量子ドットを介した免疫標識とそれに続く透過型電子顕微鏡法を用いた心臓におけるタンパク質の細胞内局在の可視化(英語)

タンパク質の細胞内局在を決定することは、その適切な機能とそれに関与するメカニズムを描写するために重要です。この方法は、タンパク質の細胞内局在を超構造レベルで可視化するのに役立ちます。量子ドットを介した免疫標識は、より安定しており、光退色に耐性があり、独自の発光スペクトルを持ち、高い電子密度をもたらし、組織への浸透性が高く、組織上でより高い効率と保持を示します。

プロセスの複数のステップ、すなわち固定、エッチング、ブロッキング、および最適な量子ドット濃度は、最適化するのが難しいステップです。使用する試薬の複数の時点と濃度を試すことをお勧めします。もう一つの課題は、忍耐と、もちろん練習だけが機能するグリッドを処理することです。

手順を実演するのは、郵便フェローのチョウドリー・アブドラ、私の研究室の大学院生であるナズニン・レメックス、電子顕微鏡サービスの電子顕微鏡スーパーバイザーであるブランドン・ハートマンです。マウスに麻酔をかけ、胸腔を開いた後、0.1モルのカコジル酸ナトリウムバッファーに氷冷した3%グルタルアルデヒドを2分間使用して心臓を大量に使用します。5 x 8インチの25ゲージの針を使用して、重力圧力を使用して固定液を心臓に導入します。

心臓が固定剤で満たされ始めた直後に、心臓の頂点を持ち上げて圧力を和らげます。心臓から1〜2ミリメートルで下の血管を切り取り、液体を排出させます。心臓を解剖します。

心房を取り除き、氷冷した3%グルタルアルデヒドと0.1モルのカコジル酸ナトリウムを含むペトリ皿に心室を落とします。固定の30〜60分後にバタフライカットを作成し、心室をペトリ皿に戻します。1立方ミリメートルの小さな立方体の外科用ブレードを使用して心臓を切り刻みます。

解剖した心臓組織をグルタルアルデヒドとカコジル酸溶液に固定し、摂氏4度で24時間浸します。24時間の固定後、組織を0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液で20分間2回洗浄する。カコジル酸ナトリウムバッファーから組織を取り除き、2%四酸化オスミウム溶液に室温で4時間浸します。

投与後、組織を2%酢酸ナトリウム溶液に室温で10分間浸します。次に、組織を2%酢酸ウラニル溶液に室温で1時間浸漬する。酢酸ウラニル染色後、段階的なアルコールとアセトンを通して組織を順次脱水します。

原稿に記載されているように、脱水組織を低粘度エポキシ樹脂に埋め込みます。組織を8ミリメートルのマイクロモールドで新しい樹脂に入れ、埋め込まれた組織を摂氏70度で一晩硬化させます。関心のある領域を見つけたら、超45度のナイフを使用して、淡い金色の超薄切片を作成します。

これらの超薄切片を200メッシュの銅グリッドの鈍い側に配置します。透明なパラフィンフィルム上にメタ過ヨウ素酸20マイクロリットルのエッチング液を入れて抗原をマスク解除して染色を開始します。組織切片を有する乾燥したグリッドをエッチング液の液滴上に置く。

室温で30分間溶液上の断面グリッドを残す。エッチングした組織切片を蒸留水の液滴の上に60秒間置き、洗浄します。セクショングリッドを0.05モルのグリシン溶液の液滴に室温で10分間配置することにより、残留アルデヒドをブロックします。

グリッドの端をろ紙で拭き取り、残留グリシン溶液を除去します。セクショングリッドを10〜20マイクロリットルのブロッキング溶液に室温で25分間入れます。グリッドエッジをろ紙で拭き取り、グリッド切片を抗体希釈液に置き、室温で10分間コンディショニングします。

グリッド切片を一次抗体とともに加湿チャンバー内で1時間30分間インキュベートします。グリッドを吸い取り乾燥し、グリッド切片を抗体希釈液で2回、それぞれ5分間洗浄します。グリッド切片をビオチン化二次抗体とともに加湿チャンバー内で1時間インキュベートします。

グリッドがブロット乾燥されたら、グリッド切片を抗体希釈液で2回、それぞれ5分間洗浄します。グリッド切片を市販のストレプトアビジン結合QD中で室温のチャンバー内で1時間インキュベートする。チャンバーをアルミホイルで覆って、光への暴露を防ぎます。

ろ紙を使用してグリッドエッジを吸い取り乾燥した後、グリッドセクションを水滴の上に2分間置き、グリッドエッジをブロットして乾燥させます。試料ホルダーを顕微鏡カラムに挿入し、ポンプスイッチを使用してゴニオメーターを評価し、続いて試料ホルダーを顕微鏡カラムに完全に挿入します。目的の領域によく焦点を合わせます。

高速デジタルカメラを使用して画像をキャプチャし、ファイルをtif形式で保存します。ミトコンドリア膜、リソソーム、および小胞体または筋小胞体膜ミトコンドリア界面には、Sigmar1標識量子ドットの存在が示された。心臓切片は、抗Sigmar1ウサギ一次抗体のアイソタイプコントロールとしてウサギ免疫グロブリンGおよび量子ドットを用いて視覚化した。

このプロトコルに取り組む際に考慮すべき重要なことの1つは、抗原のマスクを解除する時間です。組織切片のエッチングが長すぎると、メタテンゲート溶液は薄い組織切片に穿孔を作成します。量子ドットを介した標識は、腫瘍の検出、腫瘍の分子および免疫状態のプロファイリング、および医療診断の新しい方法を開く組織イメージングで注目を集めています。

量子ドットは、光線力学療法による腫瘍の治療や、眼に薬を送達することによる眼科異常の治療にも役立ちます。