Name: 動的界面の共焦点顕微鏡可視化のためのマイクロテンシオメータ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 学ぶマイクロテンシオメーターと共焦点顕微鏡を組み合わせた動的界面可視化法。表面活性物質の構造と機能の関係を高解像度で解析し、肺サーファクタントの特性と呼吸機能の研究に応用できます。

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全ての共焦点顕微鏡像は、ニコンA1RHDマルチフォトン直立共焦点顕微鏡を用いて得られた。我々は、ミネソタ大学のユニバーシティ・イメージング・センターにおけるサポート・スタッフ、特にギレルモ・マルケスの指導及び支援に感謝する。この研究はNIH Grant HL51177によって支援された。SIはルース・L・キルシュシュタインNRSA機関研究訓練助成金F32 HL151128の支援を受けた。

著者らは、開示すべき利益相反はありません。

結合されたCPM/CFMは、界面ダイナミクス、平衡、および形態を調べるための強力なツールです。このプロトコルでは、CPM/CFM を使用してデータを取得するために必要な手順について説明します。
図2 は、キャピラリー、溶媒、および熱交換用のチャネルが示されているセル設計を示しています。溶媒交換の入口はセルの下部にあり、出口は上部になければならず、交換中にセルがオーバーフローしないようにする必要があります。実際には、入口と出口の流量は、同じ蠕動ポンプに対してわずかに異なる場合があります。このセル設計の一般的な問題の 1 つは、セルからの漏れです。これは、ほとんどの場合、セルと接続の1つとの間の接続不良によって引き起こされますが、すべての接続が乾燥していて漏れていない場合、これはセルを囲むボルトの締め過ぎによるセルのスライドガラスの亀裂が原因である可能性があります。
図3 は、さまざまなポンプとセル間の接続、およ...

界面活性剤膜で覆われた空気と水の界面は、日常生活の中で遍在しています。界面活性剤 - 水注入は、枯渇した油田からの油回収を強化するために使用され、シェールガスおよび油の水圧破砕ソリューションとして使用されます。気液フォームおよび液液エマルジョンは、潤滑剤および洗浄剤として多くの工業的および科学的プロセスに共通しており、食品において一般的である。界面における界面活性剤およびタンパク質は、包装、保存、および投与中に抗体立体配座を安定化させ1、2、3、4、5、眼における涙液膜安定性6、7、8、および肺力学9、10、11、12、13、14、15。
界面に吸着する界面活性剤または界面活性剤およびその特性の研究は、多くの異なる実験技術16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27.最近の開発は毛細血管圧力マイクロテンシオメータ(CPM)であり、これは他の一般的な方法よりも大幅に少ない材料を使用しながら、はるかに小さな長さスケールで高度に湾曲した界面上の界面特性の検査を可能にする9,23,24,25。共焦点蛍光顕微鏡(CFM)は、CPM 22またはラングミュアトラフ20、26、27、28、29の空気 - 水界面における脂質およびタンパク質の形態を研究するために使用することができる。ここでは、CPMとCFMを組み合わせて、形態学的現象を動的および平衡界面特性に結びつけ、生物学的および技術的インターフェースの構造機能関係を発展させています。
CPM-CFMがアクセス可能な界面界面活性剤系には、多数の重要なパラメータがあります。CPMでは、直径30〜200μmの気泡がガラスキャピラリーチューブの先端に固定されています。CPMの以前のバージョンでは、気泡の内側と外側の間の毛細管圧力差は、水柱および振動シリンジポンプを介して制御された9,30;ここで説明する新しいバージョンは、これらを高精度のコンピュータ制御マイクロ流体ポンプに置き換えます。表面張力(γ)は、ポンプによって設定された界面を横切る圧力損失ΔP、および気泡の曲率半径Rの光学分析から、ラプラス方程式ΔP = 2γ/Rを介して決定されます。界面の動的表面張力は、可溶性界面活性剤を含むバルク液体と接触する新しい気泡の発生に続く10msの時間分解能で決定することができる。界面活性剤吸着ダイナミクスは、拡散度、表面被覆率、およびバルク濃度と平衡表面張力の関係を含む界面活性剤の本質的な特性を決定するために、古典的なワードトルダイ式10、31によって記述することができる。平衡表面張力が達成されると、界面面積を振動させて拡張弾性率を測定することができ、、気泡表面積の小さな変化によって誘発される表面張力の変化を記録することによって、<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq01.jpg" style="margin: auto;">A32。絡み合ったポリマーまたはタンパク質などの独自の内部構造を発達させるより複雑な界面の場合、表面張力は、、より一般的な表面応力4、33、<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq02.jpg" style="margin: auto;">によって置き換えられる。
呼吸中の肺安定性は、肺胞空気液界面9、10における低い表面張力および高い拡張弾性率の両方を維持することに直接結びついていてもよい。すべての内部肺表面は、組織水和34を維持するために、上皮ライニング液の連続したミクロン厚の膜で裏打ちされている34。この上皮内層液は主に水であり、塩および様々な他のタンパク質、酵素、糖、および肺界面活性剤を含む。湾曲した液体 - 蒸気界面の場合と同様に、毛細管圧力は、肺胞(または気泡)の内側の圧力が高いほど誘導される。しかし、表面張力が肺内のあらゆる場所で一定であった場合、ラプラス方程式ΔP = 2γ/Rは、小さな肺胞は大きな肺胞と比較してより高い内圧を有し、小さな肺胞のガス含有量はより大きく、より低い圧力の肺胞に流れることを余儀なくされることを示している。これは「ラプラス不安定性」9,35として知られています。最終的な結果は、最小の肺胞が崩壊して液体で満たされ、再膨張が困難になり、肺の一部が崩壊し、他の部分が過剰に膨張し、どちらも急性呼吸窮迫症候群(ARDS)の典型的な症状である。しかし、適切に機能している肺では、呼吸中に肺胞界面領域の空気 - 上皮液界面が伸縮するにつれて、表面張力が動的に変化する。ラプラス圧力が半径の減少とともに減少し、半径の増加とともに増加してラプラスの不安定性を排除すると<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq03.jpg" style="margin: auto;">、肺9が安定化する。<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq04.jpg" style="margin: auto;">したがって、、それが周波数、単層形態および組成、<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq05.jpg" style="margin: auto;">ならびに肺胞液組成にどのように依存するかは、肺安定性に不可欠であり得る。CPM-CFMはまた、界面活性剤吸着25、単層形態22および拡張弾性率9に対する界面曲率の影響の最初の実証を提供した。CPM内のリザーバの小容量(〜1mL)は、液相の迅速な導入、除去、または交換を可能にし、高価なタンパク質または界面活性剤10の必要量を最小限に抑える。
CPM−CFM画像におけるコントラストは、界面16、27における蛍光的にタグ付けされた脂質またはタンパク質の小さな画分の分布によるものである。二次元界面活性剤単層は、しばしば表面張力または表面圧力の関数として横方向の相分離を示すπ、 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq06.jpg" style="margin: auto;"> γは、清浄な流体−流体界面の表面張力(γ0)と界面活性剤被覆界面との差π、純粋な流体表面張力を低下させるように作用する界面における界面活性剤分子の相互作用によって引き起こされる2−D「圧力」と考えることができる。低い表面圧力では、脂質単層は液体のような無秩序な状態にある。これは液体膨張(LE)相として知られています。面圧が上昇し、脂質分子当たりの面積が減少するにつれて、脂質は互いに配向し、長距離秩序液体凝縮(LC)相への一次相転移を受けることができる16、20、27。LE相およびLC相は、様々な表面圧力で共存することができ、蛍光的にタグ付けされた脂質がLC相から除外され、LE相に分離されるので視覚化することができる。したがって、CFM16で撮像すると、LE位相は明るく、LC位相は暗い。
この原稿の目的は、複合共焦点顕微鏡マイクロテンシオメータを構築して操作するために必要なステップを記述することです。これにより、読者は吸着研究を行い、表面張力、レオロジー挙動を測定し、ミクロンスケールの空気/水または油/水の界面で界面形態を同時に調べることができます。これには、必要な毛細血管を引っ張り、切断し、疎水化する方法、圧力、曲率、および表面積制御モードを使用するための指示、およびマイクロテンシオメータ湾曲界面への不溶性界面活性剤の界面移動に関する議論が含まれる。

<table><tbody><tr><td>1.5 O.D. タイゴン チューブ</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td><td></td>ック <td>チューブ</td></tr><tr><td>A1RHD 多光子直立共焦点顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td>共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>酸洗浄液</td><td></td><td></td><td>硫酸と Alnochromix 水で 50% 体積で希釈し、</td></tr><tr><td>Alnochromix</td><td>Alconox</td><td>2510</td> <td>を希釈するまで待ちますパッケージの説明書に硫酸と混合し、希釈して酸洗浄液を作る</td></tr><tr><td>セラミックガラスカッター</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650471</td><td>HPLC Plus</td></tr><tr><td>Curosurf</td><td>Chiesi</td><td></td><td>&nbsp;肺界面活性剤</td></tr><tr><td>Di</td><td></td><td></td>水<td>18.5 M&Omega; - cm</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>任意の</td><td></td><td>200プルーフは疎水性化に使用され、変性は</td></tr><tr><td>Fiber-Liteモデル190光ファイバーイルミネ</td>ーターDolan-Jenner <td>Industries Inc.の</td>クリーニングに使用されます。<td>281900100</td><td>光源; 他の光源も同様に機能する必要があります</td></tr><tr><td>Flow EZ F69 mbar w/Link Module</td><td>Fluigent</td><td>LU-FEZ-0069</td><td>マイクロ流体ポンプ</td></tr><tr><td>Fluigent SDK VIs</td><td>Fluigent</td><td></td><td>CPM仮想インターフェースに必要な</td></tr><tr>厚さ<td>1mmのVitonシートから機械加工された</td><td>フルオロエラストマーガスケット</td><td></td><td></td>、図3を参照してください</tr><tr><td>ガスフィルター</td><td>Norgren</td><td>F07-100-A3TG</td><td>マイクロ流体ポンプと圧力調整器の間に置く</td></tr><tr><td>ガス調整器 ノル</td><td>グレン</td><td>10R0400R</td> ソース<td>からポンプの範囲に圧力を下げ、ガスフィルター範囲に接続 2-120 psi</td></tr><tr><td>ガラス キャピラリー</td><td>サッター機器</td><td>B150-86-10</td><td>ホウケイ酸ガラス O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm</td></tr><tr><td>ガラス スライド</td><td>任意の</td><td></td><td>75 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>ガラス シリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>84878</td><td>25 &mu;Lガラスシリンジ</td></tr><tr><td>疎水性化剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>667420</td><td>1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチルトリエトキシシラン98%、他の疎水性トリエトキシシランは代用できます</td></tr><tr><td>不溶性界面活性剤</td><td>Avanti</td><td>850355C-200mg</td><td>16:0 DPPC in chloroformLabVIEW</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td>National Instruments</td><td></td><td>2017</td></tr><tr><td>Longpass Filter</td><td>ThorLabs</td><td>FEL0650</td><td>650 nmロングパスフィルター、波長は励起レーザーの頻度を除去する必要があります</td></tr><tr><td>Lyso-PC</td><td>Avanti</td><td>855675P</td><td>16:0 Lyso PC 1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン</td></tr><tr><td>Masterflex L / S可変速アナログコンソルポンプシステムw/&nbsp;Easy-Load II ポンプヘッド</td><td>Masterflex</td><td>HV-77916-20</td><td>蠕動ポンプ</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>R2019</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー P-1000</td><td>サッター機器</td><td></td><td>キャピラリープーラー</td></tr><tr><td>マイクロテンシオメーター セルとホルダー</td><td></td><td></td><td>セルはPEEKから機械加工され、ホルダーはアルミニウムから機械加工されています、図3および4を参照してください</td></tr><tr><td>マイクロテンシオメーター 対物</td><td>レンズ ニコン</td><td></td><td>Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 &infin;/0 WD 2.0 mm</td></tr><tr><td>NI ビジョン開発モジュール</td><td>National Instruments</td><td></td><td>CPMバーチャルインターフェースに必要</td></tr><tr><td>PEEKフィンガータイトフィッティング</td><td>IDEX</td><td>F-120x</td><td>10-32 コーンポート</td></tr><tr><td>PEEKプラグ</td><td>IDEX</td><td>P-551</td><td>10-31 コーンポート</td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>Eppendorf</td><td>22492225</td><td>100 &mu;L - 1000 &mu;L、オートクレーブプラスチック</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>Thermo Scientific</td><td>6320-0010</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックシリンジ</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-459</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>配管部品</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td></td>ック <td>3 ウェイバルブとチューブを接続するためのその他の配管部品。</td></tr><tr><td>Research Plus 1チャンネル 100 &mu;L&ndash;1000 &mu;L</td><td>エッペンドルフ</td><td>3123000063</td><td>マイクロピペッター</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>酸 任意の</td><td></td><td>酸洗浄液に使用</td></tr><tr><td>T プラン SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm</td><td>ニコン</td><td></td><td>共焦点顕微鏡 対物レンズ</td></tr><tr><td>テキサスレッド DHPE トリエチルアンモニム塩</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>1395MP</td><td>フルオロフォア</td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>ガスト</td><td>DOA-P704-AA</td><td></td></tr></tbody></table>

動的界面の共焦点顕微鏡可視化のためのマイクロテンシオメータ

Microtensiometer for Confocal Microscopy Visualization of Dynamic Interfaces

界面活性分子の流体-流体界面への吸着は、本質的に遍在している。これらの界面を特徴付けるには、界面活性剤吸着速度を測定し、バルク界面活性剤濃度の関数として平衡表面張力を評価し、平衡化後の界面領域の変化と表面張力がどのように変化するかを関連付ける必要があります。高速共焦点顕微鏡による蛍光イメージングによる界面の同時可視化により、構造機能関係を直接評価することができます。キャピラリー圧力マイクロテンシオメータ(CPM)では、半球状の気泡がキャピラリーの端部に固定され、1mL容の液体リザーバに固定される。気泡界面を横切る毛細管圧力は、ラプラス方程式に基づくモデルベースの圧力、気泡曲率、または気泡面積制御を可能にする市販のマイクロ流体フローコントローラ を介して 制御される。Langmuirトラフやペンダントドロップなどの以前の技術と比較して、測定と制御の精度と応答時間が大幅に向上しています。毛細管圧力の変化は、ミリ秒単位で適用および制御できます。気泡界面の動的応答は、気泡が膨張および収縮するにつれて、第2の光学レンズ を介して 視覚化される。気泡の輪郭は円形プロファイルにフィットし、気泡の曲率半径 R と、結果を無効にする円形度からの偏差を決定します。ラプラス方程式は、界面の動的表面張力を決定するために使用されます。平衡化に続いて、コンピュータ制御のマイクロ流体ポンプによって小さな圧力振動を課して気泡半径(0.001〜100サイクル/分の周波数)を振動させて拡張弾性率を決定することができ、システムの全体的な寸法は、マイクロテンシオメータが高速共焦点顕微鏡のレンズの下に収まるほど十分に小さく、蛍光タグ付き化学種をサブミクロンの横方向分解能で定量的に追跡することができる。

測定誤差の主な原因は、切断プロセス(図5A、B)またはコーティングプロセス(図5D)のいずれかに欠陥がある毛細血管から生じます。どちらのタイプの欠陥も、光学画像解析システムによる気泡の形状およびサイズを決定する際にエラーをもたらし、不正確な表面張力値につながる。新しいキャピラリーを引っ張ってコーティングした後、CPMにキャピラリーを挿入する前に、光学顕微鏡下でコーティングした後、各新しいキャピラリーを慎重に検査することが重要です。ミスカットされたキャピラリーは廃棄する必要がありますが、コーティングが不十分なキャピラリーは酸洗浄して再コーティングして、キャピラリーの端部での気泡のピン留めを改善することができます(プロトコルのステップ2)。キャピラリーは、エンドカットがキャピラリーに対して完全に垂直であり(図5C)、バブルピンがキャピラリーの端部に直接ある場合(図5E)に...

本稿では、界面形態を可視化しながら界面張力と表面拡張レオロジーを同時に測定するためのマイクロテンシオメータ/共焦点顕微鏡の設計と操作について述べる。これにより、技術や生理学において重要な界面の構造と特性の関係をリアルタイムに構築することができます。

Adsorption of surface-active molecules to fluid-fluid interfaces is ubiquitous in nature. Characterizing these interfaces requires measuring surfactant ...

この方法は、共焦点顕微鏡と毛細管圧マイクロテンシオメーターを組み合わせて、高い空間分解能と時間分解能で曲線流体界面を研究するために使用できる強力なツールを作成します。この技術は、表面特性の同時測定と高湾曲界面の表面形態の共焦点画像を同時に行うことにより、表面活性材料の構造と機能の関係を調べることができます。炎症の産物が肺サーファクタントを抑制し、呼吸障害を引き起こすと仮定します 正確な呼吸窮迫症候群に関連する。このドアは、そのような材料にさらされた肺サーファクタントの特性および形態および肺の安定性を調べることができる。まず、キャピラリーの大きな側をセルの下側に押し込むまでセルの上部に配置して、CPMセルを組み立てます。ピークコネクタをゆっくりと締めてキャピラリーを固定し、マイクロ流体ポンプからキャピラリーの大きな側にチューブを取り付けます。必要に応じて、溶媒交換リザーバーおよび/または温度制御バスをCPMセル上のそれぞれの入口および出口に取り付ける。それ以外の場合は、未使用の入口と出口を塞いでください。CPMセルを共焦点顕微鏡ステージに取り付け、CFM対物レンズ、CPMカメラ、CPM光源とほぼ位置合わせします。ポンプの推奨動作圧力でマイクロ流体ポンプへのガス流を開き、キャピラリーへの流れが開いていることを確認します。CPM仮想インターフェイスの実行を開始し、ベースライン圧力を25ミリバールに設定し、圧力制御モードに切り替えます。次に、ピペットを使用してCPMセルに水を入れます。マイクロテンシオメーターカメラを使用して毛細管先端に焦点を合わせ、気泡と重なるようにアヌを配置します。共焦点顕微鏡の液浸対物レンズを細胞内の流体と接触させ、共焦点顕微鏡を使用して気泡に焦点を合わせます。[バブルのリセット]をクリックして、新しいバブルが形成されていることを確認します。バブルが飛び出さない場合は、表示ウィンドウの下のバブルリセットタブでリセット圧力を上げるか、リセット遅延時間を増やします。セルシリンジに直接水を取り出し、空にして再度取り付けます。セルに目的のサンプルを充填します。オートクレーブピペットを使用してCPMソフトウェアを圧力制御モードに保ち、新しい気泡界面が作成されたときに初期表面張力が約73ミリニュートン/メートルであることを確認します。新しく形成された気泡の半径を決定したら、その値を中心線エリアコントロールに入力し、[エリアコントロール]タブをクリックしてコントロールタイプをエリアコントロールに変更します。共焦点ビデオの録画を開始し、[バブルのリセット]をクリックして、すぐに[データの収集]をクリックします。バーをスライドさせて、サンプルの総吸収時間に応じてデータ記録速度を調整します。実験終了後。正しいファイルパスを選択し、保存ボタンをクリックしてファイルを保存します。記録を停止して CFM にも保存します。目的のベースライン値の振動率と発振周波数を入力し、発振を圧力振動、エリア振動、曲率振動のいずれにするかを決定して、適切なタブを選択します。共焦点ビデオの録画を開始し、CPMソフトウェアで[データの収集]をクリックします。各発振サイクルに適切な数のデータポイントを与えるために、データ集録レートを選択します。他の振動振幅または周波数が必要な場合は、実験中に値を変更し、結果を保存します。まず、蠕動ポンプの入口チューブを目的の交換溶液のボトルに挿入し、出口チューブを廃棄物容器に挿入します。共焦点ソフトウェアでビデオの録画を開始し、CPMソフトウェアで[データの収集]をクリックします。次に、蠕動ポンプ速度を設定します。複数の流体を交換する必要がある場合は、蠕動ポンプを停止し、入口を別の交換溶液に接続します。交換が完了したら、前に示したように結果を保存します。一定の圧力吸収に関するマイクロテンシオメーターの結果は、気泡の表面積が研究全体を通して大幅に増加し、一定の表面積の場合よりもはるかに遅い吸収をもたらすことを示しました。吸収プロセス中、界面からの蛍光シグナルは低く始まり、界面活性剤が界面に吸収するにつれて増加しました。界面活性剤が表面ドメインを形成する場合、これらのドメインは形成および成長を観察することができる。振動スタディを実行する場合、振動は制御されているパラメータに対してのみ真正弦波です。表面積制御スタディでここに示すように、面積の振動は正弦波でなければならないため、表面拡張係数を計算するときにこれが重要です。振動研究から収集された表面張力と面積のデータを使用して、界面活性剤層の界面拡張弾性率を直接計算しました。リン酸化脂質単層を振動させると、連続着色液膨張相全体にわたって黒色液体凝縮ドメインの動きが観察できる。界面上の異なるドメインは、湾曲したバブル上で振動が起こるにつれて界面をカバーするように成長する分岐ネットワークに再編成されました。これは、表面張力と表面拡張弾性率の同時変化によって裏付けられています。緩衝溶液となげなわPC溶液を用いた肺サーファクタント単層の溶媒交換研究中に、交換が行われるにつれてドメインの形態が大幅に変化しました。気泡の振動とピン留めを視覚的に追跡して、毛細管が正方形であり、気泡がその球形を維持していることを確認することが重要です。空気-水界面に加えて、油-水界面も研究して、エマルジョンの安定性と特性を決定することができます。この手法は、カーブインタフェースの構造プロパティ関係を構築するための単一の変更アプローチを提供します。これにより、以前はフラットインターフェースでのみ研究されていた異人種間の形態を支配する要因の新しい調査が可能になります。

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