Name: ゼブラフィッシュ脳に侵入する膠芽腫細胞における微小管動態のライブイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ脳への膠芽腫細胞注入と高解像度ライブイメージングを用いた微小管動態解析法。in vivoでがん浸潤メカニズムを詳細に観察し、細胞移動に関与するタンパク質の機能解析に応用可能です。

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P. Herbomel博士(フランス、パスツール研究所)と彼の研究室、特にValérie BriolatとEmma Colucci-Guyonに、ゼブラフィッシュラインとマイクロインジェクションプレート用のプラスチック金型を提供していただき、ゼブラフィッシュの実験手順に関する貴重な専門知識を提供してくださったことに非常に感謝しています。UtechSフォトニックバイオイメージング(C2RT、パスツール研究所、フランス国立研究機関フランスバイオイメージングの支援、およびANR-10-INBS-04;未来への投資)。この研究は、リーグコントレルガン(EL2017。LNCC)、国立科学研究センター、パスツール研究所、そしてマルグリット・ミシェル夫人とポルケ氏の寛大な寄付によって。

著者は開示する利益相反を持っていません。

腫瘍異種移植片を単一細胞分解能でイメージングすることは、GBM生物学の理解を深めるために不可欠なツールになる可能性があります。マウスPDXモデルにおけるライブイメージングは、GBMが集合的に脳組織にどのように侵入するかについての貴重な発見をもたらした18。しかし、今日まで、時空間分解能はGBMの侵入を制御するタンパク質のダイナミクスを明らかにするのに十分なほど高くはありません。我々は、透明なゼブラフィッシュ幼虫におけるGBM細胞の同所性生着と高解像度の生体内イメージングを組み合わせることにより、MTなどの細胞骨格タンパク質を十分に詳細に解析し、 in situGBM 侵入中の動態を解析できると推論しました。
方法論の重要なステップは、GBM細胞の調製とマイクロインジェクション手順にあります。不健康で不適切に解離した細胞は、一緒にまたは毛細血管の境界にくっつき、注射の流れを遮断します。さらに、細胞は、注入量を最小限に抑え、それらを大量に移植するために、毛細血管内に十分に濃縮される必要がある。より希釈された細胞を大量に注...

細胞の運動性は、極性軸の確立と力を生み出す細胞骨格の再配列を必要とする常同型のプロセスです。アクチン重合とそのミオシンとの会合は、細胞の動きに必要な突出力と収縮力の主な寄与因子として認識されています1。微小管は、遊走中の細胞分極と方向性持続性の主なアクターであると考えられています2。近年、MTは、3D3における細胞浸潤中の機械圧縮力をサポートするために突起を作成および安定化することも示されています。最近では、MTは局所接着時のメカノトランスダクションと機械感受性移動に直接関与しています4。MTプラス末端ダイナミクスを特徴付ける動的不安定性は、重合(増殖)と解重合(収縮)の繰り返し相から成り立っており、これらは多数の微小管結合タンパク質と、RHO-GTPase5,6,7によって支配されるような細胞内シグナル伝達カスケードによって制御されています。細胞の移動と浸潤におけるMTネットワークの役割により、MTダイナミクスの研究は、免疫細胞ホーミング、創傷治癒、および癌浸潤のメカニズムをよりよく理解するための重要な要素になりました。
癌細胞が原発腫瘍コアから脱出し、組織内に広がり、二次腫瘍を生成する能力は、50年前に宣言された癌との戦いにおける世界的な成功を防ぐための重要なステップです8,9。最大のハードルの1つは、癌細胞がどのように活発に組織に侵入するかを理解することでした。主要な浸潤メカニズムは、非腫瘍性細胞の移動を支配するものと同じ原理に依存しています10。しかし、がん細胞の遊走特異性が浮上しており11、このタイプの遊走のより良い特徴付けの必要性を引き起こしています。具体的には、腫瘍微小環境ががんの進行のキープレーヤーとして現れるため12、がん細胞の拡散のメカニズムを解明するには、関連する生理学的状況でがん細胞の浸潤を観察および分析することが不可欠です。
MTは、増殖と浸潤の両方を維持するために、癌の進行の中心です。MT動態をその場で正確に分析することで、両方のプロセスでMT変化因子(MTA)を特定することができます。MTのダイナミクスは、環境の変化によって大きく変化します。in vitroでは、ノコダゾールなどのMT不安定化剤による処理は、細胞が3Dでゲルに埋め込まれている場合の細胞突出の形成を防ぎますが、2D細胞の移動にはほとんど影響を与えません13,14。技術的には困難ですが、生体内イメージングの進歩により、がん細胞浸潤中のMT動態のin vivo解析が可能になります。例えば、マウスの皮下異種移植線維肉腫細胞におけるMTの観察は、腫瘍関連マクロファージが腫瘍細胞のMT動態に影響を与えることを明らかにした15。しかし、これらのマウスモデルは広範な外科的処置を必要とし、高浸潤性脳腫瘍であるGBMなどのアクセスしにくい癌には満足のいくものではありません。
15か月の平均生存期間16という悲惨な結果にもかかわらず、脳実質内でのGBMの播種様式や、脳組織へのGBM細胞の浸潤を維持する重要な分子要素についてはほとんど知られていません。マウス同所性異種移植片(PDX)モデルの改善と頭蓋窓の確立は、GBM細胞浸潤研究の新たな展望を提供しました17,18。しかし、イメージング品質が最適ではないため、このモデルは表在性異種移植片の縦断的イメージングをほとんど可能にし、これまでのところ細胞骨格タンパク質の細胞内イメージングの研究に成功していません。さらに、げっ歯類の使用を減らし、低等脊椎動物に置き換えるための「3R」差し止め命令を受けて、代替モデルが確立されました。
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)幼虫で観察された原始免疫を利用して、魚類脳におけるGBM細胞の同所性注射が開発された19,20,21。発達中の中脳における脳室近傍への注射は、ヒトGBM病態生理学21の大部分を要約し、ヒトにおけるのと同じ好ましいGBM浸潤の好ましいパターンが観察される22。魚の幼虫の透明性のおかげで、このモデルは、ほとんどのGBMが発生すると考えられている脳室周囲領域から脳に侵入するGBM細胞の視覚化を可能にします23。
MTはin vitroでのGBM細胞浸潤に不可欠であるため24,25、MTダイナミクスのより良い特性評価と細胞浸潤中の重要な調節因子の同定が必要です。しかし、今日まで、ゼブラフィッシュ同所性モデルで生成されたデータには、侵入過程におけるMT動態の細胞内解析は含まれていない。この論文は、in vivoでのMTダイナミクスを研究し、脳腫瘍浸潤中のその役割を決定するためのプロトコルを提供します。安定した微小管標識に続いて、GBM細胞をゼブラフィッシュ幼虫の脳に3 dpfでマイクロインジェクションし、脳組織での進行中に高い時空間分解能でリアルタイムでイメージングします。蛍光MTのライブイメージングにより、MTプラスエンドダイナミクスの定性的および定量的分析が可能になります。さらに、このモデルにより、MTAがMTダイナミクスおよびGBM細胞の侵襲特性に及ぼす影響をリアルタイムで評価することができます。この比較的非侵襲的なプロトコルは、一度に処理される多数の幼虫と(魚水中での)薬物適用の容易さを組み合わせることで、このモデルを前臨床試験の資産にします。

<table><tbody><tr><td>膠芽腫細胞培養</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎児の子牛血清</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF00-01</td><td>試薬</td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>試薬</td></tr><tr><td>Modified Eagle's medium</td><td>Eurobio</td><td>CM1MEM18-01</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ペニシリン&ndash;ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>試薬</td></tr><tr><td>U-87 MG</td><td>ECACC</td><td>89081402-1VL</td><td>細胞</td></tr><tr><td>レニチウイルス産生</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD バイオサイエンス</td><td></td><td>機器</td></tr><tr><td>BD FACSDiva ソフトウェア v8.0</td><td>BD バイオサイエンス</td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>HEK-293T</td><td>メルク</td><td>12022001</td><td>Cells</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12259</td><td>試薬</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td>試薬</td></tr><tr><td>超遠心分離機 Optima XPN-80</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Cell Passaging and Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Hoechst 34580</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63493</td><td>化学</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ゼブラフィッシュ 畜産</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光実体顕微鏡 LEICA M165FC</td><td>LEICA</td><td>https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/</td> <td>機器</td></tr><tr><td>メチレンブルーハイドレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4159</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>N-フェニルチオ尿素 (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>トランスファー ピペット 細かいチップ</td><td>Samco Scientific</td><td>232</td><td>機器</td></tr><tr><td>トランスファーピペット 大型バルブ3mL</td><td>Samco Scientific</td><td>225</td><td>機器</td></tr><tr><td>トリカイン (エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: A5040</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Volvic Source Water</td><td>DUTSCHER DOMINIQUE SAS</td><td></td> 999556 <td>Reagent</td></tr><tr><td>Xenotransplantation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>TPP</td><td>92024</td><td>機器</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー(1.0 ODx0.58IDx150L mm)</td><td>ハーバード大学装置</td><td>(#30-0017 GC100-15</td><td>機器</td></tr><tr><td>CellTramオイルバリオマイクロインジェクター</td><td>エッペンドルフ</td><td>5176000.025</td><td>機器</td></tr><tr><td>マイクロローディングピペットチップ(マイクロローダー) 20&micro;L</td><td>エッペンドルフ</td><td>&nbsp;5242956003</td><td>機器</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>成重</td><td>https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html</td><td>機器</td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>シグマ</td><td>M8410-100ml</td><td>機器</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>KL2500 LCD</td><td>機器</td></tr><tr><td>ユニバーサルキャピラリーホルダー</td><td>エッペンドルフ</td><td>5176190002</td><td>機器</td></tr><tr><td>縦型ピペットプーラー</td><td>KOPF (Roucaire)</td><td>Model 720</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Intravital Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5cm ガラス底ビデオイメージングディッシュ</td><td>MatTek Life Sciences, MA, USA</td><td>P35G-1,5-14-C</td><td>機器</td></tr><tr><td>取得ソフトウェア: NIS-Elements-AR version 5.21</td><td>Nikon</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Heat-Block</td><td>テクネ</td><td>DRI-BLOCK DB-2D</td><td>機器</td></tr><tr><td>顕微鏡ヘッド ニコン Ti2E</td><td>ニコン</td><td></td><td>機器</td></tr><tr><td>sCMOSカメラ プライム95B</td><td>フォトメトリクス</td><td></td><td>機器</td></tr><tr><td>sCMOSカメラ オルカフラッシュ4</td><td>浜松</td><td></td><td>機器</td></tr><tr><td>超高純度 低融点アガロース</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>横川 CSU-W1 スピニングディスクユニット</td><td>ハマツ</td><td></td><td>インスツルメント</td></tr><tr><td>Drug Treatment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>ノコダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404-2MG</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td><ストロング>画像分析</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イマリス 9.5.1 ソフトウェア</td><td>オックスフォードインスツルメンツ</td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>ImarisFileConverter 9.5.1</td><td>オックスフォード・インストゥルメンツ</td><td></td><td>・ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ脳に侵入する膠芽腫細胞における微小管動態のライブイメージング

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

実際の集団での生存期間の中央値は6〜15か月で、膠芽腫(GBM)は最も壊滅的な悪性脳腫瘍です。治療の失敗は主にGBM細胞の侵襲性によるものであり、これはGBMの運動特性をよりよく理解する必要性を物語っています。GBMの浸潤を支える分子機構を調べるためには、浸潤時のタンパク質動態の詳細な特性評価を可能にする新しい生理学的モデルが必要です。これらの観察結果は、腫瘍浸潤をブロックし、患者の転帰を改善するための新しい標的の発見への道を開くでしょう。この論文は、ゼブラフィッシュ脳内のGBM細胞の同所性異種移植片が、細胞内の生体内ライブイメージングをどのように可能にするかを報告しています。微小管(MT)に着目し、GBM細胞におけるMT標識、受精後3日(dpf)ゼブラフィッシュ幼虫の透明脳へのGBM細胞のマイクロインジェクション、播種異種移植片におけるMTの生体内イメージング、GBM侵入時のMT動態評価のためのMT動態の変化、および取得したデータの解析の手順について説明します。

ここでは、生体内GBM侵潤時にMTが果たす役割を解析するために、レンチウイルス感染によるGBM細胞の安定なMT標識、3 dpfゼブラフィッシュ幼虫におけるGBM細胞の同所性異種移植、MT動態の高解像度生体内イメージング、MTA処理とそのGBM侵潤への影響、MT動態と生体内浸潤の画像解析について説明します(図1)。 MTダイナミクスは、成長および縮小するMTに沿ってキモグラフを構築するか(図3C)、個々のMTエッジを経時的に手動で追跡することによって測定されます(図3D)。幼虫培地に投与される薬物処置の例およびMTネットワーク組織に対するその可逆的効果を図4に示す。低用量のノコダゾール(200nM)による治療は、MTネットワークの進行性の収縮および4時間後の膠芽腫細胞突出の消失をもたらす(図4...

脊椎動物の脳組織に侵入する膠芽腫(GBM)細胞における微小管動態のライブイメージングを可能にする技術を報告する。蛍光タグ付きGBM細胞の透明なゼブラフィッシュ脳への同所性注射と高解像度の生体内イメージングを組み合わせることで、 in situ がん浸潤中の細胞骨格動態の測定が可能になります。

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

この方法は、ゼブラフィッシュの脳腫瘍細胞のアトピー注射と細胞内生体内イメージングを組み合わせることにより、脳腫瘍浸潤中の微小管の役割の調査に専念しています。この技術の主な利点は、微小管細胞骨格が獲得される高い空間時間分解能にあります。in vivo脳腫瘍浸潤モデルとしてはユニークであり、微小管ダイナミクスの詳細な解析を可能にします。in situ脳腫瘍細胞浸潤の細胞内イメージングは、癌浸潤に関与する可能性のある任意の目的タンパク質の分析に使用できます。まず、摂氏37度で培養した膠芽腫細胞をPBSで洗浄します。1ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAを添加し、すべての細胞が完全に剥離するまでセルインキュベーター内で摂氏37度で5〜10分間インキュベートして、細胞を剥離します。50ミリリットルの遠沈管内の5ミリリットルの完全膠芽腫細胞培地に細胞を再懸濁します。45ミリリットルの氷冷PBSを加え、134倍Gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、完全に上下にピペッティングすることにより、1ミリリットルの氷冷PBSで細胞を再懸濁します。さらに49ミリリットルの氷冷PBSを加え、134倍Gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞を200マイクロリットルの氷冷PBSに再懸濁します。移植手順の間、氷上に保管してください。膠芽腫細胞をゼブラフィッシュ幼虫の中脳にマイクロ注入するには、マイクロインジェクションキャストプレートに、トリカイン1リットルあたり160ミリグラムを添加した6ミリリットルのE3培地を充填します。12匹のDEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED幼虫をマイクロインジェクションプレートに移します。幼虫が麻酔をかけられ、触っても完全に反応しなくなったら、横向きの塹壕に合わせ、頭を上げて卵黄嚢をサイズ00の絵筆で塹壕の壁に押し付けます。次に、マイクロローディングチップを使用して5マイクロリットルの膠芽腫細胞をマイクロキャピラリーにロードし、キャピラリーをユニバーサルキャピラリーホルダーに挿入します。麻酔をかけた幼虫を入れたマイクロインジェクションプレートを実体顕微鏡ステージに置きます。マイクロマニピュレーターノブを使用して、マイクロキャピラリーの先端をマイクロ注入プレートの境界に配置します。次にメスでそれを破って、細胞の直径とほぼ同じ大きさの鋭いエントリポイントを作成します。マイクロインジェクターにオイルを静かに流し、針の先端を培地に突っ込んで、細胞が毛細血管から流出していることを確認します。毛細血管の先端に細胞を集中させて、注入される体積あたりの注入細胞数を最大化し、脳組織がPBSで満たされないようにします。オイルが手動でインジェクターに導入されるときに、マイクロキャピラリーから出てくる細胞を注意深く調べます。手動ノブで20〜50セルを供給するために必要な回転数を経験的に定義します。通常、細胞が十分に濃縮されている場合、約10個の細胞を排出するには1回の穏やかな回転で十分です。毛細血管の先端を中大脳静脈のすぐ上の左視蓋に近づけます。皮膚膜が壊れるまで毛細血管を幼虫にそっと押し付けます。視蓋の適切な位置に到達したら、細胞を排出します。毛細血管の先端を注意深く観察して、動物の中に入る細胞の流れを視覚化し、それによって注射が成功するようにします。必要な数の動物に対して手順を繰り返します。実験者の注入速度に応じて、毛細血管内の細胞が急速に凝集するため、10〜20匹の幼虫ごとに針の交換が必要になる場合があります。異種移植が完了したら、マイクロインジェクションプレートから幼虫を取り除き、ミネラル源水PTUとメチレンブルー培地で満たされた24ウェルプレートでそれらを選び出します。1%低融点AH-KROH溶液を調製します。沸騰した1%低融点AH-KROH溶液500マイクロリットルを1.5ミリリットルの遠沈管に移し、ヒートブロック上で摂氏37度で冷却します。トリカイン1リットルあたり160マイクログラムをAH-KROHSに加え、よく混ぜます。1〜4匹の異種移植幼虫を、ミネラル源水PTUとトリカイン1リットルあたり160マイクログラムで補完されたメチレン培地で満たされた3.5センチメートルのペトリ皿に移します。幼虫が麻酔をかけられ、触覚に完全に反応しなくなったら、細い先端トランスファーピペットを使用してAH-KROHSとトリカインを含むチューブに慎重に移します。幼虫をAH-KROHSと穏やかに混ぜます。大きな電球トランスファーピペットを使用して、AH-KROHSに混合された幼虫をガラス底の3.5センチメートルのビデオイメージング皿の中央に置きます実体顕微鏡下で幼虫を背中にすばやく配置します。マイクロローディングチップを使用して余分なAH-KROHSを取り除き、可能な限り薄いAH-KROHS層を維持します。AH-KROHSが固まったら、2.5ミリリットルのイメージング培地を加えます。浸潤した膠芽腫細胞における微小管動態のin vivoライブイメージングでは、AH-KROHS包埋異種異種移植幼虫を含むビデオイメージング皿を、温度を摂氏32度に設定した倒立共焦点顕微鏡の環境チャンバーに入れます。電動XYステージを使用して、10倍の対物レンズを備えたビデオイメージング皿で幼虫を見つけます。エスケープを押して対物レンズの砲塔を下げ、60倍の対物レンズに鉱物油を追加し、エスケープを押して最初の焦点位置に戻ります。561ナノメートルのレーザー光源、20%のレーザー出力、および200ミリ秒の時間曝露に設定された赤色チャネルで浸潤する膠芽腫細胞を観察します。次に、微小管ネットワークが広がり、微小管フィラメントを簡単に区別できる細胞を選択します。Zシリーズの設定を行います。200マイクロメートルの範囲のピエゾステージを使用して、10〜30マイクロメートルの深さのZスタックで十分な微小管ネットワークの上部と下部の位置を選択し、0.3マイクロメートルのZスライスステップで移動する細胞の突起内の微生物ネットワークを視覚化します。タイムラプス取得設定を設定して、取得速度、Zスタック深度、蛍光シグナルの最適なバランスを取り、急速な光退色を回避します。微小管の画像を5〜10秒ごとに数分間取得し、5Dハイパースタックを保存します。微小管のダイナミクスは、成長および収縮する微小管に沿ってカイモグラフを構築し、個々の微小管エッジを経時的に手動で追跡することによって測定されました。幼虫培地に投与される薬物処置および微小管ネットワーク組織に対するその可逆的効果は、200ナノモル用量のノコダゾールで処理することによって評価した。これにより、微小管ネットワークの漸進的な収縮と4時間後に膠芽腫細胞の突出が消失しました。薬物を洗い流すと、膠芽腫細胞が突起を形成する能力が回復した。細胞は、ウォッシュアウトの12時間後に血管系に沿って移動を再開し、200ナノモルのノコダゾール投与量で微小管ネットワークを破壊し、in vivo膠芽腫細胞の浸潤を迅速にブロックするのに十分であることを示しています。世界的な膠芽腫細胞浸潤に関する同じ治療法の3日間の分析により、ノコダゾールは対照と比較して魚の一般的な健康に影響を与えることなく、in vivoで長期の膠芽腫細胞浸潤を停止させることが明らかになりました。受精後3日目の健康な幼虫から始めて、細胞を毛細血管に集中させ、脳に注入される量を最小限に抑え、独特の腫瘍塊を形成し、脳室への注入を避けるようにしてください。

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