生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

このプロトコルは、膜結合タンパク質に取り組んでいる人々が、膜形状がタンパク質集合体の組織化においてどのように役割を果たすかを決定するための指針となります。この技術の主な利点は、タンパク質の種類、膜組成、および膜の形状に対する汎用性です。また、脂質二重層が関連タンパク質の特性をどのように変化させることができるかについての調査も可能にします。

実験に適した膜を特定するには、脂質拡散速度、目的のタンパク質の移動度、および表面に付着していないリポソームまたは融合リポソームがあるかどうかを含むチェックリストを確立することをお勧めします。スライドのプラズマ洗浄を開始するには、プラズマクリーナーを酸素で5分間パージして、ラインとチャンバーから空気を除去します。ドライカバーガラススライドをセラミッククレードルに配置します。

パージ中は、マイクロカバーガラススライドに不活性ガスを流して、ほこりや微粒子を取り除きます。カバーガラスがチャンバーの長辺と平行になるように、プラズマチャンバーの背面にクレードルを配置します。プラズマクリーナーを最大電力の酸素で15分間実行します。

チャンバー調製のために、0.2ミリリットルのPCRチューブのつや消し部分のすぐ下のキャップを切り取ります。PCRチューブのリムをUV活性化接着剤でコーティングし、チューブの内側を避けます。PCRチューブ接着剤をプラズマ洗浄カバーガラスの中央にそっと置き、チャンバーを長波長UV光の下に5〜7分間置き、接着剤を硬化させます。

二重層を形成するには、試薬をウェルに追加します。チャンバーを左右にゆっくりと振ってSUVを混乱させ、摂氏37度で20分間インキュベートします。インキュベーション後、ピペッティングにより150マイクロリットルのSLBBで二重層を6回すすぎ、余分な脂質を洗い流し、次にセプチンと一緒にインキュベートする前に150マイクロリットルの反応バッファーで二重層を6回洗浄します。

最後の洗浄ステップで、反応バッファーを除去し、ウェルに75マイクロリットルを残します。SSBで希釈した25マイクロリットルのセプチンを加え、TIRF顕微鏡で画像化します。まず、シリカミクロスフェアを含むボトルを15秒間ボルテックスし、次に1分間超音波処理し、15秒間再びボルテックスしてクラスターを破壊します。

ビーズをSLBBと10マイクロリットルの5ミリモルSUVと低接着マイクロ遠心チューブで混合します。ビーズ脂質混合物をシェーカー上で室温で1時間インキュベートし、沈降を防ぎます。その間に、ペグ化されたカバーガラスを解凍し、カットした0.2ミリリットルのPCRチューブを接着します。

インキュベーション後、指定されたRCFでビーズを30秒間遠心分離します。最初のスピンの後、50マイクロリットルの上清を取り除き、次に200マイクロリットルのPRBを加え、激しいピペッティングで混合します。次のラウンドでは、200マイクロリットルのPRBを削除し、2回目と3回目のスピン後にさらに200マイクロリットルを追加し、4回目のスピン後に220マイクロリットルのPRBを追加します。

複数のビーズサイズで競合アッセイを行う場合は、各ビーズサイズの等量を混合し、このビーズ混合物29マイクロリットルを721マイクロリットルの反応バッファーで希釈し、次に75マイクロリットルの希釈ビーズとSSBで希釈した25マイクロリットルのタンパク質をウェルに加えて混合して反応を準備します。定常状態でセプチンを測定する場合は、混合物を室温で1時間インキュベートしてから、TIRFまたは共焦点顕微鏡でイメージングします。緑色で示されているセプチンとインキュベートした平面SLBのTIRF顕微鏡写真は、均一なタンパク質分布を示した。

洗浄が不十分なガラスカバースリップで作られたSLBは、低セプチンの領域で二重層に穴または隙間を示しました。アンバーストおよびチューブ状のリポソームは、古いリポソームが使用されている場合、または洗浄が厳格でない場合、表面に蓄積する可能性があります。ローダミンPEを用いて可視化した脂質被覆ミクロスフェアの顕微鏡写真では、滑らかな二層沈着を示した。

球状の支持体は膜によって均一にコーティングされており、ビーズクラスターはほとんどありませんでした。過剰な脂質の不十分な洗浄は、脂質凝集塊によって観察されるように不均一な膜コーティングを引き起こし、不適切な取り扱いは二重層にギャップを引き起こしました。ビーズの混合が不十分な場合、凝集が発生し、総タンパク質吸収の測定には理想的ではありません。

ここで提示された支持された脂質二重層を使用して、蛍光寿命イメージング顕微鏡、膜の質量サイトメトリー、および高速原子間力顕微鏡などの他の方法を実行して、異なるタンパク質-タンパク質またはタンパク質-膜動態を調べることができる。