Name: レンチウイルス媒介CRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたノックアウト筋細胞株の開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶレンチウイルス媒介CRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたノックアウト筋細胞株の開発手法。筋肉細胞における遺伝子機能解析や筋ジス関連遺伝子研究に応用でき、従来の動物モデルより迅速かつ低コストで実現可能です。

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この研究は、Association Française contre les myopathies(AFM-Téléthon)とAuvergne-Rhône Alpes Région(AURA)からの助成金によって資金提供されました。

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</ol>

著者らは、開示する利益相反はありません。

病態に関与する未知の機能の遺伝子の特性評価への道のりにおける主要なステップは、これらの遺伝子の機能を研究するための関連する細胞モデルの開発である。CRISPR/Cas9を用いた遺伝子編集の利用は指数関数的に成長している研究分野であり、ここで紹介するノックアウトモデルの開発は、その最も広く使用されているアプリケーションの1つです。この文脈において、我々はここで、関心のある任意の遺伝子におけるヒト細胞株ノックアウトを開発するための汎用性の高いプロトコルを提案し、関連するヒト細胞モデルにおけるこの遺伝子の特性評価を可能にする。ここで提示されたプロトコルは、iPSCだけでなく不死化筋芽細胞においても使用することができ、したがって、実質的に、目的の遺伝子における任意のヒト細胞モデルKOの産生をもたらし得る。
制限は、このプロトコルを不死化細胞に適用する必要があることであり、数週間の培養および細胞クローニングが多数の連続した増幅と共に必要とされる。あるいは、数週間または数ヶ月間増幅および維持することができる細胞を使用すべきである。この手順を用いて、目的の遺伝子(ここでは RYR1</e...

遺伝子シーケンシングの進歩や、特定の組織における機能未知の遺伝子の変異の同定に伴い、新たな標的遺伝子の機能を理解し、関連する病態生理学的機構への関与を確認するための関連細胞モデルの開発は不可欠なツールとなっています。さらに、これらのモデルは将来の治療開発にとって非常に重要であり1,2であり、実験における動物の使用を減らすための国際的な勧告と直線的にノックアウト動物モデルの開発に代わる興味深い代替手段を構成する。CRISPR/Cas9を用いた遺伝子編集は、現在利用可能な最も強力なツールの1つであり、多くのノックアウト/ノックインモデルの開発を可能にしており、CRISPR/Cas9を用いた標的遺伝子検証は、CRISPR/Cas93の最も広く使用されているアプリケーションの1つです。遺伝子編集の成功は、CRISPRツール(ガイドRNAおよびヌクレアーゼCas9)を標的細胞モデルに導入する能力にかかっており、筋肉細胞4などの多くのトランスフェクトが困難な細胞では課題になる可能性があります。この課題は、ウイルス、通常はレンチウイルスを使用することで克服することができ、これは効率的に多くの細胞型を形質導入し、その導入遺伝子を送達するという大きな利点を有する。しかし、その主な欠点は、宿主細胞ゲノムにおける導入遺伝子の組み込みであり、組み込み部位に局在する遺伝子の潜在的な変化および導入遺伝子の永久発現をもたらし、ヌクレアーゼCas9の場合、有害な結果をもたらすであろう5。Merienneら6は、Cas9遺伝子自体を標的とするガイドRNAを細胞に導入し、Cas9を不活性化させるスマートなソリューションを提案している。この戦略の適応は、トランスフェクトが困難な細胞内のほぼすべての遺伝子をノックアウトすることを可能にする、ユーザーフレンドリーで汎用性の高いプロトコルとしてここに提示されています。
ここで提示されたプロトコルの目的は、不死化筋肉細胞における目的遺伝子の不活性化を誘導することである。これは、異なるタイプの不死化細胞において、目的の任意の遺伝子をノックアウトするために使用することができる。ここで説明するプロトコルには、ガイドRNAとそのクローニングをレンチウイルスプラスミドに設計する手順、レンチウイルスベクターでCRISPRツールを製造する手順、異なるレンチウイルスで細胞を形質導入する手順、および細胞をクローニングして均質な編集細胞株を作製する手順が含まれています。
このプロトコールを用いて、細胞内カルシウム放出および筋肉収縮に関与する必須カルシウムチャネルである1型リアノジン受容体(RyR1)の欠失を伴う不死化ヒト骨格筋細胞が開発されている7。遺伝子のノックアウト(KO)は、ウェスタンブロットを用いたタンパク質レベルで、カルシウムイメージングを用いた機能レベルで確認されている。

<table><tbody><tr><td>抗CACNA1S抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA048892</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>Blp I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0585S</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>CalPhos Mammalian Transfection Kit</td><td>Takara</td><td>631312&nbsp;</td><td>トランスフェクションキット</td></tr><tr><td>Easy blot anti Mouse IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX221667-01</td><td>HRP secondary antibody</td></tr><tr><td>Easy blot anti Rabbit IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX221666</td><td>HRP secondary antibody</td></tr><tr><td>Fluo-4 direct</td><td>Molecular Probes</td><td>F10472</td><td>Calcium imaging</td></tr><tr><td>GAPDH(14C10) Rabbit mAb&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2118</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Fermentas</td><td>ER0501</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>InFusion HD Precision Plus</td><td>宝</td><td>638920</td><td>ライゲーションキット</td></tr><tr><td>MasterMix Phusion High Fidelity with GC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F532L</td><td>PCR反応用ミックス with High Fidelity Taq polymerase and dNTPs</td></tr><tr><td>Myosin Heavy Chain antibody</td><td>DHSB</td><td>MF20</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>REF&nbsp;</td><td>プラスミドの精製のための740424調製キット</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952</td><td>Kit for DNA extraction from cell</td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 Chemically Competent&nbsp;E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C737303</td><td>Chemically competent cells</td></tr><tr><td>Plasmid #87904</td><td>Addgene</td><td>87904</td><td>SpCas9をコードするレンチウイルスプラスミド(LV-Cas9用)</td></tr><tr><td>プラスミド#87919</td><td>Addgene</td><td>87919</td>ガイド<td>付きカセット挿入用レンチウイルスバックボーン(LVガイドターゲット用)</td></tr><tr><td>プラスミド#12260</td><td>Addgene</td><td>12260</td>レンチ<td>ウイルスプラスミドコードレンチウイルス包装GAG POL</td></tr><tr><td>プラスミド#8454</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>レンチウイルスおよびMuLVレトロウイルス粒子を産生するためのエンベロープタンパク質をコードするレンチウイルスプラスミド</td></tr><tr><td>V5タグモノクローナル抗体</td><td>Invitrogene</td><td>R96025&nbsp;</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>XL10-Gold Ultracompetent Cells</td><td>Agilent</td><td>200317</td><td>Chemically competent cells</td></tr><tr><td>Xma I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0180S</td><td>Restriction enzyme</td></tr></tbody></table>

レンチウイルス媒介crispr/cas9遺伝子編集を用いたノックアウト筋細胞株の開発

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

クラスター化調節間隔短い回文反復(CRISPR)/Cas 9の重要な用途の1つは、特に遺伝子診断中に同定された疾患に関連する新しい遺伝子/タンパク質の機能を研究するためのノックアウト細胞株の開発である。このような細胞株の開発のためには、選択された細胞へのCRISPRツール(Cas9およびガイドRNA)の高効率の挿入、および選択された遺伝子の特異的欠失に対するCas9活性の制限の2つの主要な課題を解きほぐさなければならない。ここで説明するプロトコルは、筋肉細胞などのトランスフェクトが困難な細胞にCRISPRツールを挿入することに専念しています。このプロトコールは、一般に入手可能なプラスミドで産生されるレンチウイルスの使用に基づいており、すべてのクローニングステップが目的の遺伝子を標的とするために説明されています。Cas9活性の制御は、Cas9を標的とするガイドRNAをコードするレンチウイルスによる細胞の形質導入がCas9発現の漸進的廃止を可能にするKamiCas9と呼ばれる前述のシステムの適応を用いて行われている。このプロトコルは、筋肉細胞内カルシウム放出および励起収縮結合に関与するこの重要なカルシウムチャネルのノックアウトを確認するために、タンパク質および機能レベルでさらに特徴付けられた RYR1ノックアウトヒト筋細胞株の開発に適用されている。ここで説明する手順は、筋肉細胞または他のトランスフェクトが困難な細胞内の他の遺伝子に容易に適用することができ、ヒト細胞におけるこれらの遺伝子を研究するための貴重なツールを生成することができる。

このプロトコールは、RyR1タンパク質をコードするRYR1遺伝子をノックアウトするために、RyR1が以前に特徴付けられていた健常者15由来の不死化筋芽細胞15(いわゆるHM細胞、ヒト筋芽細胞用)に適用された。ガイドRNAの設計は、遺伝子のエクソン101およびイントロン101の一部を包含する配列を削除するためになされた。エクソン101の一部の欠失は、リーディングフレームの破壊をもたらすことが予測される。加えて、エクソン101はタンパク質の細孔をコードしており、したがって機能的なカルシウムチャネルを生成するために必要とされる。重篤なRyR1関連ミオパチーに罹患した多くの患者は、遺伝子7のこの領域に変異を有する。CRISPORソフトウェアで予測された最良のガイドは、最高の効率を維持しながら、できるだけオフターゲットを持たないように選択されました。我々は、細胞の大部分がノックアウトされることを確認し、PCRを使用して編集されたクローンにおける欠失の検出を容易にするために、同じウイルスベ...

このプロトコルは、ガイドRNAの設計からノックアウトクローンの細胞クローニングおよび特性評価まで、CRISPR/Cas9を使用してノックアウト筋芽細胞を生成する方法を説明しています。

レンチウイルス媒介CRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたノックアウト筋細胞株の開発

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

このプロトコールは、筋肉におけるこの遺伝子の機能をさらに研究するために、任意の遺伝子における筋細胞ノックアウトの開発を可能にする。利点は、遺伝子を研究するためのノックアウト動物の開発よりも安価で速いことです。この技術は、例えば、ミオパチーにおける新たに同定された遺伝子の関与を研究するために使用することができる。ここで説明した技術をiPS細胞に応用すれば、あらゆるタイプの細胞の任意の遺伝子に対するノックアウト細胞の開発につながる可能性がある。間隔をあけた短い回文反復またはCRISPR媒介遺伝子欠失の規則的なクラスター化を開始するには、まずensemblのようなゲノムブラウザツールを使用する。org を使用して、標的遺伝子とその両側の DNA 配列を識別します。遺伝子エクソンのリストを取得するには、まずタンパク質コード配列の転写産物をクリックし、次にエクソンをクリックします。次に、[配列のダウンロード]をクリックし、ゲノム配列のみを選択して、遺伝子全体の完全なコンセンサス配列をダウンロードします。遺伝子のエクソンとイントロンのリストをスクロールして、標的のものを選択します。ガイドRNAを設計するために、まず標的配列のすぐ上流および下流のイントロンの塩基配列を選択する。次に、crispr.teforなどのWebサイトにアクセスします。選択した配列を正味で使用して、数百塩基対で区切られたプロトスペーサー隣接モチーフなしでそれぞれ20ヌクレオチド長の2つのガイドRNAを設計します。次に、各ガイドRNAの逆相補配列を決定し、プライマーを順序付ける。プラスミドクローニング用のガイドRNAカセットを構築するには、まず本文に記載のレシピとプログラムを使用して1組のプライマーでPCRを実行し、次にトリスホウ酸-EDTAバッファーを使用してPCR産物を1%アガロースゲルで分離します。次に300塩基対断片を切除し、キットを用いて精製する。同様に、他のプライマーセットで別のPCRを実行した後、400塩基対の長さのDNA断片を20マイクロリットルの溶出バッファーに精製する。ガイドRNAカセットをレンチウイルスプラスミド骨格に挿入するには、まず、本文に記載されるように、プラスミドと制限酵素Xma1およびBlp1との二重消化反応をセットアップする。反応管を摂氏37度で1時間インキュベートした後、65°Cで20分間インキュベートし、消化産物を1%アガロースゲル中で泳動させ、適当なキットを用いて約10キロ塩基対のプラスミドを精製する。また、光学濃度を測定することにより精製物を定量する。ガイドRNAカセットをプラスミドと連結するには、精製したガイドRNA、直鎖状化したプラスミドDNA、酵素、および水との反応混合物を最終容量10マイクロリットルに調製し、次いで反応管を摂氏50度で15分間インキュベートして、pGuideと呼ばれる最終プラスミドを生成する。レンチウイルス産生のために、まず、10%FBSおよび1%ペニシリンまたはストレプトマイシンを添加した高グルコースおよびピルビン酸を含むDMEM中の100万HEK 293細胞を含む145センチメートルプレートを播種する。その後、細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターで3日間増殖させます。4日目に細胞をチェックして、60〜65%のコンフルエンシーを確認します。次に、目的のプラスミド、ウイルスエンベロープをコードするプラスミド、レンチウイルスパッケージングプラスミドpsPAX2、およびリン酸カルシウムからなるトランスフェクション溶液を調製する。水で最終容量を1000マイクロリットルに調整します。次いで、トランスフェクション溶液を攪拌下で1ミリリットルの2X HBSに滴下し、室温で少なくとも10分間インキュベートする。その後、溶液を細胞に滴下する。トランスフェクション溶液を均質に分配するには、プレートを全方向に静かに傾け、次に細胞を摂氏 37 度で 5% の二酸化炭素インキュベーターで少なくとも 5 時間インキュベートします。次に、プレートから培地を取り出し、PBSで細胞を洗浄してトランスフェクション試薬を取り除き、12ミリリットルの新鮮な培地を加えます。摂氏37度で48時間のインキュベーション後、すべてのプレートからチューブに培地をプールします。チューブを密閉バケットに入れ、800倍Gで4°Cで5分間遠心分離し、次いで0.45マイクロメートルフィルターを用いて上清を濾過し、濾液を68、300倍Gで4°Cで2時間遠心分離し、スイングバケットローターを用いて。上澄み液を除去した後、ペレットから液体を最大限除去するために、安全キャビネット内のペーパータオルの上でチューブを逆さまにして5〜10分間保持する。100マイクロリットルのHEC増殖培地を加え、チューブを摂氏4度に少なくとも2時間保持する。次いで、ピペッティングによってペレットを再懸濁する。再懸濁したペレットをすべて回収した後、10または25マイクロリットルのアリコートを作り、液体水素で急凍結した後、マイナス80°Cでアリコートを保管します。筋芽細胞形質導入のために、まず、96ウェルプレートの各ウェルを、10,000個の筋芽細胞を含む100マイクロリットルの増殖培地で播種する。翌日、事前に計算されたLVガイドとLV Cas9を安全キャビネット内のセルに追加します。5日間のインキュベーション後、トリプシンを加えてウェルから細胞を放出する。細胞数を数えた後、40〜50%のコンフルエンシーを有するウェルから新しいプレートに細胞を移す。5時間のインキュベーションの後、計算された量のLVキラーを20の感染の多重度で加え、5〜10日間、またはその間に少なくとも2つの継代でインキュベートする。カルシウムイメージングによる遺伝子編集クローンの機能的特徴付けのために、ラミニンコーティングされた35ミリメートルディッシュの中央に50,000個の細胞をプレートする。分化を誘導するには、本文中に記載した分化培地を添加する。6日間のインキュベーション後、培養液を取り出し、疎水性ペンで細胞を描写する。次いで、分化培地で1対1に希釈した50マイクロリットルのFluo-4 Directを、分化した筋管に加える。ディッシュを摂氏37度で30分間インキュベートした後、グルコース1ミリリットルあたり1ミリグラムを添加したクレブス緩衝液で細胞を2回洗浄する。次に、倒立蛍光顕微鏡または10倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用して、1秒あたり1フレームの速度で90秒間蛍光変動を測定し、少なくとも10個の筋管を有するフィールドを選択する。追加のKrebs緩衝液を除去した後、膜脱分極のために2ミリリットルの塩化カリウムまたは2ミリリットルのフロロクロラールメタクレゾールまたは4cmCまたはRyR1直接刺激で細胞を刺激する。刺激後の蛍光変動を可視化し、次いで各筋管における蛍光変動を定量化する。このプロトコルは、ヒト筋芽細胞から遺伝子RyR1をノックアウトするために首尾よく使用することができ、その結果、細胞内のゲノムDNAが短くなった。RyR1ノックアウトは、ウエスタンブロッティングにより標的細胞ではRyR1タンパク質が検出できなかったため、タンパク質レベルでも確認された。RyR1ノックアウト細胞から分化した筋管におけるRyR1活性の不在を、4cmCによる直接RyR1刺激または塩化カリウム誘導膜脱分極による間接刺激後のFluo-4カルシウムイメージングによってさらに検証した。削除される配列は、機能性タンパク質の予測に必要であるべきである。この技術は、筋肉疾患における新しい遺伝子の関与を研究するためのポストゲノムツールの開発に理想的である。

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Genetics

遺伝学

CRISPR / Cas9システムは、科学界にターゲットを絞ったゲノム編集がアクセス可能で、手頃な価格にする可能性を提供しています。このプロトコルは、CRISPR / Cas9システムを使用して、目的の遺伝子をノックアウトしてから、成体マウスの脳に定位的にそれらを注入するウイルスを作成する方法を実証することを意図しています。...

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CRISPR関連のプロトコルがますます有用で利用しやすくなるにつれて、特定の実験条件下では依然として合併症や障害が発生する可能性があります。このプロトコールでは、CRISPR/Cas9を使用した受容体相互作用セリン/スレオニン-プロテインキナーゼ1(RIPK1/RIP1)ノックアウトヒト細胞株の作製を概説し、このプロセスで遭遇する可能性のある課題を強調しています。...

CRISPR-Cas9システムを用いた RIP1 ノックアウトU937細胞株の作製

提示された方法は、高効率のレンチウイルス媒介遺伝子送達システムを使用して、L2HGDH遺伝子を標的とするsgRNAを安定的に発現するヒト胚性幹細胞(hESC)株H9におけるCRISPR媒介遺伝子ノックアウトの生成を説明するものです。...

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

THP-1細胞株は、さまざまな生物学関連研究領域において、ヒト単球/マクロファージの機能を調べるためのモデルとして広く使用されています。この記事では、効率的なCRISPR-Cas9ベースのエンジニアリングとシングルセルクローン単離のためのプロトコルについて説明し、堅牢で再現性のある表現型データの生成を可能にします。...

エレクトロポレーションに基づくTHP-1細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子ノックアウトとシングルセルクローン単離

Toxoplasma gondiiの薬剤耐性遺伝子を同定するために全ゲノム配列ベースの遺伝地図を用いたQTLマッピングをどのように使用することができるか、そしてこれがどのようにしてゲノム標的を効率的に編集するCRISPR / Cas9システム薬剤耐性遺伝子。...

QTLマッピングとCRISPR / Cas9編集による薬剤耐性遺伝子同定<em&gt; Toxoplasma gondii</em

学ぶレンチウイルス媒介CRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたノックアウト筋細胞株の開発手法。筋肉細胞における遺伝子機能解析や筋ジス関連遺伝子研究に応用でき、従来の動物モデルより迅速かつ低コストで実現可能です。

レンチウイルス媒介CRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたノックアウト筋細胞株の開発

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