Name: 覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T13:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶAAV注入と頭蓋窓埋め込みを用いた覚醒マウスでのミクログリア動態と神経活動の同時イメージング手法。この方法により運動アーティファクトを最小化し、生理条件下での細胞間相互作用をリアルタイムに観察できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ウイルスベクターを提供してくださった近藤雅史博士と松崎正則博士に感謝します。本研究は、科学研究費補助金(20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 to S.O.)、国立研究開発法人日本医療研究開発機構(JP19gm1310003、JP17gm5010003、JP19dm0207082 H.M.)、東京大学人間行動統合科学研究センター(CiSHuB)、国立研究開発法人科学技術振興機構ムーンショット研究開発(JPMJMS2024〜H.M.)の支援を受けて行われました。 脳科学財団(H.M.へ)。

すべての実験は、東京大学大学院医学系研究科・医学部動物倫理委員会および遺伝子組換え実験安全委員会の承認を受け、ガイドラインに従って実施されました。
1. 事前準備
<ol><li>オートクレーブまたは70%エタノールを使用して、手術に必要なすべての器具と装置を滅菌します。</li>
	<li>ガラスピペットの準備。<ol><li>75 μLの校正済みキャピラリーをマイクロピペットプーラーのホルダーにしっかりと固定します。P(圧力)= 500、HEAT = 680、PULL = 30、VEL = 60、TIME = 180の推奨パラメータを使用して、プーラーをプログラムに設定します。</li>
		<li>プログラム終了後(通常4.5〜5秒)、キャピラリーは先細りのテールを持つ2つのガラスピペットに分割されます。次に、尾の遠位部分をピンセットで破り、先端の直径を30〜50μm以内に保ちます。このためには、斜め部分の端から1 cm離れた尾を折ってください。</li>
	</ol></li>
	<li>開頭術の場合は、UV光硬化試薬を使用して、直径4 mm、厚さ0.15 ± 0.02 mmの大きな外側のガラスディスクを、直径2 mm、厚さ0.525 ± 0.075 mmの小さな内側のガラスディスクに接着することにより、頭蓋窓を準備します(図2A)。</li>
</ol>2.AAVインジェクション
<ol><li>注入装置の準備<ol><li>26 Gハミルトンシリンジに接続されたガラスピペットをチューブを介して定位固定装置のピペットホルダーに置き、ピペットホルダーを垂直軸から前方に60°傾けます(図1A、B)。</li>
		<li>ガラスピペット、シリンジ、および接続チューブに流動パラフィンを入れます。シリンジをマイクロインジェクターに置きます。</li>
	</ol></li>
	<li>手術 注:以下の手術は滅菌ブースで行われました。必要に応じて実体顕微鏡を手術に使用した。<ol><li>7〜8週齢(体重22〜26 g)の雄性CX3CR1-EGFPマウス( 材料表の詳細情報)を気密チャンバー内で3%イソフルランで麻酔します。3分後、呼吸以外の随意運動を失ったときにマウスをチャンバーから取り出し、2%イソフルランを含む鼻管による連続麻酔に切り替えます。 注:イソフルランはミクログリアを活性化することが知られています。しかし、画像化は手術の4週間後に行われるため、画像化中のマウスに対するイソフルランの影響はありません。画像化前にマウスを脳定位固定装置に入れると、イソフルラン麻酔が数分間使用されますが(ステップ4.2.1)、この短い麻酔の効果はごくわずかであることがわかりました。</li>
		<li>手術中は、低体温を防ぐために、37°Cの加熱パッドでマウスを暖かく保ちます。角膜の乾燥を防ぐために両眼に眼軟膏を塗布し、メロキシカム注射を皮下投与します(5 mg / kg)。マウスを補助イヤーバーに取り付けてから、マウスを背側を上にして脳定位固定装置に固定します。</li>
		<li>呼吸と心拍数を監視しながら、手術中にイソフルラン濃度を適切な割合(1%〜2%)に調整します。脱毛クリームを使用して髪を取り除き、ヨウ素ベースまたはクロルヘキシジンベースのスクラブとアルコールの両方で円を描くように頭を数回消毒します。その後、0.1mLの1%リドカインを皮下注射し、滅菌ドレープを塗布して手術部位を固定します。</li>
		<li>ハサミで正中線に沿って頭皮を切開し、切開部を約2 cmの長さにして、右一次視覚野の上の頭蓋骨の露出を確保します。頭皮を切開した後、露出した頭蓋骨と脳が乾燥するのを防ぐために、手順全体を通して生理食塩水で頭を洗浄します。</li>
		<li>鉗子を使用して露出した頭蓋骨の骨膜を取り除きます。脳定位固定装置座標(正中線の横3 mm、ラムダ線の前方0.5 mm)に頭蓋骨をドリルで開けて、直径約0.5 mmの小さな穴を作ります。必要に応じて、ドリルビットから血液や組織の破片を洗い流します。</li>
		<li>以下の手順で、8.3 x 1012 ベクターゲノム/mL22の力価で1 μLのrAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07をガラスピペットに充填します。<ol><li>シリンジを進めて、ガラスピペットから1 μLの流動パラフィンを排出します。マウスの露出した頭蓋骨に約2 cm x 2 cmの透明なフィルムを置き、ピペッターを使用してフィルム上に1 μLのAAV溶液の液滴を排出します。</li>
			<li>ガラスピペットチップをフィルム上のAAV溶液の液滴に入れ、シリンジをそっと引いてAAV溶液を吸引します。排出後、T字型活栓を回して、チューブとガラスピペット内の圧力を解放します。</li>
		</ol></li>
		<li>ステップ2.2.5で作成した穴を通して脳表面から500μmの深さまでガラスピペットを挿入し、マイクロインジェクターを使用して0.5μLのAAV溶液を注入します(図1C)。注入体積流量は2.0 μL/hです。0.5μLの注射には15分かかり、その後5分間待ちます。</li>
		<li>注射後、ガラスピペットを静かに引き出し、生理食塩水で脳表面を洗い流します。</li>
	</ol></li>
</ol>3.頭蓋窓の移植
注:頭蓋窓の移植は、同じ日のAAV注射に続きます。
<ol><li>頭蓋骨に直径2.5 mmの円をマークし、ラムダから横方向に3 mmの中央に配置します。穴を開けて頭蓋骨のマークに沿って円形の溝を作成します。頭蓋骨の視界に悪影響を与える可能性があるため、破片を清掃し、穴あけプロセス中に生理食塩水を塗布して、加熱を防ぎます。</li>
	<li>円形の溝の穴あけ深さが中央の頭蓋骨の破片を取り除くのに十分かどうかを確認するには、中央の頭蓋骨を鉗子でそっと押します。抵抗の少ない垂直方向に移動する場合は、穴あけ深さで十分です。</li>
	<li>溝が十分な深さに達したら、鉗子の先端を中央の頭蓋骨断片の底に挿入し、ゆっくりと持ち上げて取り外して脳表面を露出させます(図1D)。</li>
	<li>27 Gの針を使用して、露出した脳表面の端にある硬膜を刺して引き裂きます。鉗子の先端を硬膜の端に作られた穴に挿入します。硬膜を持って剥がすと、脳表面が露出します。 注意: 出血が発生した場合は、出血が止まるまで生理食塩水で脳表面を洗い流してください。</li>
	<li>鉗子を使用して、3.5 mmディッシュの生理食塩水に止血繊維を1つずつ分散させ、次に、切断された硬膜が存在する穴の縁に沿って止血繊維を配置します。</li>
	<li>ステップ1.3で用意した頭蓋窓を露出した脳表面に置き、窓が頭蓋骨に密着するように窓を軽く押しながら瞬間接着剤で頭蓋骨に接着します。</li>
	<li>その後、露出した頭蓋骨全体に瞬間接着剤を塗布し、ヘッドプレートを頭蓋骨に慎重に取り付けて、窓がヘッドプレートの四角い穴の中心に位置するようにします(図2C)。ヘッドプレートの表面がガラス窓の表面と平行であることを確認します。</li>
	<li>接着剤が十分に硬化したら、露出した頭蓋骨に歯科用セメントを塗布して、ヘッドとヘッドプレートの間の取り付けを強化します(図2)。 注:実験にマウスへの視覚刺激の提示が含まれる場合は、イメージング領域への迷光を避ける必要があります。光反射を減らすために、セメントを活性炭と混合して黒くすることをお勧めします。</li>
	<li>セメントが十分に硬化した後(約20分)、マウスを麻酔から引き離します。次に、マウスを新しいケージに入れて、単独で回復します。</li>
	<li>意識と自発的な動きを確認し、完全に回復したことを確認した後、マウスをホームケージに戻します。回復中に、明らかな痛みを示す行動が発生した場合は、2回目または必要に応じてメロキシカム用量(24時間に1回、1〜3日間)を投与します。.</li>
</ol>4. ミクログリアと神経細胞カルシウム動態の in vivo 二光子イメージング
<ol><li>顕微鏡装置へのマウスの馴化<ol><li>手術の3週間後、3%イソフルランでマウスに麻酔を誘発し、カスタムメイドの定位固定装置を使用して2光子顕微鏡の25倍対物レンズの下にマウスをセットしました(図3C)。ここでのセットアップでは、マウスをトレッドミルの上に置き、自由に走らせます。</li>
		<li>約10分後、マウスを顕微鏡ステージから取り外し、ホームケージに戻します。2光子画像を取得する前に、隔日で少なくとも3回慣れを繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>2光子画像取得 注:ミクログリアの活性化は徐々に基礎レベルに戻るため、術後4週間以上で画像取得を行うことをお勧めします。<ol><li>ステップ4.1と同様に、3%イソフルランでマウスに麻酔を誘発し、カスタムメイドの定位固定装置を使用してマウスを2光子顕微鏡の対物レンズの下にセットします。</li>
		<li>以下に説明するように、カスタムメイドのシェーディングデバイスと視覚刺激用のLCDモニターを取り付けます(図3D)。<ol><li>レンズを脳表面に焦点を合わせるように配置し、このレンズ位置を元のZ位置として設定します。x-y座標を一定に保ち、対物レンズを持ち上げます。マウスと定位固定装置を対物レンズとトレッドミルから取り外します。</li>
			<li>木炭粉末と混合して黒くなるシリコーンを使用してヘッドプレートの上部に遮光装置を取り付け、ヘッドプレートと遮光装置の間のスペースが十分に密閉されていることを確認します。</li>
			<li>シェーディングデバイスを蒸留水で満たしてから、マウスと定位固定装置フレームを対物レンズの下とトレッドミルに再度固定します。脳表面の焦点面を慎重にリセットし、対物レンズの深さを確認します。 注意: 対物レンズを損傷するリスクを回避するために、最初にxyz座標を設定してから、対物レンズのシェーディングデバイスを適用します。最初にカバーを取り付けてから座標を調整することも合理的ですが、このオプションには慎重な取り扱いが必要です。</li>
			<li>対物レンズを介した視覚刺激に使用されるLCDモニターからの光の汚染を避けるために、対物レンズを黒いアルミホイルで覆います(図3D)。10インチのLCDモニターをマウスの目の前12.5 cmに設定して、視覚刺激を表示します(図3D)。</li>
		</ol></li>
		<li>蛍光発光収集フィルターをEGFP蛍光(525/50 nm発光フィルター)とR-CaMP蛍光(593/46 nm発光フィルター)に設定し、励起波長を1,000 nmに設定します。25x 1.1 NA対物レンズとGaAsP PMTを使用して、0.25 μm/ピクセルの空間分解能で画像を取得します。</li>
		<li>R-CaMP(+)ニューロンとEGFP(+)ミクログリアが2/3層で同時にイメージングできるイメージング領域を見つけます。この設定では、 図4 と ビデオ1 で得られたデータは、ライブ画像プレビューを使用して、パイアル表面から100μmの深さにありました。励起レーザーの出力をできるだけ低くして、イメージング領域の局所温度の上昇によって引き起こされる光退色や損傷を回避します。</li>
		<li>画像取得と同時に、100%コントラスト、1.5Hz、1度あたり0.04サイクルで、0°から150°までの6つの方向で30°ステップで1度あたり0.04サイクルのドリフトグレーティング視覚刺激をマウス17に提示します。</li>
		<li>画像取得後、マウスを顕微鏡ステージから取り外し、シェーディングデバイスと定位固定装置をマウスから取り外し、マウスをホームケージに戻します。</li>
	</ol></li>
	<li>データ登録<ol><li>取得した画像データ(この場合はnd2形式)を、フィジーまたは顕微鏡に付属のソフトウェアを使用して、カラーチャンネルごとに一連のtiff画像ファイルとして変換して保存します。</li>
		<li>フィジーのプラグインであるTurboregを適用して、モード=翻訳で登録を実行します。平均画像をEGFPチャンネルのtiff画像ファイルで参照画像として使用します。</li>
		<li>MATLABを使用してフレームごとに以下の処理を行います。 注:以下の処理ではMATLABを使用しますが、Pythonなどの他のプログラミングソフトウェアでデータを分析できるように、主に各ステップの意図に焦点を当てています。<ol><li>imread機能を使用すると、同じフレームの登録前と登録後にそれぞれ2つのEGFPtiff画像を読み込みます。imread 関数を使用して、同じフレームの R-CaMP tiff 画像を読み込みます。</li>
			<li>normcorr2 関数を使用して、ステップ 4.3.3.1 で読み取られた 2 つの GFP 画像のベクトル化された変数間の相関関数を計算します。</li>
			<li>max関数を使用して相関関数の相互相関が最も高い線形インデックスを検出し、ind2sub関数を使用して、元の画像から登録画像の移動位置を計算します。</li>
			<li>インワープ関数を使用して、R-CaMP画像を手順4.3.3.3で計算した位置に変換し、次にインライト機能を使用してR-CaMPの登録画像を保存します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>微量カルシウムの生成<ol><li>MATLABを用いて以下の処理を行います。imread 関数を使用して、ステップ 4.3.3.4 で生成されたすべての登録済み R-CaMP tiff イメージを読み込みます。登録済みの画像が既にワークスペースに変数として読み込まれている場合は、この手順を省略します。</li>
		<li>平均関数を使用して、時間投影画像を生成します。imshow 関数を使用して、平均化された画像を図として表示します。roipoly関数を使用して、ターゲット構造(このデータでは樹状突起スパイン)のバイナリROIマスクを生成します。</li>
		<li>バイナリマスクに各フレームの画像を入力変数として乗算した画像の平均関数を使用して、各フレームのROI内の平均蛍光強度を計算します。</li>
		<li>前述の17のように、ステップ4.4.3で得られた変数に、高周波ノイズをカットするためにカットオフ=1.6秒でバターワース周波数フィルタを適用し、次にタイムウィンドウ=200秒でスライディングメディアンフィルタを適用して低周波ノイズをカットする。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Andoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+reverses+behavioral+and+synaptic+abnormalities+after+maternal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Exercise reverses behavioral and synaptic abnormalities after maternal inflammation.</a> Cell Reports. 27 (10), 2817-2825 (2019).</li>
<li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neuropathic+pain%3A+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li>
<li>Clasadonte, J., Scemes, E., Wang, Z., Boison, D., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+43-mediates+astroglial+metabolic+networks+contribute+to+the+regulation+of+the+sleep-wake+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Connexin 43-mediates astroglial metabolic networks contribute to the regulation of the sleep-wake cycle.</a> Neuron. 95 (6), 1365-1380 (2017).</li>
<li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+disrupt+mesolimbic+reward+circuitry+in+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia disrupt mesolimbic reward circuitry in chronic pain.</a> Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li>
<li>Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+changes+of+spine+dynamics+and+microglia+after+transient+peripheral+immune+response+triggered+by+LPS+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo.</a> Molecular Brain. 4, 27(2011).</li>
<li>Wu, Y., Dissing-Olsen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Dynamic+mediators+of+synapse+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia: Dynamic mediators of synapse development and plasticity.</a> Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).</li>
<li>Andoh, M., Koyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+regulate+synaptic+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Microglia regulate synaptic development and plasticity.</a> Developmental Neurobiology. 81 (5), 568-590 (2020).</li>
<li>Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+impact+of+microglial+distribution+on+dynamics+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines.</a> European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).</li>
<li>Nakayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+permit+climbing+fiber+elimination+by+promoting+GABAergic+inhibition+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum.</a> Nature Communications. 9 (1), 2830(2018).</li>
<li>Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglia+directly+monitor+the+functional+state+of+synapses+in+vivo+and+determine+the+fate+of+ischemic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals.</a> Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).</li>
<li>Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), 10000527(2010).</li>
<li>Liu, Y. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+network+activity+controls+microglial+process+surveillance+in+awake+mice+via+norepinephrine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).</li>
<li>Kim, T. H., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+large-scale+neural+ensemble+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of large-scale neural ensemble dynamics.</a> Cell. 185 (1), 9-41 (2022).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Isshiki, M., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cranial+window+types+for+in+vivo+two-photon+imaging+of+brain+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures.</a> Microscopy (Oxf). 63 (1), 53-63 (2014).</li>
<li>Ohtsuki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarity+of+visual+selectivity+among+clonally+related+neurons+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Similarity of visual selectivity among clonally related neurons in visual cortex.</a> Neuron. 75 (1), 65-72 (2012).</li>
<li>Maruoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+system+of+functionally+distinct+cell+types+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex.</a> Science. 358 (6363), 610-615 (2017).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Bernier, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+surveillance+of+the+brain+by+microglia+via+cAMP-regulated+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nanoscale surveillance of the brain by microglia via cAMP-regulated filopodia.</a> Cell Reports. 27 (10), 2895(2019).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+anesthesia-specific+alterations+in+microglial+surveillance+and+photodamage-directed+motility+in+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421(2019).</li>
<li>Merlini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Gi-dependent+dynamics+regulate+brain+network+hyperexcitability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability.</a> Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).</li>
<li>Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+hippocampus+without+cortical+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion.</a> eLife. 6, 26839(2017).</li>
<li>Badimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+control+of+neuronal+activity+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Negative feedback control of neuronal activity by microglia.</a> Nature. 586 (7829), 417-423 (2020).</li>
<li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+for+Neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動を同時にイメージングし、データ処理を行うためのAAV注射と開頭術のプロトコルについて説明します。この手法は、ミクログリアのダイナミクスと神経活動の間の協調を、秒未満から数十秒の範囲の時間スケールで明らかにすることができます。
手術プロトコルには、技術的に要求の厳しいいくつかのステップが含まれます。AAVインジェクションは重要なステップの1つです。AAV注射に失敗すると、R-CaMPの発現が有意に低下する可能性があります。2つの主な理由があります:ガラスピペットの詰まりと組織の損傷です。ガラスピペットの目詰まりは、AAV溶液の排出を減少または完全にブロックします。この状況は、AAV溶液をファストグリーンなどの染料で着色し、注入の成功を視覚的に確認することで回避できます。AAV注射によって引き起こされる組織損傷は、注射部位の中心付近で外因性の遺伝子発現を妨げる。AAV注入によって引き起こされる損傷は、ピペット内の圧力が蓄積した後、ガラスピペットの先端からの流出が突然増加することによって引き起こされる可能性があります。したがって、ガラスピペットからのAAV溶液の流出は、注入中に一定でなければなりません。先端の直径が少し広いガラスピペットを選択すると、この問題を解決できます。頭蓋窓移植では、手術のスピードが重要です。手術に時間がかかりすぎると、脳組織がひどく損傷する可能性があります。したがって、手術のスピードと滑らかさを確保するためには、繰り返し練習する必要があります。また、手術から画像化までの4週間の間に、従来の方法による頭蓋窓と脳組織との間の組織再生により画像化の質が低下することがある17。ここでの方法は、頭蓋窓の内側のガラスディスクに厚いガラスを適用して組織再生を抑制し、窓を透明に保つことにより、この問題を克服します。ここで説明するシステムでは、厚さ0.525±0.075μmの内部ガラスディスクを使用することで、この効果が明らかになりました。
この方法は、4週齢のマウスにうまく適用することができるが、若いマウスへの適用は問題があり得る。幼若マウスでは、頭蓋骨は急速で顕著な成長を示し、頭蓋骨とガラス窓の間にミスマッチを誘発します。
いくつかの最先端の研究では、in vivo二光子イメージングを使用してミクログリア-ニューロン相互作用を研究しました12,21,23。特にMerliniらによる先駆的な研究では、細胞体内のミクログリアダイナミクスと神経活動のin vivoイメージングを同時に行った21。本手法では、頭蓋窓に厚い内面ガラスを用いることで、深層方向の運動アーチファクトを抑制し、樹状突起棘などの微細構造における神経活動を安定して計測することができました。この方法は、覚醒マウスにおけるシナプス-ミクログリアプロセスの相互作用を調べるのに役立ちます。
最近、 in vitro 研究により、薄い糸状筋様ミクログリア突起は厚い突起よりも運動性が速いことが実証され、監視における運動性の向上の重要性が示唆されています19。ここでのシステムは、薄いミクログリア突起の運動性を、秒未満から数十秒の時間分解能で追跡することができます。この特性は、 in vivoでのサーベイランスに対するそれらの運動性の機能的意義を解明するのに役立ちます。
将来的には、このイメージング技術と、光遺伝学24 や化学遺伝学25などの介入を局所神経回路や地域間神経接続に適用することで、神経回路の特性を形作るシナプス発生や可塑性における新しいミクログリア機能に光を当てることができます。また、イメージング、介入、行動タスクのさらなる統合は、特定の行動の根底にあるミクログリアとニューロンの調整を明らかにすることに貢献します。

体の内部状態が動物の脳機能に絶えず影響を与えるという証拠が増えています1,2,3,4,5。したがって、脳の機能をより深く理解するためには、脳内のグリア細胞が末梢の生体状態を監視し、その情報を神経細胞に中継する方法を解明することが重要です。
脳内の免疫細胞であるミクログリアは、シナプスの発達と可塑性に関与しており、脳内の神経回路の特徴を彫刻しています6,7,8,9。例えば、Wakeらによる先駆的な研究は、ミクログリアプロセスがマウス新皮質においてニューロン活動依存的にシナプスと接触し、人工虚血がミクログリア10との長期接触後にシナプス喪失を誘発することを示した。Tremblayらは、視覚経験の変化がシナプスとのミクログリア相互作用のモダリティを変化させることを発見した。一次視覚野(V1)の樹状突起脊椎代謝回転が両眼剥奪によって増加する臨界期には、暗順応はミクログリア突起の運動性を低下させ、シナプス間隙との接触頻度とミクログリア11の細胞封入体の数の両方を増加させます。これらの結果は、ミクログリアプロセスが神経活動とその周辺環境を感知し、神経回路をリモデリングすることを示唆しています。さらに、最近の研究では、覚醒状態と麻酔条件ではミクログリアサーベイランスが異なることが報告されており、生理的条件下でのニューロンとミクログリアのコミュニケーションを調べるために、覚醒マウスを用いた実験の重要性が示唆されています12。
in vivo二光子カルシウムイメージングは、生きている動物において、進行中のニューロン発火を反映したカルシウム動態を、数百のニューロンで同時に記録するための強力なツールである13,14,15。ニューロンにおけるカルシウムイメージングは、一般に、迅速なニューロン応答を追跡するために数Hz以上の時間分解能を必要とする16,17。対照的に、ミクログリアダイナミクスを追跡する以前の研究では、0.1Hz未満の比較的低い時間分解能でミクログリア構造をサンプリングしていました18,19,20。ある最近の研究では、ニューロンとミクログリアのコミュニケーションを理解するために同時2光子イメージングを適用しました21。しかし、覚醒マウスにおいて、動的なミクログリアプロセスが周囲の神経活動に数Hz以上の時間分解能でどのように応答するかはまだ不明です。この問題に対処するために、我々は、覚醒マウスにおいて、神経活動とミクログリアダイナミクスを1Hz以上の時間分解能でin vivoで同時に2光子イメージングする方法を記載しています。この手法により、覚醒マウスにおいて、より高いフレームレート(最大30Hz、画素フレームサイズ512×512画素)で安定したイメージングが可能となり、覚醒マウスにおけるミクログリアのサーベイランス行動や神経活動との相互作用を調べるためのより好ましい方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>10インチ液晶モニター</td><td>EIZO</td><td>DuraVision FDX1003</td><td>格子視覚刺激の提示用</td></tr><tr><td>26G ハミルトン シリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>27G 針</td><td>テルモ</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>AAV-hSyn-R-CAMP1.07</td><td>N/A</td><td>N/</td><td>A 松崎先生研究室よりご贈呈&nbsp;</td></tr><tr><td>活性炭粉末</td><td>Nacalai tesque</td><td>07909-65</td><td></td></tr><tr><td>黒色アルミホイル</td><td>THORLABS</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>CX3CR1-EGFPマウス</td><td>ジャクソン実験室</td><td>IMSR_JAX:005582内</td><td>因性<<>>Cx3cr1 locusの制御下で脳内のミクログリアでEGFPを発現するノックイン/ノックアウトマウスem/emlocus。</td></tr><tr><td>デントシリコーンV</td>(株) <td>松風</td>(株) <td>N/A</td><td>ヘッドプレートへの遮光装置の取り付け用</td></tr><tr><td>歯科用セメント(速性樹脂・液剤)</td><td>(株)松風</td>(株) <td>N/A</td><td>AB</td></tr><tr><td>歯科用セメント(速性樹脂・粉末)</td><td>(株)松布(</td><td>株) N/A</td><td>B カラー3</td></tr><tr><td>ドリル</td><td>東洋アソシエイツ</td><td>HP-200</td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細管ピペット</td><td>ドラモンド・サイエンティフィック(株</td>) <td>2-000-075</td><td></td></tr><tr><td>ガラスディスク(大)</td><td>松波</td><td>N/A</td><td>直径4mm、0.15&plusmn;厚さ0.02mmの</td></tr><tr><td>ガラスディスク(小)</td><td>松波</td><td>N / A</td><td>直径2mm、0.525&plusmn;厚さ0.075mm</td></tr><tr><td>ヘッドプレート</td><td>カスタマイズ</td><td>N/A</td><td>材質:SUS304、厚さ0.5mm、形状は図2B参照</td></tr><tr><td>止血繊維</td><td>Davol Inc</td><td>1010090</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ フィジーソフト</td><td></td><td>フリーソフト</td><td>データ登録用</td></tr><tr><td>瞬間接着剤(アロンα)</td><td>第一三共</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ファイザー</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>リドカイン</td><td>アストラゼネカ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 2017b</td><td>MathWorks</td><td>該当なし</td><td>データ登録・処理用</td></tr><tr><td>メロキシカム</td><td>東京化学工業</td><td>M1959</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>KD サイエンティフィック</td><td>KDS-100</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>多光子励起顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>N/A</td><td>商品名は「A1MP+」です。</td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>ニコン</td><td>N/A</td><td>市販名は「CFI75 アポクロマート 25xC W」。</td></tr><tr><td>パラフィンリキッド</td><td>ナカライ テスク</td><td>26132-35</td><td></td></tr><tr><td>Psychtoolbox</td><td></td><td>フリーソフト</td><td>グレーティング視覚刺激の提示</td></tr><tr><td>用 シェーディングデバイス</td><td>カスタマイズ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>脳定位固定装置</td><td>成重 科学機器</td><td>SR-611</td><td>手術用</td></tr><tr><td>脳定位固定装置</td><td>、カスタマイズ</td><td>N/A</td><td>2光子顕微鏡下でのマウス固定用</td></tr><tr><td>ストップコック</td><td>ISIS</td><td>VXB1079</td><td></td></tr><tr><td>サージカルシルク</td><td>エチコン</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>トレッドミル</td><td>カスタマイズ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>紫外線硬化剤</td><td>ノーランドプロダクツ社</td><td>NOA 65</td><td></td></tr><tr><td>気化器</td><td>ペンロン</td>シ<td>グマデルタ</td><td>麻酔器</td></tr></tbody></table>

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

脳機能は末梢組織由来の信号の影響下にあるため、脳内のグリア細胞が末梢の様々な生体状態を感知し、その信号を神経細胞に伝達する仕組みを解明することが重要です。脳内の免疫細胞であるミクログリアは、シナプスの発達と可塑性に関与しています。したがって、体内状態に応じた神経回路構築に対するミクログリアの寄与は、ミクログリア動態と神経活動との関係の生体内イメージングによって批判的に検証されるべきである。
ここでは、覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動を同時にイメージングする技術について述べる。赤色蛍光タンパク質の遺伝子コードカルシウム指標であるR-CaMPをコードするアデノ随伴ウイルスを、ミクログリアでEGFPを発現するCX3CR1-EGFPトランスジェニックマウスの一次視覚野の層2/3に注射した。ウイルス注入後、頭蓋窓を注入領域の脳表面に設置した。術後4週間の覚醒マウスにおける in vivo 二光子イメージングは、神経活動とミクログリアダイナミクスが秒未満の時間分解能で同時に記録できることを示しました。この手法は、ミクログリア動態と神経活動の間の協調を明らかにすることができ、前者は末梢免疫状態に応答し、後者は脳の内部状態をコード化します。

このプロトコルに記載されているように、8週齢のCX3XR1-EGFPトランスジェニックマウスのV1でAAV注射と頭蓋窓移植を実施しました。術後4週間で、V1の2/3層におけるR-CaMPベースの神経活動とミクログリアダイナミクスのin vivo2 光子イメージングを同時に行いました(図4 および ビデオ1)。イメージング中、マウスをトレッドミルに置き、自由に走らせた。画像は、25倍、1.1NA対物レンズとGaAsP PMTを使用して、0.25 μm/ピクセルの空間分解能で30 Hzのフレームレートで取得されました。EGFPとR-CaMPの両方を波長1,000 nmで励起し、EGFP蛍光(525/50 nm発光フィルター)とR-CaMP蛍光(593/46 nm発光フィルター)を同時に収集しました。モーションアーチファクトを最小限に抑えるために集録データを登録した後、バックグラウンドノイズを低減するために、4フレームごとに1つのフレームに平均化されました。格子視覚刺激をマウスに提示し、ニューロンと個々の樹状突起スパインの視覚応答を分析しました(図4D)。ミクログリアプロセスは速いダイナミクスを示し、10秒以内に形態が変化しました(図4Eおよび ビデオ1)。「ディスカッション」セクションで詳述されているように、AAV注入が失敗した場合、R-CaMPの発現を検出できませんでした。手術が成功しなかった場合、EGFPおよびR-CaMPのシグナルは観察できなかった。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64111/64111fig01.jpg"> 図1:AAVインジェクション 。 (A)ガラスピペットをシリコンチューブを用いて26Gハミルトンシリンジに接続した。(B)AAVインジェクションのセットアップ。(C)AAV溶液を、垂直軸から前方に60°傾けたガラスピペット を介して 注入した。(D)オープンスカルの手順の概略図(ステップ3.3に記載)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64111/64111fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64111/64111fig02v2.jpg"> 図2:頭蓋窓とヘッドプレート 。 (A)頭蓋窓移植の模式図。(B)カスタムメイドのヘッドプレートを使用しました。右半球でのイメージングでは、短い方のアームを右側に使用する必要があります。(C)頭蓋窓と埋め込まれた頭板を備えたマウスの背側図。(d)図 2Cに示す頭蓋窓の高倍率図。(E)カスタムメイドの定位固定装置で固定されたマウスの背側図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64111/64111fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64111/64111fig03.jpg"> 図3: in vivo 二光子イメージングのセットアップ。 (A)遮光装置の背側図。(B)遮光装置の側面図。(C)対物レンズの下のヘッドプレートにシェーディングデバイスを備えたマウスのビュー。マウスをトレッドミルに置きます。(D)2光子励起顕微鏡下での観察。視覚刺激を示すモニターが図の右側に配置されています。対物レンズは、モニターから対物レンズへの光を避けるために、遮光装置と黒いアルミホイルで覆われています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64111/64111fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64111/64111fig04.jpg"> 図4:樹状突起スパインにおけるミクログリアダイナミクスと視覚応答。 (A-C)12週齢のCX3XR1-EGFPトランスジェニックマウスにおけるV1の層2/3におけるEGFP(+)ミクログリアおよびR-CaMP(+)ニューロンの時間平均画像。各チャネルの信号強度は独立して正規化した。(D)樹状突起脊椎の視覚反応。黒い矢印の付いたストライプ図は、灰色の列で示されるタイミングで提示される格子刺激の方向を示す。カルシウムトレースでは、灰色の線は個々の反応を示し、黒い線はそれらの平均を示します。右の挿入図の黄色の矢印は、カルシウムトレースを取得するために関心領域(ROI)が生成された樹状突起スパインを示しています。(E)ミクログリア突起(シアンの矢じり)は10秒で急速な収縮を示した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64111/64111fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
動画1:神経活動とミクログリア動態の二光子イメージング。 12週齢のCX3XR1-EGFPトランスジェニックマウスにおけるV1の2/3層におけるEGFP(+)ミクログリアおよびR-CaMP(+)ニューロンのイメージングデータ。動画の左側では、マゼンタはニューロンのR-CaMPを示し、緑はミクログリアのEGFPを示します。動画の中央がEGFP信号に対応し、右側がR-CaMP信号に対応しています。各チャネルの信号強度は独立して正規化した。映画のフレームレートは実際のレートの40倍です。スケールバー = 10 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64111/220330CatMovieForJoVE_IntNormalized-2.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動を同時にイメージングするためのアデノ随伴ウイルス注入と頭蓋窓移植を組み合わせたプロトコルについて説明します。

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

私たちのプロトコルは、覚醒マウスにおけるミクログリアダイナミクスとニューロン活動の同時イメージングを可能にします。ミクログリアの監視行動やニューロンとの相互作用を調べるために広く応用できます。この方法の利点は、堅牢な頭部固定により、モーションアーチファクトが画像データを汚染しにくいことです。また、高フレームレートでのイメージング後の復元により、データからモーションアーチファクトを排除することができます。この方法では、AAV注射と頭蓋窓移植の手術は技術的に要求が厳しいです。最初は失敗がちなので、イライラしないでもっと練習してください。注入装置を準備するには、チューブを介して26ゲージのハミルトンシリンジに接続されたガラスピペットを定位固定装置のピペットホルダーに置きます。次に、ピペットホルダーを垂直軸から前方に60度傾けます。ガラスピペット、シリンジ、および接続チューブに流動パラフィンを満たし、シリンジをマイクロインジェクターに置きます。麻酔をかけたマウスに鎮痛剤を投与し、補助イヤーバーを取り付けます。次に、動物を背側を上にして脳定位固定装置に固定します。手術部位から脱毛し、手術部位を消毒した後、正中線に沿って頭皮を2センチの長さで切開し、右一次視覚野の上の頭蓋骨の露出を確保します。鉗子を使用して、露出した頭蓋骨の骨膜を取り除きます。正中線の横方向に3ミリメートル、ラムダ線の前方に5ミリリットルの定位固定装置座標に頭蓋骨をドリルで開けて、直径約0.5ミリメートルの小さな穴を作ります。次に、マウスの露出した頭蓋骨に約2センチメートル×2センチメートルの透明なフィルムを置きます。ピペッターを使用してフィルム上に1マイクロリットルのAAV溶液液滴を排出する。シリンジを進めます。そして、フィルム上のAAV溶液の液滴にガラスピペットチップを置き、シリンジをそっと引いてAAV溶液を吸引します。次に、頭蓋骨に作られた穴を通して、脳表面から500マイクロメートルの深さまでガラスピペットを挿入します。次いで、マイクロインジェクターを用いて、1時間あたり2マイクロリットルの注入体積流量で0.5マイクロリットルのAAV溶液を注入する。針を引き出し、生理食塩水で脳表面を洗い流します。穴を開けて頭蓋骨のマークに沿って円形の溝を作成します。破片をきれいにして頭蓋骨の視認性を確保し、掘削中の加熱を防ぐために生理食塩水を塗布します。中央の頭蓋骨を鉗子でそっと押します。穴あけ深さは、抵抗が少なく垂直に動けば十分です。溝が十分な深さに達したら、鉗子の先端を中央の頭蓋骨断片の底に挿入します。そっと持ち上げて取り外し、脳の表面を露出させます。27ゲージの針を使用して、露出した脳表面の端にある硬膜を刺して引き裂きます。硬膜の端に開けられた穴に鉗子の先端を挿入し、それを剥がして脳表面を露出させます。生理食塩水中に止血繊維を1本ずつ分散させた後、断続硬膜が存在する穴の縁に沿って止血繊維を配置する。露出した脳表面に頭蓋窓を置き、窓をそっと押しながら瞬間接着剤で頭蓋骨に接着します。その後、露出した頭蓋骨全体に瞬間接着剤を塗ります。次に、ヘッドプレートを頭蓋骨に注意深く取り付けて、ヘッドプレートの四角い穴の中央にある頭蓋窓を見つけます。接着剤が十分に硬化したら、露出した頭蓋骨に歯科用セメントを塗布して、ヘッドとヘッドブレードの間のアタッチメントを強化します。カスタムメイドのシェーディングデバイスと視覚刺激用のLCDモニターを取り付けるには、まずレンズを脳表面に焦点を合わせるように配置してから、このレンズの位置を元のZ位置として設定します。XY座標を一定に保ち、対物レンズを持ち上げます。マウスと脳定位固定装置を対物レンズから取り外します。シリコンを使用してヘッドプレートの上部に遮光装置を取り付け、ヘッドプレートと遮光装置の間のスペースがしっかりと密閉されていることを確認します。遮光装置に蒸留水を入れます。次に、対物レンズの下の定位固定装置フレームでマウスを固定します。脳表面の焦点面を慎重にリセットし、対物レンズの深さを確認します。対物レンズを黒いアルミホイルで覆い、LCDモニターからの光の汚染を防ぎます。10インチの液晶モニターをマウスの目の前に12.5センチメートルに設定して、視覚刺激を提示します。EGFPおよびR-CaMP用の蛍光提出収集フィルターと励起波長を1, 000ナノメートルに設定します。ピクセルあたり0.25ミクロンの空間分解能で画像を取得します。R-CaMP陽性ニューロンとEGFP陽性ミクログリアを同時にイメージングできるイメージング領域を見つけます。レイヤー2では、3。30ヘルツのフレームレートで画像を取得します。画像取得と同時に、0度から150度まで30度刻みで6方向、12方向に漂流格子視覚刺激をマウスに提示する。画像取得後、マウスを顕微鏡ステージから取り外します。シェーディングデバイスと定位固定装置をマウスから取り外し、マウスをホームケージに戻します。このプロトコルを使用して、8週齢のトランスジェニックマウスの一次視覚野でAAV注射と頭蓋窓移植を行い、続いてR-CaMPベースの神経活動と層2、3のミクログリアダイナミクスの2つの光子イメージングを行いました。格子視覚刺激をマウスに提示し、副生脊椎の視覚反応をカルシウムトレースを使用して分析しました。ミクログリア突起は速いダイナミクスを示し、10秒以内に形態を変化させた。12週齢のトランスジェニックマウスの一次視覚野の層2、3で2光子イメージングを使用して、R-CaMPがニューロンで観察され、ここではマゼンタで見られました。EGFPはミクログリアで観察され、緑色で見られました。EGFPおよびR-CaMPについても個々のシグナルが観察された。この方法では、AAVインジェクションの成功が重要です。AAV注入に失敗した主な理由は、時計ガラスピペットと組織の損傷です。ミクログリアの監視行動とSNAPのミクログリア相互作用は、アルツハイマー病などのさまざまな病原性メカニズムで一般的であることが確認されています。私たちの方法は、この分野に焦点を当てた研究に有益です。

simultaneous-imaging-microglial-dynamics-neuronal-activity-awake

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典: Maruoka, H., et.al. 覚醒マウスにおけるミクログリアダイナミクスとニューロン活動の同時イメージング J. Vis. Exp.

出典:Kamei, R., et al.、マウス海馬におけるミクログリアのIn vivo慢性二光子イメージング。J. Vis. 経験。(2022年)このビデオは、海馬CA1(Cornu ammonis 1)と歯状回におけるミクログリアダイナミクスのin...

マウス海馬におけるミクログリアダイナミクスのin vivo二光子イメージング

この方法では、マウスは顕微鏡イメージングや動物の頭をしっかり固定を必要とする単一セルの電気生理学的記録、中に移動し、探索するための具体的な、使い慣れた環境を作成します。...

フラットの床の空輸プラットフォーム：げっ歯類の移動自由アウェイクに顕微鏡または電気生理学と行動を組み合わせるための新しい方法

このビデオは、Thy1-GFPトランスジェニックラインのin vivo...

同時2光子<em&gt;インビボ</emマウス脳梁膨大後部皮質におけるシナプス入力とシナプス後ターゲットの&gt;イメージング

このプロトコルは、神経-神経膠血管構造の縦画像化、相互作用、および健康および疾患条件の両方における機能に使用できる慢性頭蓋窓移植技術を記述する。これは、多くの場合、好ましいが、いくつかの重大な制限を有する経頭蓋イメージングアプローチに対する補完的な代替手段として機能する。...

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

この記事では、注入カニューレを補ったカスタムメイドのイメージングウィンドウの準備と、マウスの海馬のCA1領域への移植を示す。...

マウスの振る舞いの海馬における神経活動を可視化するための頭蓋骨管制法

ここに提示されるのは、覚醒した頭部拘束マウスにおける脳細胞の縦方向イメージングのための慢性頭蓋窓の移植のためのプロトコルである。...

覚醒マウスにおける 反復生体内 イメージングのための頭蓋窓の移植

本稿では、精密制御手術と二光子顕微鏡を用いて、マウス海馬CA1の静止ミクログリアをin vivo...

インビボ マウス海馬におけるミクログリアの慢性二光子イメージング

マイクロプリズムレンズは、1光子顕微鏡と2光子顕微鏡の両方に対応したヘッドプレートと光学設計と一体化することで、頭部を固定した状態でのよく制御された実験や、自由に動く動物の自然な行動課題など、さまざまな条件下で垂直カラム内の神経応答を測定する上で大きな利点を発揮します。...

自由に動く動物と頭部固定動物におけるマイクロプリズムを用いた同定された神経集団の長期イメージング

本論文は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて網膜におけるミクリアの運動性とシナプス後点との接触を可視化・定量化する方法を示します。...

病変マウス網膜におけるミクログリアの動態およびシナプスとの相互作用のライブイメージングおよび特徴付け

学ぶAAV注入と頭蓋窓埋め込みを用いた覚醒マウスでのミクログリア動態と神経活動の同時イメージング手法。この方法により運動アーティファクトを最小化し、生理条件下での細胞間相互作用をリアルタイムに観察できます。

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

さらに動画を探す