Name: 胎児組織由来エンテロイドの上皮透過性の試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学ぶ 胎児組織由来エンテロイドを用いた上皮透過性の測定法。免疫蛍光染色とDextran-FITCマイクロインジェクションにより、腸管バリア機能や漏れやすい腸のメカニズムを解析する体外モデルを構築します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

胎児組織を共有してくれたイアン・グラス博士とワシントン大学の先天性欠損症研究所の職員に感謝します。また、ミシガン大学のトランスレーショナルティッシュモデリングラボのマイケルデイム博士とジェイソンスペンス博士には、プロセス全体を通しての無限のサポートと指導に感謝します。

<ol><li>Humberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preterm+birth+and+sustained+inflammation%3A+Consequences+for+the+neonate%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Preterm birth and sustained inflammation: Consequences for the neonate.</a> Seminars in Immunopathology. 42 (4), 451-468 (2020).</li>
<li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+Model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human organoids: Model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
<li>Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canonical+Wnt+signals+are+essential+for+homeostasis+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium.</a> Genes & Development. 17 (14), 1709-1713 (2003).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52483(2015).</li>
<li>Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+epithelial+enteroid+model+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59194(2019).</li>
<li>Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+intestinal+enteroid%2Forganoid+lines+from+preterm+infant+and+adult+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).</li>
<li>Finkbeiner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+analysis+reveals+hallmarks+of+human+intestine+development+and+maturation+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide analysis reveals hallmarks of human intestine development and maturation in vitro and in vivo.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1140-1155 (2015).</li>
<li>Senger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal-derived+enterospheres+provide+insights+on+intestinal+development+and+a+novel+model+to+study+necrotizing+enterocolitis+%28NEC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC).</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).</li>
<li>Alganabi, M., Lee, C., Bindi, E., Li, B., Pierro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+understanding+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Research%22%5BJournal%5D)">Recent advances in understanding necrotizing enterocolitis.</a> F1000 Research. 8, (2019).</li>
<li>Dame, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colonic+crypts+in+culture%3A+Segregation+of+immunochemical+markers+in+normal+versus+adenoma-derived%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human colonic crypts in culture: Segregation of immunochemical markers in normal versus adenoma-derived.</a> Laboratory Investigation. 94 (2), 222-234 (2014).</li>
<li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonization+stimulates+a+complex+physiological+response+in+the+immature+human+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium.</a> eLife. 6, 29132(2017).</li>
<li>Tsai, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+cryogenic+preservation+of+human+biopsy+specimens+and+subsequent+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).</li>
<li>Su, K., Asbrock, N., Chu, V., Hoffmann, S., Hewitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Differentiation+of+Human+iPS+Cells+Into+Colon+Organoids+in+Serum-Free+Cell+Culture+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Technology+Networks%22%5BJournal%5D)">In Vitro Differentiation of Human iPS Cells Into Colon Organoids in Serum-Free Cell Culture Conditions.</a> Technology Networks. , https://www.technologynetworks.com/cell-science/white-papers/in-vitro-differentiation-of-human-ips-cells-into-colon-organoids-in-serum-free-cell-culture-328450 (2019).</li>
<li>Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+epithelial+barrier+permeability+in+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56960(2017).</li>
<li>Schoultz, I., Keita, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intestinal+Barrier+and+Current+Techniques+for+the+Assessment+of+Gut+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The Intestinal Barrier and Current Techniques for the Assessment of Gut Permeability.</a> Cells. 9 (8), 1909(2020).</li>
<li>Kumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lineage-specific+transcription+factor+CDX2+navigates+dynamic+chromatin+to+control+distinct+stages+of+intestine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development.</a> Development. 146 (5), (2019).</li>
<li>Walker, R. W., Clemente, J. C., Peter, I., Loos, R. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prenatal+gut+microbiome%3A+Are+we+colonized+with+bacteria+in+utero%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Obesity%22%5BJournal%5D)">The prenatal gut microbiome: Are we colonized with bacteria in utero.</a> Pediatric Obesity. 12, Suppl 1 3-17 (2017).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li>
<li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+gradient+and+instability+of+Wnt+induce+heterogeneous+growth+and+differentiation+of+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids.</a> iScience. 23 (8), 101372(2020).</li>
<li>Lueschow, S. R., McElroy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Paneth+cell%3A+The+curator+and+defender+of+the+immature+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Paneth cell: The curator and defender of the immature small intestine.</a> Frontiers in Immunology. 11, 587(2020).</li>
<li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens%2C+commensals%2C+and+host+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59357(2019).</li>
<li>Dheer, R., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-derived+models%3A+Tools+for+studying+role+of+microbiota+in+intestinal+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-derived models: Tools for studying role of microbiota in intestinal homeostasis and disease.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 37 (1), 15-22 (2021).</li>
</ol>

すべての著者は、開示する利益相反がないことを宣言します。

このプロトコルでは、胎児の腸組織からのエンテロイドの樹立、および免疫蛍光染色および上皮透過性試験によるモデル特性評価について詳しく説明します。エンテロイドの透過性を、マイクロインジェクション技術および培地中の漏出デキストラン-FITC濃度の連続経時変化測定を用いて試験した。このプロトコルの新規性は、培養培地7における基底外側曝露と比較して、ヒト腸生理学により近い頂端曝露である。以前の研究では、Hillらは、連続画像化および経時的な蛍光強度の計算を利用した16。Aresらは、上皮モデルの基底外側膜をLPSに曝露し、細胞遺伝子発現パターン7を比較しました。比較として、試験した試薬の頂端曝露を使用し、培地中の漏れたデキストランの連続濃度を測定することにより、総透過性の潜在的な変化を調べます。また、培地中の上皮細胞が産生するサイトカインや、細胞のmRNAを収集することで遺伝子発現を連続的に比較することができます。LPSは、透過性および炎症を誘発する能力があるため、動物およびin vitroモデルにおける腸管損傷の研究に一般的に使用されています7,17。このモデルでLPSを試験したところ、上皮透過性は曝露濃度によって区別された。このプロトコルは、異なるマイクロインジェクション材料および結果測定を使用して他の疾患病理を研究するために拡張することができる。
このプロトコルの重要なステップには、胎児の腸組織からのエンテロイドの確立、腸管の特性評価、およびマイクロインジェクション技術が含まれます。この研究の完全性は、正確な細胞サンプリングに依存します。解剖学的ランドマークと血管を使用することは、小腸細胞の選択を確実にするのに役立ちます。胎児の腸幹細胞の強力な増殖と分化のために、他の上皮細胞から幹細胞を分離するための広範な手順は必要ありません。エンテロイドが樹立されたら、タンパク質や細胞マーカーを染色してモデルの特徴を確認することが重要です。このプロトコールでは、エンテロイドを、ビリンおよびCDX2を用いて腸細胞、リゾチームを用いてPaneth細胞、およびムチンを用いて杯細胞について染色し、小腸上皮内に見出される全ての細胞18、19、20について染色した。1つの細胞型を示す従来の単一細胞株とは対照的に、エンテロイドは腸前駆幹細胞からすべての細胞型を確立します8。このプロトコルの染色部分は、目的の特定の細胞マーカーに対して変更することができる。このプロトコルの信頼性にとって重要なのは、マイクロインジェクション技術です。マイクロピペットチップの一貫性は、デキストランFITC溶液を使用してポンプあたりの容量を測定し、顕微鏡下でチップの直径を視覚化することで確認できます。汚染のリスクがあるため、同じマイクロピペットを複数の曝露に使用することはできません。さらに、エンテロイドの形状と成長は、それらの成長培地の内容によって影響を受ける可能性があります。カリフラワー型エンテロイドよりも球形のエンテロイドがマイクロインジェクションのより良いモデルを提供することがわかりました。球状形状は、媒体21におけるより大きなWnt係数によって誘導され得る。
このプロトコルは、特に時間に敏感な測定において、変動を減らすためのマイクロインジェクションにおける実行者のスキルに大きく依存します。同じ経験豊富なパフォーマーを一貫した技術で使用し、同じ細胞起源を使用して遺伝的変異を回避し、同じ継代でテストして成熟度バイアスを除去し、同様の細胞分化のために同じタイプの培地で細胞を増殖させることで、変動を最小限に抑えることができます。増殖培地の成分は、インビボ環境中ではなくインビトロで幹細胞の様々な分化を誘導し得る。例えば、インビボでは、リゾチームは、Paneth細胞が形成されて機能的になる妊娠発達の22〜24週まで発現しない22。しかし、10週目の胎児腸から樹立したエンテロイドからリゾチームを検出することができました。この方法は、マイクロインジェクションに必要な高度な技術的スキルにより、一度にテストされる露光の数を制限することができます。マイクロインジェクション穿刺孔からのデキストラン漏れは、透過性の評価に影響を与える可能性があります。この影響を排除するために、マイクロインジェクションの直後のトリプル洗浄が、手順から残留デキストランを除去するために推奨されます。培地中のデキストラン濃度は、マイクロインジェクション後4〜6時間毎に測定する必要があります。.注射後2〜4時間以内にデキストラン濃度が大幅に上昇した実験は、最終分析から除外する必要があります。.
この方法にはいくつかの利点があります。トランスウェル上のエンテロイド由来の単分子膜と比較して、必要なコストとリソースが少なくて済みます。さらに、生きた細菌やウイルスなどの他の曝露に拡張して、腸内微生物と上皮の間の最初の相互作用を研究することができます。腸管の密閉された内腔は、増殖培地13の汚染なしにマイクロ注入された生細菌の安定した増殖を維持することができる。成長培地やインキュベーション酸素にさらされる単層とは異なり、密閉された内腔は狭く隔離された空間です。密閉された内腔は、増殖培地への連絡を許さず、生細菌の増殖とともに時間の経過とともに低くなる管腔酸素含有量を可能にします13。
胎児の腸組織の使用は、成人の腸幹細胞または動物モデルと比較して早産児の腸上皮をより正確に描写します7。さらに、エンテロイドの極性は、頂端および基底外側の両方の曝露および測定を可能にする23。エンテロイドは、より低い酸素化濃度を有する密閉された内腔を形成し、これは腸24の酸素化濃度をより厳密に模倣する。より技術的に進んだプロトコル16とは対照的に、グロスメディア測定の使用は、この技術のより大きなアクセス可能性を可能にする。実験は、上皮漏出がLPSへの頂端曝露によって誘発される可能性があり、濃度に依存することを示しました。この方法は、デキストランのリーク濃度の変化を調べるため、タイトジャンクションの全体的な機能変化を検出するのに役立ちます。メッセンジャーRNAの収集と露出したエンテロイドのシーケンシング、およびウェスタンブロット分析は、全体的な機能変化の分析を補完することができます。このモデルは、早産環境に非常によく似たシステムで腸上皮の完全性を研究しているため、早産の腸の損傷やその他の病気の病状をよりよく理解するために使用できます。

早産児は頻繁かつ長期にわたる炎症にさらされるため、腸の損傷のリスクが高まり、長期的な障害や死亡につながります1。この分野の研究は、脆弱な早産児で実験を行う能力が限られていることに挑戦しています。さらに、適切なモデルの欠如は、早期腸環境の包括的な研究を妨げています2。既存のin vitroおよびin vivoモデルは、早期のヒト腸内環境を包括的に表現することができませんでした。具体的には、単一の上皮胎児細胞株はタイトジャンクションを形成しない可能性があり、動物モデルはヒト早産児とは異なる炎症性および免疫学的応答を示します。腸管陰窩幹細胞の増殖と分化における主要な経路としてのWntシグナル伝達と新規Lgr5+組織幹細胞の発見により、エンテロイドやコロノイドなどの腸組織由来オルガノイドがin vitroモデルとして確立されました3,4,5。この技術を用いて、腸の全組織または生検から開発された3次元(3D)腸内モデルを作成して利用し、腸内環境に対する上皮応答を研究することができます6,7。
培養で増殖する典型的な腸細胞株とは対照的に、エンテロイドはタイトジャンクションタンパク質8によって接続された内腔を有する極性を示す。これにより、成長培地中の基底外側境界への曝露、ならびに頂端境界を評価するための管腔マイクロインジェクションが可能になります。さらに、エンテロイドは、ヒト上皮と同様の遺伝的、生理学的、および免疫学的特徴を示す9,10。胎児組織由来エンテロイドは、上皮機能に対する未熟児の役割の検査を可能にする。エンテロイドのユニークな特徴は、早産の腸内環境により近い可能性があります9。組織由来エンテロイドは、単層形態として、または固化した基底膜タンパク質混合物に埋め込まれた3D構造として、タイトジャンクションの完全性を試験するために使用できます。頂端曝露が望まれる場合、後者の形態にはマイクロインジェクション技術が必要である。エンテロイドモデルにおける上皮応答の測定には、RNAシーケンシングによる遺伝子発現、酵素結合イムノアッセイ(ELISA)によるバイオマーカー、または高度なイメージング技術が含まれます。ここで紹介する手法は、蛍光測定で総透過性を測定するための別の実行可能なオプションを提供します。
早産児の腸管損傷には、腸内微生物群集の不均衡を含む多因子性病因があります。エンテロイドは、上皮機能を伴う壊死性腸炎などの早産腸疾患の特定の側面を研究するための優れたモデルを提供することができます11。エンテロイドは、ヒト胎児腸と同様の特徴を示す10。エンテロイドをグラム陰性菌によって産生されるエンドトキシンであるリポ多糖(LPS)に基底外側曝露として培地中に曝露すると、炎症の増加と腸透過性につながる可能性のある遺伝子発現が誘導されます7。この研究は、LPSなどの細菌製品への頂端曝露後の総上皮透過性の変化を評価することを目的としています。この結果は、腸管損傷の病因に関与する微生物と上皮の相互作用に関する手掛かりとなる可能性がある。総透過性をテストするために設計された方法には、マイクロインジェクションのセットアップとスキルが必要です。

<table><tbody><tr><td>アンホテリシン 250 uL/mL</td><td>Gibco</td><td>15-290-026</td><td></td></tr><tr><td>抗 CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL 濃縮マウス、IgG、モノクローナル</td><td>Biogenex</td><td>MU392A-5UC</td><td></td></tr><tr><td>抗クローディン 2 抗体 (ab53032)</td><td>abcam</td><td>ab53032</td><td></td></tr><tr><td>抗クローディン 3 抗体 (ab15102)</td><td>abcam</td><td>ab15102</td><td></td></tr><tr>ウサギ ミリポア シグマ<td>で産生された抗 LYZ 抗体</td><td></td><td>HPA066182-100UL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mucin 2/MUC2 抗体 (F-2): sc-515032</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-515032</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal</td><td>Biogenex</td><td>NUA42-5UC</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates&nbsp;</td><td>USA Scientific Inc</td><td>50-754-1395</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート、CytoOne 6ウェル未処理プレート&nbsp;</td><td>USA Scientific Inc</td><td>50-754-1560</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機と15 mLチューブバケツ</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>05-413-110</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡&nbsp;</td><td>オリンパス FV1200</td><td>N/A</td><td>または類似の顕微鏡</td></tr><tr><td>円錐形遠心分離管、15 ml</td><td>ファルコン</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド用カバーガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-DP</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てメス</td><td>モペック</td><td>22-444-272</td><td></td></tr><tr><td>ドミディノ-2-フェニルインドール (DAPI) 溶液 (1 mg/mL)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>62248</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS, 1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ67802K2</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス(&β;-アミノエチルエーテル)-N,N,N&prime;,N&prime;-四酢酸四ナトリウム塩 (EGTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>E8145-10G</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネートデキストラン (Dextran-FITC) 4 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Fuorescence マイクロプレートリーダー</td><td>Agilent BioTek</td><td>Synergy HTX</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin 50 mg/mL</td><td>Gibco</td><td>15-750-060</td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細管、シングルバレルホウケイ酸、1x0.5mm、6" (引っ張る前に半分にカット)</td><td>A-M Systems</td><td>626500</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (H+L) 高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor Plus 594</td><td>Fisher Scientific</td><td>A32742</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG (H+L) 高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor Plus 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td><td>Stem Cell&nbsp;テクノロジー</td><td>&nbsp;06010</td><td></td></tr><tr><td>リポ多糖類 from&nbsp;大腸菌&nbsp;O111:B4</td><td>ミリポアシグマ</td><td>L4391-1MG</td><td></td></tr><tr><td>マグネティックスタンド</td><td>ワールドプレシジョンインスツルメンツ&nbsp;</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル基底膜マトリックス、LDEVフリー、10 mL&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>354234</td><td>&nbsp;タンパク質濃度 > 9 mg/mL できれば</td></tr><tr><td>マイクロ鉗子</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-820-078</td><td></td></tr><tr><td>マイクロハサミ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>08-953-1B</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ&nbsp;</td><td>M3301</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>SU-P1000</td><td>または類似の機器</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-034486</td><td></td></tr><tr><td>オクルージンポリクローナル抗体</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>&nbsp;71-1500</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド32%水溶液</td><td>ELECTRON&nbsp;MICROSCOPY SCIENCES</td><td>RT 15714</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿、35x10 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿、60x15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-94</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>PicoPump フットスイッチ</td><td>World Precision Instruments</td><td>3260</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ、フィルターなし、1000 uL</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-402-47</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ、フィルターなし、20 uL</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-402-41</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ、フィルターなし、200 uL</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-54</td><td></td></tr><tr><td>空気圧 PicoPump システム</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>または類似のピコポンプシステム</td></tr><tr><td>Primocin 50 mg/mL、10x1 ml バイアル</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>スチールベースプレート</td><td>ワールド精密機器</td><td>5052</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ツァイスステミ 350</td><td></td><td>または類似の顕微鏡</td></tr><tr><td>サーモセーフ ポーラーパック 発泡レンガ</td><td>ソノコ</td><td>03-531-53</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>ミリポアシグマ</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>壁の空気供給</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二塩酸塩</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 ポリクローナル抗体</td><td>Fisher Scientific</td><td>61-7300</td><td></td></tr></tbody></table>

胎児組織由来エンテロイドの上皮透過性の試験

Testing Epithelial Permeability in Fetal Tissue-Derived Enteroids

ヒト胎児組織由来エンテロイドは、早産児の腸管損傷を研究するための有望な in vitro モデルとして浮上しています。エンテロイドは極性を示し、頂端境界を有する内腔、タイトジャンクション、および成長培地に露出した基底外側外層からなる。腸管損傷の結果には、粘膜の炎症と透過性の増加が含まれます。脆弱な早産のヒト被験者における腸透過性の試験は、しばしば実行不可能である。したがって、早産児の腸管損傷を研究するには、 in vitro 胎児組織由来腸モデルが必要です。エンテロイドは、タイトジャンクションタンパク質によって調節される上皮透過性の変化を試験するために使用できます。エンテロイドでは、腸幹細胞はすべての上皮細胞型に分化し、マウス肉腫細胞から分泌される基底膜マトリックス上に立体構造を形成します。本稿では、胎児の腸組織からエンテロイドを樹立し、免疫蛍光イメージングで腸内タイトジャンクションタンパク質を特徴付け、上皮透過性をテストするために使用される方法について説明します。グラム陰性優性菌嚥下障害は腸管損傷の危険因子として知られていることから、グラム陰性菌が産生するエンドトキシンであるリポ多糖(LPS)を用いてエンテロイドの透過性を誘導した。フルオレセイン標識デキストランを腸管腔にマイクロインジェクションし、培地に漏出した連続デキストラン濃度を測定して、傍細胞透過性の変化を定量化しました。実験は、LPSへの頂端曝露が濃度依存的に上皮透過性を誘導することを示した。これらの知見は、グラム陰性優性嚥下障害が早産児の腸管損傷のメカニズムに寄与しているという仮説を支持している。

ミシガン大学トランスレーショナル組織モデリングラボ12の共同研究者から提供された修正プロトコルに従って、提供された回腸胎児組織から腸内細胞株を確立しました。腸内細胞株はマイ コプラズマ 感染陰性でした。エンテロイドは、ビリン、CDX2、リゾチーム、ムチン、クローディン、オクルージン、および小帯-閉塞1に対して陽性に染色され(図5)、小腸上皮起源が確認されました。エンテロイドには、4 kDaのデキストランFITCを5 mg/mLのPBS溶液でマイクロインジェクションしました(図6)。試験ばく露は、0.1 mg/mLおよび0.5 mg/mLの異なる濃度のLPSで、頂端ばく露のためにデキストランFITCと混合した。ポジティブコントロールとして、2 mM EGTAを使用し、デキストランのマイクロインジェクションの4時間後に培地に添加しました。EGTAは、タイトジャンクションの透過性を高めるカルシウムキレート剤です。陰性対照には、PBSのみでデキストランFITCをマイクロインジェクションしました。基底側方ばく露の場合、連続培養培地収集用の交換培地は、同じ濃度のばく露(すなわち、2mM EGTA)を有していた。結果は、陰性対照であるPBSと比較して、EGTA添加後の培地中のデキストラン濃度の明らかな増加を示しています。LPSの頂端ばく露は、濃度依存的にばく露後約8時間からデキストランの透過性を高めました(図7)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64108/64108fig01.jpg"> 図1:マイクロインジェクターのセットアップ。 セットアップには、実体顕微鏡、重いスチールベースプレートの磁気スタンドに取り付けられたマイクロマニピュレーター、三方活栓を備えたシリンジに接続されたマイクロピペットホルダー、および空気圧ポンプが含まれます。壁の空気供給は空気圧を提供し、ポンプによって調整されて一貫したポンプ容量を生成します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64108/64108fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64108/64108fig02.jpg"> 図2:横型マイクロピペットホルダー。 このプラスチックプラットフォームは、先端を切断するためにガラスキャピラリーチューブを引っ張った後にマイクロピペットを保持するように設計されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64108/64108fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64108/64108fig03.jpg"> 図3:マイクロピペットの位置決め。 35°〜45°の角度は、ペトリ皿の中央にあるエンテロイドを注入するのに理想的です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64108/64108fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64108/64108fig04.jpg"> 図4:デキストラン検量線。 曲線は、デキストランの10段階希釈の蛍光吸光度を二重に構築した。線形回帰直線をフィッティングして回帰式を生成しました。エラーバーはSEMです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64108/64108fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64108/64108fig05.jpg"> 図5:エンテロイドの蛍光バイオマーカー。 核染色のDAPIは青色です。以下のバイオマーカーが示されている:(A)ビリン、(B)CDX2、(C)リゾチーム、(D)ムチン、(E)クローディン、(F)閉塞、および(G)帯-閉塞1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64108/64108fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64108/64108fig06.jpg"> 図6:異なる段階のエンテロイド 。 (A)生後7〜10日の腸は小さく、壁が厚い。(B)大きなサイズ、内腔、思考壁を備えたマイクロインジェクションの準備ができているエンテロイド、および(C)マイクロインジェクションの2日後に腸内に配置された蛍光デキストラン-FITC。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64108/64108fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64108/64108fig07.jpg"> 図7:マイクロインジェクション後のデキストランFITCの透過性 。 (A)培地中の測定されたデキストランレベルは、PBSと比較してEGTA添加後に高かった。(B)マイクロインジェクションされた0.5 mg / mL LPSは、マイクロインジェクションされた0.1 mg / mL LPSが注入後8時間で開始したよりも、腸管腔から培地へのデキストランの漏出を大きく誘導しました。*p値&lt;0.05、エラーバーはSEM、n = 3、有意性の計算にはスチューデントのt検定が使用されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64108/64108fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、胎児の腸組織からの3次元腸モデルであるエンテロイドの確立を詳述しています。上皮バイオマーカーの免疫蛍光イメージングをモデルの特性評価に使用しました。細菌性エンドトキシンであるリポ多糖の頂端曝露は、マイクロインジェクション技術を用いて、蛍光デキストランの漏出によって測定される用量依存的に上皮透過性を誘導した。

Human fetal tissue-derived enteroids are emerging as a promising in vitro model to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids exhibit ...

このプロトコルの重要性は、早期上皮のin vitroモデルでエンテロイドの総確率をテストすることです。この技術の主な利点は、腸管腔環境を模倣する密閉された内腔からの透過性を測定することです。このプロトコルは、リーキーガット疾患を誘発または軽減する要因を研究するために使用できます。また、血管漏出を誘発する可能性のある状態を研究するために、内皮系または血管系に適用することもできます。このプロトコルにはある程度の練習が必要です。手順全体をまとめる前に、各セクションを個別に練習することをお勧めします。まず、腸のセグメントを、アムホテラシンを含む氷のように冷たいダルベッコのPBSを入れた60 x15平方ミリメートルのペトリ皿に移し、氷に20分間浸します。はさみ付きのメスを使用して、腸の部分を3〜5ミリメートルの小片に切り、氷上に0.5〜1ミリリットルのオルガノイド増殖培地を含む35 x 15平方ミリメートルのペトリ皿に1〜2個入れます。解剖マイクロハサミと鉗子を使用して腸管を縦方向に切断します。次に、鉗子を使用して筋膜から上皮細胞をこすり落とします。筋膜を取り除き、皿を回転させて細胞の塊を壊します。次に、20マイクロリットルのピペットカットチップを使用して、細胞と培地を5〜10マイクロリットルの増分で基底膜マトリックスミックスに移し、285マイクロリットルの溶液を作ります。200マイクロリットルのカットチップを使用して、氷上の基底膜マトリックスにピペッティングして細胞を混合します。混合後、細胞基底膜マトリックスミックスの50マイクロリットルのストリップを、温かいフォームレンガ上に保持した予熱した6ウェルプレートの1ウェルに入れる。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で10分間インキュベートし、基底膜マトリックスの重合と硬化を可能にします。マトリックスストリップが固まったら、プレートをインキュベーターに戻す前に、2ミリリットルの腸内増殖培地をウェルに追加します。エンテロイドを6ウェルまたは12ウェルプレートのウェルに移した後、隔日で、古い培地を新しい培地と交換する。そして、エンテロイドが繁栄し始めたので、5〜7日ごとに細胞を通過させます。免疫蛍光染色では、ブロッキングバッファー中の一次抗体500マイクロリットルをエンテロイドの各ウェルに加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、抗体溶液を取り出し、エンテロイドをPBSで3回洗浄する。1〜400希釈した二次抗体溶液中でインキュベートした後、DAPI中でインキュベートした後、エンテロイドをPBSで3回洗浄する。エンテロイドの立体構造を保つには、薄いシリコンゴムシートまたはガラスカバースリップの切り欠きを使用して、下部スライドガラスとカバースリップの間に0.5〜1ミリメートルのスペースを作成します。取り付けには、染色したエンテロイドを70%グリセロールで洗浄します。次に、1マイクロリットルの接種ループまたはカットされた200マイクロリットルのチップを使用して、エンテロイドをプレートから持ち上げ、グリセロールとともにガラス顕微鏡スライドにマウントします。透明なフィルムカバーで覆われたペトリ皿を準備し、フィルム上に2〜4滴の1マイクロリットルのデキストランFITCを追加します。マイクロマニピュレーターを使用して、実体顕微鏡下でマイクロピペットチップを液体の内側とフィルムの上に押し込み、シリンジを静かに引いてデキストランFITCをマイクロピペットに引き出します。マイクロピペットに2〜4マイクロリットルのデキストランFITCを充填した後、シリンジを押してピペットチップから空気を取り除きます。また、マイクロピペットの注入された材料カラムを検査してエアポケットがないことを確認し、マイクロピペット内のデキストランFITCの容量を記録します。次に、空気圧ポンプに接続されている空気源をオンにしてから、ポンプをオンにしてポンプの持続時間を10〜15ミリ秒に設定します。次に、シリンジの活栓を回して、ポンプからマイクロピペットまでのラインを開きます。インキュベーターからエンテロイドを取り出し、マイクロ注入後の光への露出を最小限に抑えるために、蓋付きの容器内の温かいフォームレンガの上に皿を置きます。エンテロイドの入ったペトリ皿を実体顕微鏡下に置き、マイクロマニピュレーターノブを動かして、マイクロピペットチップを水平面に対して35〜45度の角度で配置します。1皿あたり3〜5個のエンテロイドを注入することを目標に、球状のエンテロイドを視覚化して識別します。次に、顕微鏡の接眼レンズを通して見て、先端を標的腸筋に進めます。次に、Z軸ノブを正確にゆっくりと動かして進め、マイクロピペットチップで腸管を穿刺します。先端が腸管表面を通過すると、前進は停止し、腸側表面は押し下げられて飛び出します。片足でポンプペダルをタップし、膨張するまで緑がかったデキストラン-FITC溶液で腸管を満たします。ポンプの数を記録して、ポンプ容量とデキストラン濃度を計算します。このプロトコルは、腸上皮に特異的なさまざまなバイオマーカーを免疫蛍光抗体で染色することにより、胎児組織由来のエンテロイドの特性評価を示し、それらの小腸上皮起源を確認しました。さまざまな段階のエンテロイドがここに示されています。生後7〜10日の腸管は小さくて厚いです。一方、マイクロインジェクションの準備ができている腸管は大きく、内腔と薄い壁がありました。マイクロインジェクションの2日後には、まだかなりの量のデキストランFITCが含まれています。マイクロインジェクション後のエンテロイドの透過性は、培地中のデキストラン濃度を測定することにより評価した。タイトジャンクションでの膜透過性を高めることが知られているEGTAをポジティブコントロールとして使用しました。デキストラン測定アッセイはさらに、LPSが透過性の増加を誘導し、LPS濃度が高いほど透過性が高いことを示しています。固定と染色で最も重要なことは、エンテロイドの形状を乱したり、プロセス中に失ったりしないことです。マイクロインジェクションに続いて、サイトカインアッセイのために培地を回収し、RNAシーケンシングのためにエンテロイドを回収することができます。

testing-epithelial-permeability-in-fetal-tissue-derived-enteroids

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

このプロトコルは、腸バリア機能のex...

ex vivoで腸嚢は、胃腸疾患のモデルに粘膜透過性を評価するために

このプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いたヒトの腸オルガノイドのリアルタイム次の薬理学的治療における上皮バリア透過性の測定について説明し、細胞顕微鏡検査をライブします。...

人間の腸 Organoids 上皮関門の透過性のリアルタイム計測

2 つのメソッドは、腸管のバリア機能を決定するここで掲載されています。上皮メーター (ボルト/オーム) は、組織培養の井戸に直接培養上皮細胞の上皮電気抵抗の測定に使用されます。マウスで FITC...

腸管上皮細胞の透磁率を決定する体外と体内アプローチ

生体内顕微鏡を利用して、ここで提示される方法は、生きている動物の腸上皮細胞脱落のリアルタイム視覚化を可能にする。従って、麻酔化マウスの局所染色された腸粘膜(アクリフラビン及びローダミンB-デキストラン)は、共焦点顕微鏡を用いて単細胞分解能まで画像化される。...

腸透過性と上皮細胞流れ性能を評価する生体内顕微鏡ベースのアプローチ

ここでは、腸管バリア機能、透過性、および輸送を研究するためのヒトオルガノイド由来腸上皮単層の調製について述べる。オルガノイドは外部刺激に対する元の上皮組織応答を表すので、これらのモデルは細胞株の拡張性の利点と初代組織の関連性と複雑さを兼ね備えています。...

オルガノイド由来の上皮単分子膜:腸管バリア機能のための臨床的に関連するインビトロモデル

本プロトコルは、腸透過性を決定するために頂端外腸介様モデルにおいてルシファーイエローを利用する方法を概説する。この方法は、壊死性腸炎などの炎症性腸疾患をモデル化するエンテロイドにおける傍細胞透過性を決定するために使用することができる。...

根尖腸管モデルにおけるルシファーイエローを用いた腸透過性の決定

大腸菌は、出生前後に細菌を摂取した新生児に敗血症を引き起こします。大腸菌が腸管から血流に移動する能力に関与するプロセスは、よく理解されていません。このin...

新生児大腸 菌 分離株の腸管トランスサイトーシスの評価

エンテロイドは、組織生理学や病態生理学、医薬品開発、再生医療を研究するための新しいモデルとして浮上しています。ここでは、関連する組織細胞タイプとの共培養を可能にするウシ初代細胞2Dエンテロイド由来培養システムについて説明します。このモデルは、消化器研究のモデリングにトランスレーショナルな利点をもたらします。...

トランスレーショナルバイオメディカル研究への応用を目指したウシ一次エンテロイド由来2次元単層培養系の作製

この研究は、オルガノイドからウシ腸の2D単分子膜を生成するためのプロトコルを提示し、宿主と病原体の相互作用を研究するためのアクセスを改善します。これには、膜の完全性と機能性を評価する方法が含まれており、牛の胃腸生理機能を模倣した in vitro...

小腸および大腸単分子膜界面を用いたウシオルガノイド技術の進歩

自律機能の標準化、包括的で完全に定量的なテストが記載されている。自律神経テストはcardiovagal、アドレナリンや汗腺を含むすべての3つの主要な自律神経のドメインの評価で構成されています。自律神経障害の重症度と分布は複合オートノミック重症度スコアを用いて定量される。...

定量的な自律神経系検査

学ぶ 胎児組織由来エンテロイドを用いた上皮透過性の測定法。免疫蛍光染色とDextran-FITCマイクロインジェクションにより、腸管バリア機能や漏れやすい腸のメカニズムを解析する体外モデルを構築します。

胎児組織由来エンテロイドの上皮透過性の試験

さらに動画を探す