Name: ピールブロット法:多層または濃縮された生物学的サンプルから単層を分離するクライオEMサンプル調製法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学ぶピールブロット法による多層バイオサンプルの単層分離技術。フィルターペーパーとアンチキャピラリー鑷子を用いて試料厚さを減らし、濃度を高め、高効率なクライオEMデータ収集を実現する方法です。

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1. ピールブロット法の準備手順
注:準備には、次のアイテムを互いに隣接して配置する必要があります。
<ol><li>20〜25μmの孔径ろ紙を2枚積み重ねます( 材料表を参照)。</li>
	<li>~8 cm x 10 cmの長さのパラフィンフィルムを、紙を上に向けてろ紙の隣に置きます。</li>
	<li>サブミクロンのろ紙を、さらに2枚の#4ろ紙の上に置きます(図1-1)。</li>
	<li>曲がった脚を上に向けてまっすぐな脚を下に向けて、毛細血管防止鉗子を配置します。次に、滑らかな/光沢のある面を上にして600メッシュのグリッドを選択します。きれいなグリッドが他のアイテムと接触しないように、鉗子をペトリ皿または他の隆起した面に置きます。</li>
	<li>パラフィンフィルムから紙を取り除き、側面(~5 mm)を引っ張って小さなリムを作成します。パラフィンフィルムの片方の短辺から~1-2 cm、パラフィンフィルム上に~1 cm離して、4%トレハロース溶液の150 μLを2滴滴ピペットでピペットします。</li>
	<li>別のベンチまたは床に、小さな発泡スチロール容器に液体窒素を注ぎます(材料の表を参照)。 注意: 凍傷を避けるために、手袋とフェイスシールドを使用して適切な取り扱いのためのトレーニングを受けてください。</li>
	<li>小さなクライオEMグリッド容器を液体窒素に入れ、発泡スチロール容器を糸くずの出ないワイプで覆います。</li>
</ol>2.カーボンフィルムをグリッドに配置する
<ol><li>デュモン#5鉗子( 材料の表を参照)を使用して、トレハロース溶液の滴の1つにマイカの片側をわずかに下向き(~20°-40°)で触れてマイカからカーボンフィルムを浮かせ、マイカを下方に動かして水圧をゆっくりとカーボンフィルムから持ち上げます。カーボン膜が液滴の表面に浮いたら、マイカを放出します。</li>
	<li>カーボン膜を目視検査して、破壊の形で損傷のあるカーボンを使用しないようにします。</li>
	<li>毛細管防止鉗子によって角度(~20°-30°)で保持されているグリッドを、カーボンフィルムに隣接し、次にカーボンフィルムの下の中央にあるトレハロースドロップに挿入します。カーボン膜を拾います(図1-2)。</li>
	<li>グリッドを同じ方向に保ち、ドロップの表面張力を壊さずにトレハロースの2番目のドロップの表面にゆっくりと下げて、グリッドの縁を粗い側に巻き付けた可能性のある不要なカーボンフィルムを取り除きます。</li>
</ol>3. 多層2次元結晶の単層分離
<ol><li>毛細管防止鉗子を回転させ( 材料の表を参照)、グリッドのカーボン側を下に向けてペトリ皿に置きます(図1-3)。</li>
	<li>1.3 μLのサンプルをグリッド上部のわずかなトレハロースメニスカスにピペットで入れます。溶液を~8〜10回ピペットでピペットで、トレハロースとサンプルをグリッドの両側に混合して分配します。</li>
	<li>溶液を1分間インキュベートしながら、1滴以上のトレハロース溶液をパラフィンフィルム上にピペットで移します。</li>
	<li>グリッドを回転させて、カーボンフィルムを上に向けて元の位置に戻します。</li>
	<li>毛細管防止鉗子を使用して、グリッドをサブミクロンのろ紙に押し付けます(図1-4)。溶液がろ紙に吸収され、炭素膜が平らになったら、3秒間待ってからグリッドを持ち上げ、1.7 μLのトレハロース溶液滴上に垂直に移動します(図1-5)。 注:高度に積み重ねられたサンプルに対してこの手順を複数回繰り返すか、次のステップでグリッドをガラス化の準備をします。</li>
	<li>2 枚のろ紙のグリッドを拭き取り、グリッドをろ紙から持ち上げます(図 1-6)。約13秒後、湿度とサンプルバッファーに応じて、グリッドを小さな発泡スチロール容器の液体窒素に突っ込み、グリッドをクライオEMグリッドコンテナに入れるか、クライオEMスクリーニングまたはデータ収集のために直接転送します。 注意: プロトコルを迅速に最適化するには、液体窒素に突っ込むのではなく、このステップでピールブロットグリッドを負に染色します。3 μLの1%酢酸ウラニルをグリッドに適用してサンプルを陰性染色し、グリッドを30秒間インキュベートし、20〜25 μmの孔径ろ紙の破れた部分で拭き取ります。トレハロース、タンニン、またはグルコースでガラス化された2D結晶のグリッドは、トレハロース、タンニン、およびグルコースが手急落に使用される速度で結晶氷の形成を妨げるため、ガラス化のために定期的に手で急落されます2。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

著者は、競合する金銭的利益やその他の利益相反を持っていません。

ピールブロットは、クライオ電子顕微鏡データ収集と画像処理のための多層2D結晶および類似サンプルのスタッキングと厚さを克服するための強力な方法です。ピールブロットの使用に関する決定は、サンプルの生物学的パラメータに基づいて行われ、3DクライオEMモデルが利用可能になったら評価も必要になります。接触の生物学的重要性と接触領域の潜在的な柔軟性は、この評価で特に重要になります。
ピールブロットの数は、標準的なネガティブステイングリッド調製後の観察によって最初に確立され、過剰な層または厚さには、標準的なクライオEMグリッド調製に代わる戦略が必要になります。レジスターに積層された薄い多層結晶は、microED3に直接使用してもよいし、より厚い結晶4の場合はFIBミル化してもよい。ピールブロットは、層がレジスター5にある場合、層を個別にまたは一緒に処理できるため、通常、2層構造の2D結晶には必要ありません。膜タンパク質の2D結晶の両側を...

ピールブロット法は、膜タンパク質の積層2次元結晶を単層に分離し、クライオEM 2Dおよび3Dデータ収集に適した薄いサンプルを取得し、画像処理を容易にするために開発されました1。このプロトコルは、他のタイプの多層サンプルにも同様に適しており、Zの厚さを増やすことなく、グリッド上のいずれかのサンプルタイプの高濃度を達成するのにも適しています。
サンプル層を1層に減らすことは、毛細管圧とせん断力の組み合わせを、バックインジェクション法2に実質的に拡張して変更するプロトコルに適用することによって達成されます。最初のブロッティングステップでは、バックインジェクション法の20〜25μmのろ紙の孔径ではなく、サブミクロンでのブロッティング中に、多層サンプルの両側にあるカーボンフィルムとグリッドバーにしっかりと挟まれ、接着されます。個々の層の分離または剥離は、グリッドがトレハロースドロップに垂直に押し付けられ、炭素膜がグリッドバーから強制的に離れると、挟まれた層を強制的に分離したときに発生します(図1)。グリッドバーとの元の接触点から離れたカーボンフィルムの再配置は、グリッドがサブミクロン濾紙上で再び吸い取られる次のステップで発生します。これらのステップの反復回数は、特定のサンプルに対して最適化できます。さらに、このプロトコルは、Zでの凝集を回避しながらサンプル濃度を高めるために使用できます。 グリッドバーと炭素膜への付着、および強制的な分離に依存するため、このアプローチは、特定の繊細で不安定なタンパク質やタンパク質複合体などの非常に壊れやすい分子には適さない場合があります。
ピールブロット技術は、特殊な機器や高価な消耗品を必要としません。ただし、特定のサンプルに適用するには、生物学的パラメータを慎重に検討する必要があります。2D結晶では平坦性を確保するために炭素膜が必要であるため、決定は簡単ですが、ピールブロット法 による 操作は、サンプルの生物学的完全性または結晶秩序に影響を与える可能性があります。単一粒子に対するピールブロット技術の適合性は、炭素膜を必要とし、操作に対して安定なものに限定され、試験され得る。層間に重要な生物学的相互作用を有する標本は、そのような相互作用の破壊のために、ピールブロット技術の助けを借りての特性評価に適さない可能性があります。
ピールブロット法(「ピールブロット」)は、室温のTEMによる陰性染色または未染色サンプルでの試験およびスクリーニングによって最も迅速に最適化されます。ピールブロットの反復の最適な回数が特定されたら、ガラス化前の厚さを制御する時間を決定できます。

<table><tbody><tr><td>600メッシュグリッド</td><td>SPI</td><td>2060-C-XA</td><td></td></tr><tr><td>アンチキャピラリー鉗子</td><td>テッド・ペラ</td><td>510-5</td><td></td></tr><tr><td>カーボン・トゥ・コーティング・マイカ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クライオ・EM</td><td></td><td></td><td>クライオ・エム・グリッドは、120kVまたは200kVでスクリーニングすることができます。高分解能データは300kVで収集されます。</td></tr><tr><td>Dumpont #5 鉗子</td><td>Ted Pella</td><td>5622</td><td></td></tr><tr><td>クライオ電子顕微鏡保存用グリッドボックス</td><td>Ted Pella</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイカ</td><td>Ted Pella</td><td>56</td><td>マイカはカーボンコーティングされており、TEM グリッドよりもわずかに大きい正方形にカットされています。&nbsp;カーボンの厚さは、薄いカーボンが複数のピールブロットで簡単に壊れるのを避けるために最適化が必要な場合があります。</td></tr><tr><td>ネガティブステイン</td><td></td><td></td><td>1-2%酢酸ウラニルは、多くのサンプルに適しています。リンタングステン酸などの他の染色物を代用することができる。</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン容器</td><td></td><td></td><td>ピールブロットグリッドのガラス化に使用されます。ポリスチレン製の輸送用コンテナは、この目的のためにリサイクルし、アルミホイルで裏打ちすることができます。</td></tr><tr><td>サブミクロンフィルターペーパー</td><td>ミリポアシグマ</td><td>DAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td>加速電圧80-120kVで動作するTEMは、ネガティブステンデッドグリッドのスクリーニングに適しています。</td></tr><tr><td>トレハロース</td><td></td><td></td><td>4%トレハロース溶液を調製します。</td></tr><tr><td>Whatman #4 濾紙</td><td>MilliporeSigma</td><td>WHA1004150</td><td>これは 20-25 &mu;m孔径の濾紙をプロトコールで使用します。</td></tr></tbody></table>

ピールブロット法:多層または濃縮された生物学的サンプルから単層を分離するクライオemサンプル調製法

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

ピールブロットクライオEMグリッド調製技術は、多層サンプルの層の削減を達成することを目的として、大幅に変更されたバックインジェクション法です。急落凍結の前にこのように層を除去することで、クライオEMデータ収集に適したレベルまでサンプルの厚さを薄くし、サンプルの平坦性を改善し、画像処理を容易にすることができます。ピールブロット法により、多層膜を単層に、層状2D結晶を個々の結晶に分離し、可溶性タンパク質の積層シート状構造を同様に単層に分離することができます。これらのタイプのサンプルの厚さが高いと、特にデータ収集のために顕微鏡ステージを傾ける必要がある場合、クライオEMデータ収集およびクライオEM画像処理に克服できない問題が発生することがよくあります。さらに、グリッド調製前のサンプル濃度を高め、ピールブロット技術で単層サンプルの密な分布をもたらすように調整できるため、これらのサンプルのいずれかの高濃度のグリッドを調製して効率的なデータ収集を行うことができます。

ピールブロット実験が成功すると、多くの場合、高濃度のサンプルの単層が得られます。ほとんどのグリッド正方形の一部の領域には、特にピールブロットステップの反復回数が少ない場合、依然として複数の層が含まれることが予想されます。ただし、グリッドの正方形の大部分は、ヒトロイコトリエンC4シンターゼ(図2)とリポソーム(ステップ3.2、 図3で追加)の2D結晶で観察されたように、単層の広範な領域を含みます。追加のピールブロットステップは、層に望ましい減少を示さないサンプルについてテストする必要がある場合があります。
ピールブロット実験の成功を示す最も重要な指標は、高解像度のクライオEMデータ収集と画像処理の後に観察されたデータ品質と生物学的完全性です。データの解釈には、レイヤー間の接触領域への潜在的な損傷または歪みを慎重に考慮する必要があります。
剥離ブロッティングが発生したEMグリッドの領域は、通...

ピールブロット法は、多層および濃縮された生物学的サンプルを単層に分離して、厚さを減らし、サンプル濃度を高め、画像処理を容易にするクライオEMグリッド調製法です。

ピールブロット法:多層または濃縮された生物学的サンプルから単層を分離するクライオEMサンプル調製法

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

ピールブロット法により、多層および濃縮された生物学的クライオEMサンプルを単層に分離して、厚さを減らし、濃度を高め、画像処理を容易にすることができます。グリッド調製前にサンプル濃度を上げることができ、ピールブロットを調整して単層標本の密な分布を実現し、非常に効率的なデータ収集を行うことができます。まず、20〜25マイクロメートルの孔径のろ紙を2枚積み重ね、紙を上に向けて長いパラフィンフィルムを隣に置きます。サブミクロンのろ紙を、さらに2枚のろ紙の上に置きます。曲がった脚を上に向けてまっすぐな脚を下に向けて毛細管防止鉗子を配置し、滑らかな面または光沢のある面を上にして600メッシュグリッドを選択します。きれいなグリッドが他のアイテムと接触しないように、鉗子をペトリ皿または他の隆起した面に置きます。パラフィンフィルムから紙を取り除き、側面を引っ張って小さな縁を作ります。ピペット2個150マイクロリットルをパラフィンフィルムの片方の短辺から約1〜2センチメートルで4%トレハロース溶液に滴下する。2滴は約1センチ離れているはずです。次に、別のベンチまたは床に、液体窒素を小さな発泡スチロール容器に注ぎ、小さなクライオEMグリッド容器を液体窒素に入れます。発泡スチロール容器を糸くずの出ないワイプで覆います。雲母から炭素膜を浮かせるには、デュモン5鉗子を使用し、トレハロース溶液の滴の1つに雲母の片側をわずかに下向きに接触させます。雲母を下に動かして、水圧がカーボンフィルムをゆっくりと持ち上げるようにします。カーボン膜が液滴の表面に浮いたら、マイカを放出します。カーボン膜を目視検査して、破壊の形で損傷のあるカーボンを使用しないようにします。毛細管防止鉗子によって20〜30度の角度で保持されているグリッドを隣接する位置のトレハロースドロップに挿入し、次にグリッドをカーボンフィルムの下に中央に配置します。カーボンフィルムを手に取り、グリッドを同じ方向に保ち、ドロップの表面張力を損なうことなく、グリッドをトレハロースの2番目のドロップの表面にゆっくりと下げます。これにより、グリッドの縁を粗い側に巻き付けた可能性のある不要なカーボンフィルムが除去されます。毛細管防止鉗子を回転させ、グリッドのカーボン側を下に向けてペトリ皿に置きます。1.3マイクロリットルのサンプルをグリッド上部のわずかなトレハロースメニスカスにピペットで入れます。次に、溶液を約8〜10回ピペットでピペットして、トレハロースとサンプルをグリッドの両側に混合して分配します。1つ以上の1.7マイクロリットルのトレハロース溶液をパラフィンフィルム上にピペットで送り、サンプルのトレハロース溶液をグリッド上で1分間インキュベートします。カーボンフィルムを上に向けてグリッドを元の位置に回転させ、毛細管防止鉗子を使用してグリッドをサブミクロン濾紙に押し付けます。溶液がろ紙に吸収され、炭素膜が平らになったら、3秒間待ってからグリッドを持ち上げ、1.7マイクロリットルのトレハロース溶液の上に垂直に移動します。これらの手順は、サンプルに応じて、1〜3回以上繰り返すことができます。2枚のろ紙でグリッドを拭き取り、ろ紙からグリッドを持ち上げます。約13秒後、湿度とサンプルバッファーに応じて、グリッドを小さな発泡スチロール容器の液体窒素に突っ込み、クライオEMグリッドコンテナに入れるか、クライオEMスクリーニングまたはデータ収集のために直接転送します。ピールブロット法に供したヒトロイコトリエンC4合成酵素の2D結晶サンプルをここに示します。矢印の左側の領域は、剥離ブロットされてからシフトした炭素膜とグリッドバーとの接触領域で、単層の2D結晶に大きく縮小されました。矢印の右側の領域は、ピールブロットの影響を受けませんでした。画像の下半分は、ピールブロットの適用から生じる大きな、ほとんどが単層のリン脂質二重層を有する領域を表しています。上半分はグリッドバーと炭素膜の間の接触ゾーンになかったため、2つのリン脂質二重層を有する完全なリポソームが含まれていた。400メッシュグリッドのグリッド四角形は、グリッドバーのフットプリントと結果として生じるピールブロット領域、およびグリッドバーと接触しなかった領域、またはピールブロット反復回数が少ない領域を示します。これらの画像は、非常に薄いカーボン膜を用いたサブミクロン濾紙へのバックインジェクションによって調製されたEMグリッドのブロッティングを示した。画像は、膜との最初の接触時、接触後1, 000ミリ秒、および接触後2, 000ミリ秒の単一フレームです。矢印は、毛細管圧が炭素膜を破裂させたグリッドの正方形を示しています。炭素膜の割れ目を避け、サブミクロンのろ紙と1.7マイクロリットルのトレハロース滴を組み合わせて吸引し、層を分離することが重要なステップです。ピールブロットサンプルは、高解像度のクライオEMデータ収集に使用され、その後、構造決定のための画像処理が行われます。ピールブロットにより、以前はクライオEMには厚すぎた単層タンパク質2D結晶の構造測定が可能になります。さらに、さまざまなサンプルを炭素膜上の単層に濃縮することができます。

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生物化学

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