5分間入れる。4.5〜9ミリリットルの増殖培地を加えてトリプシン活性を消光し、10ミリリットルのピペットを使用して細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。細胞を200倍gで室温で5分間回転させる。上清を注意深く取り除き、ペレットを3ミリリットルの増殖培地に再懸濁します。手動血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞数を数え、フィルターインサートあたり40, 000細胞の密度で播種します。各インサートの細胞懸濁液の容量は250マイクロリットルです。透過性インサートを含むウェルからコーティング溶液を吸引し、インサートあたり250マイクロリットルの細胞懸濁液を移してから、インサートの1つに培地のみを添加し、経内皮電気抵抗(TEER)測定のブランクコントロールとして使用されます。同時に、基底外側チャンバーにウェルあたり750マイクロリットルの培地も加えます。培養細胞が完全にコンフルエントになり、約20オーム/平方センチメートルの望ましいTEER値が達成されるまで、インキュベーター内の透過性インサートを備えた24ウェルプレートを摂氏37度、5%二酸化炭素で7〜12日間保持します。TEER測定の前に、セルを含む24ウェルプレートを室温の層流フードに15〜20分間置き、温度平衡化を行います。HRMECのTEERを測定するには、上皮ボルト/オームメーターの電気抵抗システムを使用して、電極をメーターに接続し、最初に電極を70%エタノールに15〜20分間浸してから、細胞培養EGM増殖培地に短時間浸して電極を平衡化します。短い方の先端がインサートに入り、長い方の先端がウェルの底に接触するように、電極を注意深く浸してTEER測定を実行します。最初にブランクコントロールの両端の抵抗を測定し、次に各インサートについて、TERを3連で測定します。約20オーム平方センチメートルのTEER値でコンフルエントに達したら、リガンドで処理する前に、両方のチャンバーでEBM中の0.5%FBSを使用して、摂氏37度と5%二酸化炭素で24時間細胞を血清から奪います。血清還元EBMをアッセイ全体を通して使用した。アピカルチャンバー内の血清還元培地を使用して、蛍光シアニン-3-タグとトランスフェリンリガンドを摂氏37度で60分間インキュベートします。単層を血清還元培地で頂端および基底外側に4回洗浄した後、細胞を含むフィルターインサートに新しい培地を追加し、予温した血清還元培地を含む24ウェルプレートの新鮮なウェルにインサートを移します。細胞をインキュベーター内でさらに90分間インキュベートし、次に基底外側チャンバーから培地を収集する。蛍光検出器を用いて基底外側チャンバーからの溶液の蛍光強度を記録する。約20オーム平方センチメートルのTEER値でコンフルエントに達したら、リガンドで処理する前に、両方のチャンバーでEBM中の0.5%FBSを使用して、摂氏37度と5%二酸化炭素で24時間細胞を血清から奪います。血清還元EBMをアッセイ全体を通して使用した。次に、頂端室内の細胞を所望の処理およびビヒクルコントロールで処理する。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を細胞に1ミリリットルあたり5ミリグラム加え、摂氏37度で15分間インキュベートします。新鮮な血清還元培地を頂端チャンバーに加え、インサートを予熱した培地を含む新鮮なウェルに移します。インキュベーター内でさらに90分間単層をインキュベートする。基底外側チャンバーから培地を回収した後、採取した培地に100マイクロリットルのHRP蛍光発生ペルオキシダーゼ基質を加え、室温で10分間インキュベートします。100マイクロリットルの停止溶液で反応を停止し、蛍光プレートリーダーを使用して培地中のHRP基質反応生成物のレベルを検出します。in vitroトランスサイトーシスアッセイを実証する前に、網膜における内皮細胞トランスサイトーシスの可視化が背景情報として示されている。ここで、光学顕微鏡画像は、DABで染色された3ヶ月齢の野生型マウス網膜切片からのHRPで満たされた血管内腔を示す。HRPは軌道後注入された。HRPで満たされた網膜血管は、光学顕微鏡下で暗褐色の沈殿物として見ることができます。透過型電子顕微鏡の超薄切片は、血液網膜内関門を横切るECトランスサイトーシスを示すRMECを備えたHRP充填トランスサイトーシス血管を示しています。ここで、大きな小胞は潜在的にマクロピノソームとルミノール側の赤血球を反映しています。TeM画像は、RMEC内のHRPで満たされた小さなトランスサイトーシス小胞、おそらくカベオラ小胞を示しています。CAV-1抗体とイソレクチンB4の免疫組織化学染色により、3ヶ月齢の野生型マウス網膜において、網膜血管内のカベオラ小胞のマーカーであるCAV-1の局在が示されました。網膜内皮細胞内の免疫金標識CAV-1のTeM画像を、CAV-1陽性のカベオラ小胞の拡大画像とともにここに示す。トランスフェリンを用いたHRMECにおけるクラスリン媒介ECトランスサイトーシスアッセイの場合、ここでの蛍光顕微鏡画像は、青色のDAPIで染色されたHRMEC内の赤色のエンドサイトーシスCy3トランスフェリンを示しています。HRPを用いたカベオラ媒介ECトランスサイトーシスの場合、ここでのWntシグナル伝達は、アッセイを実証するための例として使用される。Wntシグナル伝達は、カベオラ媒介ECトランスサイトーシスを調節するために最近発見されました。細胞を、Wnt経路活性化因子Wnt3a馴化培地および組換えNorrin、Wntシグナル伝達阻害剤XAV939およびそれらの反応性対照の有無にかかわらず処理した。WntアクチベーターはHRPベースのトランスサイトーシスのレベルを低下させ、XAV939によって逆転した。正しいTEER測定は、単層の完全性を判断するために重要です。不適切な取り扱い、温度変動、培地、培養期間など、さまざまな要因の影響を大きく受けます。このアッセイは、in vivo条件を模倣した共培養または3D有機型培養システムとして変更することができます。

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学ぶ内皮細胞トランスサイトーシスアッセイを用いた内血網膜バリア透過性評価法。ヒト網膜微小血管内皮細胞とホースラディッシュペルオキシダーゼを用いて、血管バリアの分子機構と創薬への応用を探索する。

内血網膜バリア透過性を評価するためのin vitro モデルとしての内皮細胞トランスサイトーシスアッセイ

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内血網膜バリア透過性を評価する ためのin vitro モデルとしての内皮細胞トランスサイトーシスアッセイ

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