Name: 量子ドットを介した免疫標識とそれに続く透過型電子顕微鏡法を用いた心臓におけるタンパク質の細胞内局在の可視化(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学ぶ量子ドット免疫標識と透過型電子顕微鏡法を用いた心臓組織におけるタンパク質の細胞内局在可視化法。マウス心臓を用いてミトコンドリア膜などの高解像度イメージングが可能となる。

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この研究は、国立衛生研究所の助成金によってサポートされました:R01HL145753、R01HL145753-01S1、R01HL145753-03S1、およびR01HL152723;MSBへのLSUHSC-S CCDSフィニッシュライン賞、COVID-19研究賞、およびLARC研究賞。LSUHSC-Sマルコムファイスト心臓血管およびCSAへのAHAポスドクフェローシップ(20POST35210789);LSUHSC-SマルコムファイストRAへの博士課程前フェローシップ。

このプロトコルの動物の取り扱い手順は、実験動物の世話と使用のためのガイド(第8版、国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ)に準拠し、ルイジアナ州立大学健康科学センター-シュリーブポートの動物管理および使用委員会によって承認されました。FVB / Nバックグラウンドを持つ生後6か月の雄マウスを本研究に使用しました。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。使用したマウスは、12時間の明暗サイクルを可能にするケージ内の十分に規制された環境に収容され、水と通常の固形飼料を 自由に提供され、実験動物の世話と使用のためのNIHガイドに従って世話をされました。全体的なプロセスを 図 1 に示します。
1.動物の準備
<ol><li>3%イソフルランを用いてマウスを麻酔する。中腹部の上の領域を水平に切開し、皮膚を引っ張って胸を開きます。慎重に、他の臓器に穴を開けずに胸腔を開くために別の切開を行います21,22,23。<ol><li>心臓を最初に 頂点に通し、次に右心室に心臓麻痺溶液中の冷たい3%グルタルアルデヒド(50 mM KCl、PBS中の5%デキストロース、 補足ファイル1を参照)を2分間使用して、完全な心筋弛緩を確実にします。</li>
	</ol></li>
	<li>氷冷した3%グルタルアルデヒドを0.1 Mのカコジル酸ナトリウムバッファー(pH 7.4、ステップ2.1.1)でさらに2分間灌流します。重力を使用して、25 G 5/8インチの針を使用して固定液を心臓に導入します。心臓が固定液で満たされ始めた直後に、心臓の頂点を持ち上げ、心臓から1〜2 mmのところで下の血管を切断して圧力を和らげ、液体を排出させます。</li>
	<li>心臓を解剖し、心房24を取り除き、心室をペトリ皿の氷冷した3%グルタルアルデヒド/ 0.1Mカコジル酸ナトリウムに落とします。固定の30〜60分後にバタフライカットを作成し、3%グルタルアルデヒド/カコジル酸塩を含むペトリ皿に入れます( 材料の表を参照)。グルタルアルデヒド/カコジル酸溶液中に1 mm3 の小さな立方体の外科用ブレードを使用して心臓を切り刻みます。</li>
	<li>解剖した心臓組織をグルタルアルデヒド/カコジル酸溶液に4°Cで24時間固定/浸漬します。</li>
</ol>2.心臓組織処理
<ol><li>24時間の固定後、組織を0.1 Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液で20分間洗浄します。<ol><li>以下の手順に従って0.1 Mカコジル酸バッファーを調製します。<ol><li>0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液を調製するには、カコジル酸ナトリウム(21.4 g)と1%塩化カルシウム溶液(3 mL)を90 mLの蒸留水に溶解して、1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液のストックを調製します。蒸留水を加えて溶液を100mLまで増やします。溶液をよくかき混ぜ、溶質を溶解するために一晩放置します。</li>
			<li>次に、1 mLの1 Mカコジル酸ナトリウムストック溶液を取り、80 mLの蒸留水に加えます。HClを使用してpHを7.4に調整し、蒸留水を加えて100mLまで容量します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>0.1 Mカコジル酸ナトリウムバッファーでさらに20分間洗浄を繰り返します。カコジル酸ナトリウムバッファーから組織を取り除き、室温で4時間、2%四酸化オスミウム溶液に浸します。このプロセスはオスミケーションと呼ばれます。<ol><li>以下の手順に従って、2%四酸化オスミウム溶液を調製します。<ol><li>2%四酸化オスミウム溶液を調製するには、4%四酸化オスミウム溶液、4 mL( 材料表を参照)、1 Mカコジル酸ナトリウムストック溶液(0.8 mL)、および蒸留水(3.2 mL)を取り、合計8 mL溶液を作ります。 注意: このプロセス全体とそれ以降の手順は、ドラフトで実行する必要があります。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>投与後、組織を2%酢酸ナトリウム溶液に室温で10分間浸します。<ol><li>4 gの酢酸ナトリウムを20 mLの蒸留水に溶解することにより、2%酢酸ナトリウム溶液を調製します。</li>
	</ol></li>
	<li>次に、組織を2%酢酸ウラニル溶液に室温で1時間浸漬する。<ol><li>4gの酢酸ウラニルを20mLの蒸留水に溶解することにより、2%酢酸ウラニル溶液を調製する。</li>
	</ol></li>
	<li>酢酸ウラニル染色後、 補足ファイル1に記載されている順序で、段階的なアルコールとアセトンを介して組織を順次脱水します。</li>
</ol>3.心臓組織の埋め込み
<ol><li>以下の手順に従って、脱水組織を低粘度エポキシ樹脂に埋め込みます。<ol><li>低粘度のエポキシ樹脂を作るには、10.24 mLのビニルシクロヘキセン(ERL 4221)エポキシモノマー、6.74 mLのポリプロピレングリコールのジグリシジルエーテル(DER 732)、および30.05 mLのノネニル無水コハク酸(NSA)( 材料の表を参照)を50 mLチューブに混合します。懸濁液を手で2分間よくかき混ぜます。</li>
		<li>エポキシ促進剤に2-ジメチルアミノエタノール(DMAE、 材料表を参照)を18滴加え、懸濁液を攪拌して成分を完全に混合します。</li>
		<li>以下の混合物の順序でエポキシ樹脂に組織を含浸させる。<ol><li>100%アセトンを1:1樹脂:アセトン懸濁液と交換し、その中の組織を室温で1時間浸します。</li>
			<li>1:1樹脂:アセトン懸濁液を6:1樹脂:アセトン懸濁液に交換し、その中に組織を3時間浸します。</li>
			<li>最後に、6:1レジン:アセトン懸濁液を100%レジン懸濁液に交換し、組織を室温で一晩浸したままにします。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>組織を8mmのマイクロモールド( 材料の表を参照)の新鮮な樹脂に入れ、埋め込まれた組織を70°Cで一晩硬化させます。 メモ: 硬化後にレジンが硬くてもろくないことを確認してください。</li>
</ol>4. ウルトラミクロトームを用いた組織切片作成
<ol><li>ウルトラミクロトームに取り付ける前に、ティッシュでレジンブロックを1mm以下にトリミングします( 材料の表を参照)。ウルトラミクロトームのセグメント化されたアームに金型をできるだけ正確に配置し、サンプル金型をダイヤモンドナイフに向かって手動で進めます。</li>
	<li>Histoナイフ( 材料表を参照)で500nm(2分の1ミクロン)の厚さの切片を切り取り、EMループツールを使用してそれらを持ち上げてスライドガラスの上に置きます。</li>
	<li>トルイジンブルーステイン25 のホットプレートにスライドガラスを置き、関心のある領域を見つけます。</li>
	<li>関心のある領域を見つけたら、Ultra 45°ナイフ( 材料表を参照)を使用して、淡い金色の超薄切片(100 nm)を作成します。これらの超薄切片を200メッシュの銅グリッドの鈍い側に配置します。</li>
</ol>5.極薄心臓切片染色
<ol><li>エッチング液、すなわち5%メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を用いて抗原のマスキングを解除することにより、染色を開始する。<ol><li>蒸留水中で500 μLの5%メタ過ヨウ素酸ナトリウム( 材料の表を参照)溶液を調製します。 注意: 使用前に新しい溶液を準備してください。</li>
		<li>20 μLのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液をきれいなパラフィンフィルムに入れます。組織切片を有する完全に乾燥したグリッドをエッチング溶液の液滴上に置く。 注意: 組織セクションのあるグリッドの鈍い側は、エッチング液の方を向いている必要があります。</li>
		<li>セクショングリッドを室温で30分間溶液上に放置します。</li>
	</ol></li>
	<li>エッチングした組織切片を蒸留水の液滴の上に60秒間置き、洗浄します。</li>
	<li>セクショングリッドを0.05 Mグリシン溶液の液滴に室温で10分間配置することにより、残留アルデヒドをブロックします。グリッドの端をろ紙で拭き取り、残留グリシン溶液を除去します。<ol><li>3.75 mgのグリシンを1 mLの1x PBS(pH 7.4)に溶解することにより、0.05 Mグリシン溶液( 材料の表を参照)を調製します。</li>
	</ol></li>
	<li>セクショングリッドを10〜20μLのブロッキング溶液に室温で25分間入れます。 注:ブロッキング溶液組成:2 μLの1%正常ヤギ血清(NGS)+ 20 μLの1%BSA(最終濃度:10%)+ 178 μLの1x PBS(pH 7.4)で最終容量200 μLを作ります。</li>
	<li>グリッドエッジをろ紙で拭き取り、グリッドセクションを抗体希釈液に置き、室温で10分間コンディショニングします。</li>
	<li>グリッド切片を一次抗体(この場合はSigmar1、 材料表を参照、抗体希釈液で1:10に希釈)とともに加湿チャンバー内で1時間30分間インキュベートします。</li>
	<li>グリッドを吸い取り乾燥し、グリッド切片を抗体希釈液でそれぞれ5分間2回洗浄します。</li>
	<li>グリッド切片をビオチン化二次抗体(この場合、ビオチン化ヤギ抗ウサギポリクローナル二次抗体、 材料表を参照;抗体希釈液で1:10に希釈)で加湿チャンバー内で1時間インキュベートします。</li>
	<li>グリッドを吸い取り乾燥し、グリッド切片を抗体希釈液でそれぞれ5分間2回洗浄します。</li>
	<li>市販のストレプトアビジン結合量子ドット(QD655nm、 材料表を参照、抗体希釈液で1:10に希釈)でグリッド切片を室温の加湿チャンバー内で1時間インキュベートします。チャンバーをアルミホイルで覆って、光への暴露を防ぎます。</li>
	<li>ろ紙を使用してグリッドの端を吸い取り乾燥し、グリッドセクションを水滴の上に2分間置いて洗浄します。</li>
	<li>グリッドの端を拭いて乾かします。</li>
</ol>6. 透過型電子顕微鏡(TEM)イメージング
<ol><li>極薄切片を試料カルテットホルダーの銅グリッド上に置き、電子ビームのグリッドを選択できる位置にクランプします。</li>
	<li>試料ホルダーを顕微鏡カラムに挿入し、ポンプスイッチを使用してゴニオメーターを排気した後、試料ホルダーを顕微鏡カラムに完全に挿入します( 材料表を参照)。</li>
	<li>電圧を80kVに設定してから、画像観察用のビームを生成してください。</li>
	<li>目的の領域にしっかりと焦点を合わせ、高速デジタルカメラを使用して画像をキャプチャし、ファイルを.tif形式で保存します。 注:この研究で画像を撮影するための顕微鏡設定は、加速電圧または高圧電圧80kV、倍率20,000倍でした。</li>
</ol>

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本研究では、QDを介した免疫標識を使用して、Sigmar1の細胞内局在をはっきりと示しました。QDを用いて、ミトコンドリア膜、特にミトコンドリア内膜上のSigmar1の局在を心臓組織に描写した。さらに、Sigmar1は、図2A-Dに示すように、筋質/小胞体(S / ER)およびリソソーム上に超微細構造レベルで位置していることもわかりました。
このプロトコルの重要なステップは、高濃度のメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を使用して、グルタルアルデヒドの固定および投与後に抗原をマスク解除するエッチングまたは抗原のマスク解除ステップです。このプロトコルでは、高濃度(5%)のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを室温で30分間使用した。メタ過ヨウ素酸ナトリウムのインキュベーションの持続時間が長くなったり、濃度が高くなったりすると、構造の凝集、細胞小器官の膜定義の喪失、切片の穿孔が発生し、タンパク質や構造の視覚化が困難になるため、このステップでは特別な注意が必要です。あるいは、5%メタ過ヨウ素酸の代わりに、30分間の2段階の低濃度(3%)メタ過ヨウ素酸溶液を使用することもできます。研究は、このオプションが1ステップ30分のインキュベーションのための5%メタ過ヨウ素酸溶液と同様の結果を示すことを示した。しかしながら、30分間のインキュベーションのための3%メタ過ヨウ素酸溶液は、26、27、28のプロセスに対するより良い制御を提供する。当初、このプロトコルは、10%メタ過ヨウ素酸溶液で切片を30分間インキュベートすることを使用した。しかし、この濃度によって組織切片に生成される穿孔が多すぎるため、メタ過ヨウ素酸溶液の最終濃度とインキュベーション期間は先細りになり、30分間5%に最適化されました。
別のステップでは、グルタルアルデヒドによる固定時間の最適化が必要でした。組織の最適でない固定は不十分なQD標識をもたらしますが、組織の過剰固定はより高い非特異的標識をもたらします。したがって、タンパク質の適切かつ特異的な標識のための最適な組織固定レベルを決定し、滴定する際には、慎重な検討が必要です。心臓組織を用いたこの方法では、グルタルアルデヒドによる固定時間を24時間および48時間を時点として滴定した。両方の時点で固定された切片の染色画像に基づいて、24時間固定された切片がより良い結果を示すことがわかった。現在までに、QDナノ結晶は、525、565、585、605、655、および705nmを含む複数のサイズで入手可能である11,29。これらの量子ドットはそれぞれ独自の発光スペクトルを持ち、異なる波長で蛍光を発します。さらに、異なるサイズのこれらの市販の量子ドットは異なる形状を示します。たとえば、QD 525、565、および585は、サイズが異なる仮想球形ですが、QD 605、655、および705は不規則な長方形の形状です。これらの異なるQDナノ結晶のうち、QD525、565、および655は互いに容易に区別可能である11、29。発光スペクトルと形状のこれらの違いにより、QDはタンパク質のマルチラベリングや蛍光および電子顕微鏡による視覚化の優れた候補となります。この研究では、市販のQDであるQD 655を使用してSigmar1タンパク質を標識し、染色切片の非特異的バックグラウンドと区別しました。
高解像度顕微鏡におけるタンパク質標識のためのQDの別の対応物は、免疫金粒子である。イムノゴールド粒子は、従来、高解像度顕微鏡用のタンパク質の標識に使用されています。これらの金粒子は、量子ドットナノ結晶と比較して電子密度が高く、容易に識別できます。しかし、QDは、組織への浸透性、安定性と貯蔵寿命、および超微細構造成分の保持性が高いため、効率が向上し、タンパク質標識の候補として適しています4,5。QDはまた、光学顕微鏡と電子顕微鏡の両方で検出される独自の能力を備えており、イムノゴールド標識10よりもその価値を高めます。
このQD媒介免疫標識の1つの制限は、処理中の四酸化オスミウムの使用です。四酸化オスミウムは、電子密度が低く、コントラストの少ない生体膜構造の電子密度、導電率、およびコントラストを増加させるために使用されます5,30。しかしながら、四酸化オスミウムを瞬間的かつ不可逆的に使用すると、QD6で標識されたときに蛍光を生じる標本の特性を破壊する。これにより、蛍光顕微鏡でのQDの使用が制限されます。四酸化オスミウムの使用を省略した代替アプローチは、蛍光特性を保持する上で有利であり、したがってQD媒介免疫標識の二重適用において有利であろう。TEMの新しいモデルの中には、材料の元素組成を識別できるエネルギー分散型X線分析(EDX)システムを取り付けるオプションがあります。この研究のもう一つの制限は、EDXを使用したサンプルと画像分析の元素マッピングの欠如です。したがって、今後の研究では、元素組成を分析するためにQDスペクトルのEDX分析に焦点を当てる必要があります。
タンパク質のQD標識は、近年多くの注目を集めています。QDは、生物学的研究と医療治療の両方でいくつかのアプリケーションと利点を提供します。さらに多座配位子で包まれたQDは、量子収率を維持しながら安定性が向上した。さらに、これらの生物学的に有利な薬剤でQDをカプセル化すると、組織におけるバイオアベイラビリティも向上し、腫瘍の検出、生細胞イメージング、薬物送達、および組織イメージングにおける潜在的なアプリケーションの優れた候補になります3,31,32。

人体は、多くの身体機能を担う多くのタンパク質で構成されています。タンパク質の機能は、臓器および細胞小器官におけるそれらの局在に大きく依存する。細胞内分画、免疫蛍光、界面活性剤を介したタンパク質抽出など、いくつかの手法がタンパク質の細胞内局在を決定するために一般的に使用されています1,2。免疫蛍光色素を用いた顕微鏡検査は、これらの技術の中で最も広く使用されている方法です。しかしながら、この技術で用いられる蛍光色素は安定性が低く、光退色を起こしやすい3。その他の技術では、電子密度の高い重金属(金、フェリチン)または量子ドットナノ結晶でタンパク質を免疫標識し、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用してそれらを視覚化することにより、超微細構造レベルでタンパク質を視覚化する高解像度顕微鏡法が含まれていました4,5。
QDは、制御可能なフォトルミネッセンス特性を持つ半導体金属化合物からなる半導体ナノ結晶であり、生体系において大きな意味を持っています3。QDナノ結晶は、ナノ結晶がナノ結晶の形成にカプセル化され、適切な安定性と機能を保証するコアシェル形式で製造されます。一般的に使用されるコアシェルナノ結晶の組み合わせは、CdSe / ZnS、CdSe / CdS CdSe / ZnSe、CdTe / CdS、CdTe / ZnS、およびCdTe / CdS / ZnS(コア/シェル/シェル)3です。これらのナノ結晶の組み合わせの中で、CdSe/ZnSおよびCdSe/CdSは最も活発に研究されており、二次抗体複合体として頻繁に使用されています3,6。これらのQDナノ粒子は、従来の蛍光色素とは異なる励起スペクトルと発光スペクトルを持つ蛍光特性も備えています。QDは、バルク価電子帯からの電子の励起を利用して、従来の蛍光色素と比較して高い蛍光量子収率を示します。半導体金属のナノ結晶配置により、QDを介した標識がより安定し、光退色に耐性があります6。さらに、QDのナノ結晶コアとその結晶構造により、異なるサイズのQDが広範囲の吸収スペクトルと非常に狭い発光ピークを持つことができます7。さらに、これらのQD粒子は、高い電子密度を生成するのに十分な大きさであり、透過型電子顕微鏡法を含む高分解能顕微鏡技術に有用です5,8,9。これらのQDナノ結晶は、異なる蛍光発光スペクトルおよび形状を有する複数のサイズで市販されており、複数の抗体による標識の優れた候補となっています10,11。
QD技術は、生細胞イメージング、細胞内の輸送機構の研究、タンパク質の拡散運動の膜輸送、細胞の機能的不均一性、細胞内オルガネラのマーキングなど、複数の機能特性により、生物学的研究において大きな重要性を誇っています3,12,13,14,15,16。.QDは、がん組織の標的化と検出、腫瘍の分子プロファイルと免疫状態の特徴付け、硝子体と網膜上膜の視覚化のための分子診断にも役立ちます3,17,18。さらに、QDは、眼に薬を送達することにより、光線力学療法および眼科異常を介して腫瘍悪性腫瘍を治療するための内科療法にも使用できます3,17,18,19。
これらの非常に有用なQDナノ結晶を用いて、本研究では、Sigma 1受容体(Sigmar1)という名前のタンパク質の細胞内局在を決定しました。Sigmar1は、遍在的に発現するマルチタスク分子シャペロンタンパク質です。異なる組織および器官におけるSigmar1の細胞内局在に焦点を当てた広範な研究は、分子機能を誘発する細胞および組織型特異的な細胞内局在を報告した20。異なる生化学的アプローチを用いた異なる細胞(神経細胞、光受容体、免疫細胞)および組織(肝臓および脳)において、小胞体(ER)、ミトコンドリア関連小胞体(MAM)、核膜、原形質膜、核膜、核、およびミトコンドリアにおけるSigmar1の局在が報告された。これらすべての研究にもかかわらず、心臓におけるSigmar1の細胞内局在は未知のままでした20。したがって、心臓組織におけるSigmar1の細胞内局在は、QD媒介免疫標識とそれに続くTEMイメージングを使用して決定されました。

<table><tbody><tr><td>200メッシュ銅グリッド</td><td>テッド・ペラ</td><td>G200HH</td><td></td></tr><tr><td>6ヶ月齢の雄マウス、FVB/N背景</td><td>ジャクソン研究所、バーハーバー、ME</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトン 100%</td><td>フィッシャー・ケミカル</td>ズ <td>A949</td><td></td></tr><tr><td>抗体希釈剤</td><td>ダコ</td><td>S3022</td><td></td></tr><tr><td>抗シグマー1抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>61994S</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化ヤギ 抗ウサギ IgG 抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7389</td><td></td></tr><tr><td>BSAc (10%)</td><td>, Electron Microscopy Sciences</td><td>25557</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal Xyl</td><td>Thermo fisher</td><td>8312-4</td><td></td></tr><tr><td>DER 732C36AA10:C33</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>13010</td><td></td></tr>, <tr><td>デキストロース</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンド ナイフ</td><td>ジアトーム</td><td>ヒスト;Ultra 450</td><td></td></tr><tr><td>DMAE</td><td>電子顕微鏡</td><td>科学 13300</td><td></td></tr><tr><td>電子顕微鏡</td><td>JEOL JEOL-1400 Flash</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ERL 4221</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15004</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 100%</td><td>フィッシャーケミカル</td>ズ <td>A405P</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド 3%</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>16538-15</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13816</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric</td><td>Acid, Fisher Scientific</td><td>SA56</td><td></td></tr>, <tr><td>Micromolds,</td><td>Ted Pella</td><td>10505</td><td></td></tr>, <tr><td>Microtome</td><td>Leica Microsystem</td>, <td>EM UC7</td><td></td></tr>, <tr><td>Normal goat serum</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>NSA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19050, 19050</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>ジェネッセ科学</td><td>16-101</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム 一塩基性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71640</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 655 ストレプトアビジン コンジュゲート</td><td>Invitrogen</td><td>Q10121MP</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP334</td><td></td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>メタ過ヨウ酸ナトリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>外科用ブレード (サイズ 10)</td><td>アスペン外科</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>TEM&nbsp; 画像ソフトウェア</td><td>AMT-V700</td><td>AMT TEM イメージングシステム</td> TEM イメージングカメラ <td></td></tr><tr><td></td><td>XR80 TEM シリーズ</td><td>AMT TEM イメージングシステム</td><td></td></tr><tr><td>トルイジンブルー O ソリューション (0.5%)</td> <td>フィッシャーサイエンティック</td><td>S25612</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td><td>ポリサイエンス</td><td>21447</td><td></td></tr></tbody></table>

量子ドットを介した免疫標識とそれに続く透過型電子顕微鏡法を用いた心臓におけるタンパク質の細胞内局在の可視化(英語)

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy

細胞内局在は、適切な機能を描写し、特定のタンパク質の分子メカニズムを決定するために重要です。タンパク質の細胞内局在を決定するために、いくつかの定性的および定量的技術が使用される。タンパク質の細胞内局在を決定するための新しい技術の1つは、タンパク質の量子ドット(QD)を介した免疫標識とそれに続く透過型電子顕微鏡(TEM)によるイメージングです。QDは、結晶構造と高電子密度の二重の性質を持つ半導体ナノ結晶であり、電子顕微鏡に応用できます。この現在の方法では、心臓組織におけるQD-TEMを用いて、Sigma 1受容体(Sigmar1)タンパク質の細胞内局在を微細構造レベルで可視化しました。野生型マウスからの心臓組織切片の小さな立方体を3%グルタルアルデヒドで固定し、続いてオスミケートし、酢酸ウラニルで染色し、続いてエタノールおよびアセトンで順次脱水した。これらの脱水心臓組織切片を低粘度エポキシ樹脂に包埋し、厚さ500nmの薄切片に切断し、グリッド上に置き、続いて5%メタ過ヨウ素酸ナトリウムによる抗原アンマスキングを行い、続いて残留アルデヒドをグリシンでクエンチした。組織をブロックした後、一次抗体、ビオチン化二次抗体、およびストレプトアビジン結合QDで順次インキュベートしました。これらの染色切片をブロット乾燥し、TEMを用いて高倍率で画像化した。QD-TEM法により、心臓の微細構造レベルで Sigmar1タンパク質の細胞内局在を可視化することができました。これらの技術は、あらゆる臓器系における任意のタンパク質および細胞内局在の存在を視覚化するために使用することができる。

本QD-TEM法は、成体マウス超薄型心臓切片に抗Sigmar1標的QD標識を行うことにより、Sigmar1の存在とその細胞内心臓区画上の局在を可視化した。ミトコンドリア膜(内側と外側)、リソソーム、および小胞体/筋小胞体(ER / SR)膜-ミトコンドリア界面(図2A、B)上の電子密度の高い抗Sigmar1標識QDをQD-TEM画像で示しました。さらに、心臓切片は、抗Sigmar1ウサギ一次抗体のアイソタイプ対照としてウサギIgGおよびQDでも標識されました(図2C、D)。したがって、QD-TEMイメージングは、内因性Sigmar1の局在と、主にリソソームとミトコンドリア膜でのその濃縮を強調しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64085/64085fig01.jpg"> 図1:QD-TEMを実行するために使用される一連の手順と手順を示す概略図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64085/64085fig02.jpg"> 図2:成体マウス心臓組織におけるSigmar1免疫標識QD 。 (A,B)ミトコンドリア(外膜および内膜)、ミトコンドリア関連小胞体(ER)/筋小胞体(SR)膜、およびリソソーム上のSigmar1標識QDを示す代表的なTEM画像。(C,D)QDsおよびウサギIgGで標識されたアイソタイプコントロールの心臓切片のTEM画像。スケールバー:200 nm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:組織脱水に使用されるPBSおよびその他の溶液の組成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

本プロトコルは、量子ドットを用いて心臓組織切片中のタンパク質を免疫標識する方法を記載する。この技術は、あらゆるタンパク質の細胞内局在と発現を微細構造レベルで視覚化するための有用なツールを提供します。

The subcellular localization is critical to delineating proper function and determining the molecular mechanisms of a particular protein. Several ...

タンパク質の細胞内局在を決定することは、その適切な機能とそれに関与するメカニズムを描写するために重要です。この方法は、タンパク質の細胞内局在を超構造レベルで可視化するのに役立ちます。量子ドットを介した免疫標識は、より安定しており、光退色に耐性があり、独自の発光スペクトルを持ち、高い電子密度をもたらし、組織への浸透性が高く、組織上でより高い効率と保持を示します。プロセスの複数のステップ、すなわち固定、エッチング、ブロッキング、および最適な量子ドット濃度は、最適化するのが難しいステップです。使用する試薬の複数の時点と濃度を試すことをお勧めします。もう一つの課題は、忍耐と、もちろん練習だけが機能するグリッドを処理することです。手順を実演するのは、郵便フェローのチョウドリー・アブドラ、私の研究室の大学院生であるナズニン・レメックス、電子顕微鏡サービスの電子顕微鏡スーパーバイザーであるブランドン・ハートマンです。マウスに麻酔をかけ、胸腔を開いた後、0.1モルのカコジル酸ナトリウムバッファーに氷冷した3%グルタルアルデヒドを2分間使用して心臓を大量に使用します。5 x 8インチの25ゲージの針を使用して、重力圧力を使用して固定液を心臓に導入します。心臓が固定剤で満たされ始めた直後に、心臓の頂点を持ち上げて圧力を和らげます。心臓から1〜2ミリメートルで下の血管を切り取り、液体を排出させます。心臓を解剖します。心房を取り除き、氷冷した3%グルタルアルデヒドと0.1モルのカコジル酸ナトリウムを含むペトリ皿に心室を落とします。固定の30〜60分後にバタフライカットを作成し、心室をペトリ皿に戻します。1立方ミリメートルの小さな立方体の外科用ブレードを使用して心臓を切り刻みます。解剖した心臓組織をグルタルアルデヒドとカコジル酸溶液に固定し、摂氏4度で24時間浸します。24時間の固定後、組織を0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液で20分間2回洗浄する。カコジル酸ナトリウムバッファーから組織を取り除き、2%四酸化オスミウム溶液に室温で4時間浸します。投与後、組織を2%酢酸ナトリウム溶液に室温で10分間浸します。次に、組織を2%酢酸ウラニル溶液に室温で1時間浸漬する。酢酸ウラニル染色後、段階的なアルコールとアセトンを通して組織を順次脱水します。原稿に記載されているように、脱水組織を低粘度エポキシ樹脂に埋め込みます。組織を8ミリメートルのマイクロモールドで新しい樹脂に入れ、埋め込まれた組織を摂氏70度で一晩硬化させます。関心のある領域を見つけたら、超45度のナイフを使用して、淡い金色の超薄切片を作成します。これらの超薄切片を200メッシュの銅グリッドの鈍い側に配置します。透明なパラフィンフィルム上にメタ過ヨウ素酸20マイクロリットルのエッチング液を入れて抗原をマスク解除して染色を開始します。組織切片を有する乾燥したグリッドをエッチング液の液滴上に置く。室温で30分間溶液上の断面グリッドを残す。エッチングした組織切片を蒸留水の液滴の上に60秒間置き、洗浄します。セクショングリッドを0.05モルのグリシン溶液の液滴に室温で10分間配置することにより、残留アルデヒドをブロックします。グリッドの端をろ紙で拭き取り、残留グリシン溶液を除去します。セクショングリッドを10〜20マイクロリットルのブロッキング溶液に室温で25分間入れます。グリッドエッジをろ紙で拭き取り、グリッド切片を抗体希釈液に置き、室温で10分間コンディショニングします。グリッド切片を一次抗体とともに加湿チャンバー内で1時間30分間インキュベートします。グリッドを吸い取り乾燥し、グリッド切片を抗体希釈液で2回、それぞれ5分間洗浄します。グリッド切片をビオチン化二次抗体とともに加湿チャンバー内で1時間インキュベートします。グリッドがブロット乾燥されたら、グリッド切片を抗体希釈液で2回、それぞれ5分間洗浄します。グリッド切片を市販のストレプトアビジン結合QD中で室温のチャンバー内で1時間インキュベートする。チャンバーをアルミホイルで覆って、光への暴露を防ぎます。ろ紙を使用してグリッドエッジを吸い取り乾燥した後、グリッドセクションを水滴の上に2分間置き、グリッドエッジをブロットして乾燥させます。試料ホルダーを顕微鏡カラムに挿入し、ポンプスイッチを使用してゴニオメーターを評価し、続いて試料ホルダーを顕微鏡カラムに完全に挿入します。目的の領域によく焦点を合わせます。高速デジタルカメラを使用して画像をキャプチャし、ファイルをtif形式で保存します。ミトコンドリア膜、リソソーム、および小胞体または筋小胞体膜ミトコンドリア界面には、Sigmar1標識量子ドットの存在が示された。心臓切片は、抗Sigmar1ウサギ一次抗体のアイソタイプコントロールとしてウサギ免疫グロブリンGおよび量子ドットを用いて視覚化した。このプロトコルに取り組む際に考慮すべき重要なことの1つは、抗原のマスクを解除する時間です。組織切片のエッチングが長すぎると、メタテンゲート溶液は薄い組織切片に穿孔を作成します。量子ドットを介した標識は、腫瘍の検出、腫瘍の分子および免疫状態のプロファイリング、および医療診断の新しい方法を開く組織イメージングで注目を集めています。量子ドットは、光線力学療法による腫瘍の治療や、眼に薬を送達することによる眼科異常の治療にも役立ちます。

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