Name: 細胞輸送の陽電子放出断層撮影イメージング:細胞放射性標識法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学ぶジルコニウム89-DBNを用いた細胞放射性標識法とPETイメージングによる非侵襲的追跡技術。神経疾患やがんの細胞治療薬動態研究に有用で、7日間の安定した細胞追跡が可能です。

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この研究は、NIH 5R21HL127389-02、NIH 4T32HL007111-39、NIH R01HL134664、およびDOE DE-SC0008947助成金、国際原子力機関(ウィーン)、メイヨークリニック核医学部門、放射線科、およびメイヨークリニック再生医療センター(ミネソタ州ロチェスター)の支援を受けました。すべてのフィギュアは BioRender.com を使用して作成されました。

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<li>Pandey, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+solid+target+design+for+the+production+of+89Zr+and+radiosynthesis+of+high+molar+activity+%5B89Zr%5DZr-DBN%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">A new solid target design for the production of 89Zr and radiosynthesis of high molar activity [89Zr]Zr-DBN.</a> American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 12 (1), 15-24 (2022).</li>
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<li>Bansal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+89Zr+cell+labeling+approach+for+PET-based+cell+trafficking+studies%5BTitle%5D)+AND+%22EJNMMI+Research%22%5BJournal%5D)">Novel 89Zr cell labeling approach for PET-based cell trafficking studies.</a> EJNMMI Research. 5, 19(2015).</li>
<li>Bansal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((89Zr%5DZr-DBN+labeled+cardiopoietic+stem+cells+proficient+for+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">89Zr]Zr-DBN labeled cardiopoietic stem cells proficient for heart failure.</a> Nuclear Medicine and Biology. 90-91, 23-30 (2020).</li>
<li>Friberger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+the+synthesis+and+cell+labelling+conditions+for+%5B89Zr%5DZr-oxine+and+%5B89Zr%5DZr-DFO-NCS%3A+a+direct+in+vitro+comparison+in+cell+types+with+distinct+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimisation of the synthesis and cell labelling conditions for [89Zr]Zr-oxine and [89Zr]Zr-DFO-NCS: a direct in vitro comparison in cell types with distinct therapeutic applications.</a> Molecular Imaging and Biology. 23 (6), 952-962 (2021).</li>
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<li>Nicolas, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+spheroids+as+an+alternative+to+single+cells+for+transplantation+after+ex+vivo+gene+therapy+in+mice+and+pig+models%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte spheroids as an alternative to single cells for transplantation after ex vivo gene therapy in mice and pig models.</a> Surgery. 164 (3), 473-481 (2018).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+and+therapeutic+value+of+human+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+in+reducing+venous+neointimal+hyperplasia+associated+with+arteriovenous+fistula%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Tracking and therapeutic value of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell transplantation in reducing venous neointimal hyperplasia associated with arteriovenous fistula.</a> Radiology. 279 (2), 513-522 (2016).</li>
<li>Nicolas, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+cell+therapy+by+ectopic+hepatocyte+transplantation+treats+the+porcine+tyrosinemia+model+of+acute+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Ex vivo cell therapy by ectopic hepatocyte transplantation treats the porcine tyrosinemia model of acute liver failure.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 738-750 (2020).</li>
<li>Bansal, A., Sharma, S., Klasen, B., Rosch, F., Pandey, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+89Zr-labeled+synthons+for+direct+labeling+and+tracking+of+white+blood+cells+and+stem+cells+in+healthy+athymic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different 89Zr-labeled synthons for direct labeling and tracking of white blood cells and stem cells in healthy athymic mice.</a> Scientific Reports. 12 (1), 15646(2022).</li>
<li>Behfar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+cardiopoiesis+enhances+therapeutic+benefit+of+bone+marrow+human+mesenchymal+stem+cells+in+chronic+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Guided cardiopoiesis enhances therapeutic benefit of bone marrow human mesenchymal stem cells in chronic myocardial infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 56 (9), 721-734 (2010).</li>
<li>Charoenphun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((89Zr%5Doxinate4+for+long-term+in+vivo+cell+tracking+by+positron+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">89Zr]oxinate4 for long-term in vivo cell tracking by positron emission tomography.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 42 (2), 278-287 (2015).</li>
<li>Sato, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+adoptively+transferred+natural+killer+cells+in+rhesus+macaques+using+89zirconium-oxine+cell+labeling+and+PET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of adoptively transferred natural killer cells in rhesus macaques using 89zirconium-oxine cell labeling and PET imaging.</a> Clinical Cancer Research. 26 (11), 2573-2581 (2020).</li>
<li>Volpe, A., Pillarsetty, N. V. K., Lewis, J. S., Ponomarev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+nuclear-based+imaging+in+gene+and+cell+therapy%3A+probe+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Applications of nuclear-based imaging in gene and cell therapy: probe considerations.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 20, 447-458 (2021).</li>
<li>Fogli, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+next+steps+in+the+advancement+of+immunotherapy%3A+summary+of+the+2018+and+2020+National+Cancer+Institute+workshops+on+cell-based+immunotherapy+for+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Challenges and next steps in the advancement of immunotherapy: summary of the 2018 and 2020 National Cancer Institute workshops on cell-based immunotherapy for solid tumors.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e003048(2021).</li>
<li>Li, X., Hacker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+stem+cell-based+therapies+of+cardiac+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in stem cell-based therapies of cardiac diseases.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 71-88 (2017).</li>
<li>Puges, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+study+comparing+WBC+scan+and+18F-FDG+PET%2FCT+in+patients+with+suspected+prosthetic+vascular+graft+infection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Vascular+and+Endovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Retrospective study comparing WBC scan and 18F-FDG PET/CT in patients with suspected prosthetic vascular graft infection.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 57 (6), 876-884 (2019).</li>
<li>Butterfield, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+in+cancer+immunotherapy+clinical+trials%3A+are+we+making+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells in cancer immunotherapy clinical trials: are we making progress.</a> Frontiers in Immunology. 4, 454(2013).</li>
<li>de Vries, I. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+tracking+of+dendritic+cells+in+melanoma+patients+for+monitoring+of+cellular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy.</a> Nature Biotechnology. 23 (11), 1407-1413 (2005).</li>
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著者は金銭的な競合利害関係を有していないが、この技術の発明者である(特許#US20210330823A1)。

以下は、効果的な細胞放射性標識のために最適化が必要なプロトコルの重要なステップです。プロトコルステップ 1.2 および 1.3 では、使用する [89 Zr]Zr(HPO 4)2 または [89Zr]ZrCl4 の容量に応じて、適切な容量 (マイクロリットル) の塩基を使用する必要があります。1.0 M K 2 CO 3溶液を[89Zr]Zr(HPO 4)2の中和に使用し、[1.0 M Na 2CO 33 溶液を [89Zr]ZrCl4の中和に使用して、pH 7.5〜8.0 を達成する必要があります。ステップ2.1では、細胞放射性標識効率を高めるために、[89Zr]ZrCl4から調製する場合、K2HPO4/KH2PO4およびHEPESを含む細胞適合性混合物を[...

幹細胞およびキメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は人気が高まっており、心筋不全1,2、網膜変性2、黄斑変性2、糖尿病2、心筋梗塞3,4,5、癌6,7,8,9などのさまざまな疾患の治療のために活発に研究されています。10.幹細胞療法の2つの妥当なアプローチのうち、幹細胞は疾患部位に直接生着して治療反応を引き起こすか、疾患部位に付着せずに疾患部位の微小環境に変化を引き起こして間接的な治療反応を開始することができます。間接的な治療反応は、疾患を修復または治療する因子を放出することにより、疾患部位の微小環境の変化を引き起こす可能性があります5。幹細胞治療のこれらのアプローチは、放射性標識幹細胞の非侵襲的イメージングによって評価できます。非侵襲的イメージングは、疾患部位上の放射性標識細胞の取り込みを治療反応と相関させて、直接的および間接的な治療的反応を解読することができます。
さらに、CAR-T細胞6,7,8,9,10および樹状細胞免疫療法11,12を使用して、さまざまな癌を治療するための免疫細胞ベースの治療法が開発されています。機構的には、CAR-T細胞免疫療法6,7,8,9,10では、T細胞は、治療が必要な腫瘍上の特定の抗原に結合するエピトープを発現するように操作されます。これらの改変されたCAR-T細胞は、投与されると、エピトープ-抗原相互作用を介して腫瘍細胞上に存在する特異的抗原に結合します。結合後、結合したCAR-T細胞は活性化を受け、増殖してサイトカインを放出し、宿主の免疫系に特定の抗原を発現する腫瘍を攻撃するように信号を送ります。対照的に、樹状細胞療法11,12の場合、樹状細胞は、その表面に特異的な癌抗原を提示するように操作される。これらの操作された樹状細胞は、投与されると、リンパ節に宿り、リンパ節のT細胞に結合します。T細胞は、投与された樹状細胞上の特定のがん抗原に結合すると、活性化/増殖を受け、その特定の抗原を発現する腫瘍に対する宿主の免疫応答を開始します。したがって、投与されたCAR-T細胞の腫瘍部位への輸送9,10およびリンパ節11,12への樹状細胞のホーミングの評価は、免疫療法の有効性を決定するために放射性標識CAR-T細胞および樹状細胞をイメージングすることによって可能である。さらに、非侵襲的細胞輸送は、治療の可能性をよりよく理解し、直接的および間接的な治療反応を明確にし、幹細胞および免疫細胞ベースの治療の両方の治療反応を予測および監視するのに役立ちます。
細胞輸送のためのさまざまなイメージングモダリティが検討されています3,4,9,10,12、これには、光イメージング、磁気共鳴画像法(MRI)、単一光子放出型コンピュータ断層撮影法(SPECT)、陽電子放射断層撮影法(PET)が含まれます。これらの手法には、それぞれ長所と短所があります。これらの中でも、PETは、その定量性と高感度により、最も有望なモダリティであり、イメージングベースの細胞輸送における細胞の信頼性の高い定量に不可欠です3,4,9,10。
半減期が78.4時間の陽電子放出放射性同位体89Zrは、細胞標識に適しています。1週間以上の細胞輸送のPETイメージングが可能で、広く入手可能な低エネルギー医療用サイクロトロン13,14,15,16,17で容易に製造できます。さらに、適切に官能基化されたp-イソチオシアナトベンジル-デスフェリオキサミン(DFO-Bn-NCS)キレート剤は、89 Zr標識、すぐに使用できる、細胞標識シントン、[89Zr]Zr-p-イソチオシアナトベンジル-デスフェリオキサミン([89Zr]Zr-DBN18,19,20,21,22,23,24としても知られる)の合成のために市販されている、25。[89 Zr]Zr-DBNを介した細胞標識の原理は、細胞膜タンパク質の第一級アミンと[89Zr]Zr-DBNのイソチオシアネート(NCS)部分との反応に基づいており、安定な共有結合チオ尿素結合を生成します。
[89ZR]幹細胞18,23,25、樹状細胞18、心形成幹細胞19、脱落間質細胞20、骨髄由来マクロファージ20、末梢血単核細胞20、Jurkat/CAR-T細胞21、肝細胞22,24、白血球25など、さまざまな細胞を追跡するために、Zr-DBNベースの細胞標識とイメージングが発表されています.次のプロトコルは[89Zr] Zr-DBNの調製そしてセルradiolabelingのステップバイステップ方法を提供し、特定のセルタイプのためのradiolabelingプロトコルで要求されるかもしれない変更を記述する。より明確にするために、ここで紹介する細胞放射性標識の方法は4つのセクションに分かれています。最初のセクションでは、DFO-Bn-NCSで89 Zrをキレート化することにより、[89Zr]Zr-DBNを調製します。第2章では、細胞放射性標識に容易に使用できる[89Zr]Zr-DBNの生体適合性製剤の調製について説明します。第3章では、放射性標識のための細胞のプレコンディショニングに必要なステップについて説明します。細胞のプレコンディショニングには、タンパク質を含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)およびHEPES緩衝ハンクス平衡塩溶液(H-HBSS)で細胞を洗浄し、放射性標識中に細胞表面タンパク質に存在する第一級アミンと[89Zr]Zr-DBNの反応を妨害または競合する可能性のある外部タンパク質を除去することが含まれます。最後のセクションでは、細胞の実際の放射性標識と品質管理分析に関連するステップについて説明します。

<table><tbody><tr><td>アセトニトリル</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA</td><td>12571063</td><td></td></tr><tr><td>陰イオン交換カラム</td><td>Macherey-Nagel, Inc., D&uuml;ren, ドイツ</td><td>731876</td><td>Chromafix 30-PS-HCO3&nbsp;SPE 45 mg カートリッジ</td></tr><tr><td>コニカル遠心分離チューブ (15 mL)</td><td>Corning Inc., Glendale, AZ, USA</td><td>352096</td><td>Falcon 15 mL 高透明度ポリプロピレン (PP) コニカル遠心チューブ</td></tr><tr><td>樹状細胞</td><td>The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA</td><td>CRL-11904</td><td></td></tr><tr><td>DFO-Bn-NCS</td><td>Macrocyclics, Inc., Plano, TX, US</td><td>B-705</td><td>p-SCN-Bn-Deferoxamine</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Dose calibrator</td><td>Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA</td><td>5130-3234</td><td>CRC -55tR Dose Calibrator&nbsp;</td></tr><tr><td>ダルベッコ修正されたイーグル」s ミディアム&nbsp;</td><td>The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA</td><td>14025092</td><td>H-HBSS</td></tr><tr><td>塩酸(微量金属ベースグレード)</td>の調製用<td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA,USA</td><td>A508P212</td><td></td></tr><tr><td>Melanoma cells</td><td>The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>30108442</td><td>Protein LoBind microcentrifuge tube</td></tr><tr><td>Murine GM-CSF</td><td>R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA</td><td>415-ML-010</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ and Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA</td><td>10010023</td><td>For washing cells</td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>Covidien LLC, Mansfield, MA, USA</td><td>1020</td><td>0.9%滅菌生理食塩水</td></tr><tr><td>シェーカー&nbsp;</td><td>エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ</td><td>T1317</td><td>サーモミキサー</td></tr><tr><td>シリカゲル-rad-TLC紙シート&nbsp;</td><td>Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA</td><td>SGI0001</td><td>iTLC-SG</td></tr></tbody></table>

細胞輸送の陽電子放出断層撮影イメージング:細胞放射性標識法

Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling

幹細胞およびキメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、臓器再生の有望な治療法として、またさまざまながんの免疫療法として浮上しています。これらの分野では大きな進歩が見られましたが、生体系で投与された治療細胞の薬物動態と薬力学をよりよく理解するためには、さらに多くのことを学ぶ必要があります。陽電子放射断層撮影法(PET)による細胞の非侵襲的in vivo追跡のために、89 Zr(t1/2 78.4 h)を利用して、新しい[89Zr]Zr-p-イソチオシアナトベンジル-デスフェリオキサミン([89Zr]Zr-DBN)を介した細胞放射性標識法が開発されました。現在のプロトコルは間葉系幹細胞、血統導かれた心poietic幹細胞、肝細胞、白血球、メラノーマの細胞および樹状細胞を再生するレバーを含むいろいろなセルの直接radiolabelingのための[89Zr] ZrDBN仲介された、すぐに使用できる、radiolabelingシントンを記述する。開発された方法論は、放射性標識細胞の性質や機能に影響を与えることなく、投与後最大7日間、細胞輸送の非侵襲的PETイメージングを可能にします。さらに、このプロトコルは[89Zr] Zr-DBN、[89 Zr] Zr-DBNのbiocompatible公式、radiolabelingのためのセルの準備、および最終的にセルの巧妙なradiolabelingに必要なすべての複雑な細部を含む[89Zr] ZrDBNのセルのradiolabelingのための段階的な方法を、記述する。

この原稿で提示された代表的な結果は、以前の[89Zr]Zr-DBN合成および細胞放射性標識研究18、19、22、23、24、25から編集されました。簡単に言うと、7.5-15 μgのDFO-Bn-NCSを用いて、25-37°Cで~30-60分で89ZrとDFO-Bn-NCSとの複合体形成に成功します(表2)。細胞放射性標識効率は、洗浄後の放射性標識細胞ペレットに観察される未補正収率として20〜50%から変化する(表1)。18,19,22,23,24,25(表1)。</...

ここに示されるすぐに使用できるradiolabelingシントンを使用して陽電子放出断層撮影(ペット)の放射性同位体、 89Zr (t1/2 78.4 h)の放射性分類のセルにプロトコルはある、[89Zr] Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr] Zr-DBN)。[89Zr]Zr-DBNを用いた放射性標識細胞は、投与後最大7日間、PETで体内に投与された放射性標識細胞の非侵襲的な追跡とイメージングを可能にします。

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for ...

このプロトコルはペットによってセルおよびジルコニウム89-DBNおよび非侵襲的な追跡のradiolabelingのための段階的な方法を記述する。また、この技術は、細胞表面タンパク質の主要な手段にジルコニウム-89-DBNを共有結合させることにより、細胞を放射性標識するための信頼性が高く安定した方法を提供します。神経疾患やさまざまながんの細胞療法に携わる医師や科学者は、このプロトコルが、非侵襲的PETイメージングによる細胞ベースの治療の薬物動態を理解するのに役立つことに気付くでしょう。詳細なプロトコルは、この放射性標識技術を学び、採用するためのガイダンスを新規ユーザーに提供します。重要な手順に含まれる追加のノードは、新しいユーザーの問題のトラブルシューティングに役立ちます。まず、約100ミリグラムのヒドロキサメート樹脂を含むカラムを調製し、8ミリリットルの純粋な無水アセトニトリルでカラムを洗浄した後、5〜6ミリリットルの空気でフラッシュして活性化します。2ミリリットルの0.5ノルマル塩酸をカラムに通します。5〜6ミリリットルの空気をさらに洗浄した後、ジルコニウム-89と天然イットリウムの両方を含む溶液をヒドロキサメート樹脂にゆっくりとロードします。ヒドロキサメート樹脂から結合していない天然イットリウムを20ミリリットルの2つの通常の塩酸で洗浄し、続いて10ミリリットルの脱イオン水で洗浄します。リン酸ジルコニウム-89水素の形態のジルコニウムを除去するには、0.5ミリリットルの1.2モルリン酸二カリウムリン酸カリウムリン酸二水素カリウム緩衝液をカラムに添加し、カラム上に30分間放置します。さらに 1.5 ミリリットルの 1.2 モルバッファーを添加して、カラムからジルコニウムを溶出します。次に、緩衝液に配合された約120マイクロリットルのリン酸ジルコニウム-89水素を取り、HEPES-KOHと炭酸カリウムで溶液を中和してpH7.528にします。新たに調製した5ミリモルのDFO-Bn-NCSを4マイクロリットル、中和したリン酸ジルコニウム-89水素約285マイクロリットルに加えます。そして、ピペッティングで溶液を混合します。イットリウムからジルコニウムを単離した後、0.5ミリリットルの1モルシュウ酸をカラムに加え、カラム上に1分間置いて、ジルコニウム-89シュウ酸の形でジルコニウムを溶出させます。さらに2.5ミリリットルの1モルシュウ酸をカラムに加えます。シュウ酸ジルコニウム89を塩化ジルコニウム89に変換するには、陰イオン交換カラムを6ミリリットルのアセトニトリルで洗浄し、続いて5〜6ミリリットルの空気でフラッシュします。次に、カラムを10ミリリットルの生理食塩水で洗浄し、続いてもう一度空気を洗い流します。シュウ酸ジルコニウム-89を含む溶液を活性化陰イオン交換カラムにゆっくりとロードしてから、空気で再洗浄します。次に、カラムを50ミリリットルの脱イオン水で洗浄し、結合していないシュウ酸イオンを除去します。塩化ジルコニウム-89の形態のジルコニウムを逃がすには、0.1ミリリットルのノルマル塩酸をカラムに添加し、カラム上に1分間放置します。さらに 0.4 ミリリットルのノルマル塩酸 1 個でカラムからジルコニウムを溶出します。窒素ガスの安定した流れの下で摂氏65度の加熱ブロックに10〜30分間入れて、V字型バイアルで乾燥させた塩化ジルコニウム89を乾燥させ、乾燥した塩化ジルコニウム89を水中で再構成します。1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに500マイクロリットルのHEPES緩衝HBSSを入れた約600万個の細胞を含む500マイクロリットルの細胞懸濁液を調製し、約100マイクロリットルの調合ジルコニウム-89-DBNを添加します。ジルコニウム-89-DBNと細胞懸濁液を、マイクロピペットで溶液を静かに上下にピペッティングして混合します。細胞とジルコニウム-89-DBN混合物をシェーカー上で、摂氏25〜37度で約550RPMで30〜45分間インキュベートし、細胞標識を行います。新たに調製した放射性TLC溶媒を用いて、細胞の放射性標識反応に対して放射性TLCを実行します。パーセンテージでパーセントを計算しますtag画面に示されている式を使用して、Rfが0.01から0.02に等しい。別の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで、約100マイクロリットルの調合ジルコニウム-89-DBNと約500マイクロリットルのHEPES緩衝HBSSを混合し、バックグラウンド補正用の無細胞コントロールとして使用します。画面に示された式を使用して、Rfが0.01〜0.02に等しいときの放射能の割合を計算し、計算された2つの放射能率を差し引いて、有効な細胞放射性標識を計算します。放射性標識の完了を確認した後、600マイクロリットルの冷却した細胞に適した完全培地を添加して、放射性標識反応のクエンチングを行う。細胞を96Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。そして上澄みを捨てます。ペレット化した細胞を500マイクロリットルの冷やした培地に、マイクロピペットで培地を上下にピペッティングして静かに再懸濁します。細胞を摂氏4度で10分間96Gで遠心分離し、上清を廃棄します。次に、画面に示された式を使用して、すべての洗浄後の最終的な放射性標識効率を計算します。放射性標識細胞の品質を確保するために、放射性標識細胞の最終懸濁液を目視検査し、凝集塊が存在しない場合は、放射性標識および洗浄ステップの1時間以内にPBSで調製した0.4%トリパンブルー溶液を使用してトリパンブルー排除生存率試験を実施します。ジルコニウム-89リン酸水素と塩化ジルコニウム-89を使用したジルコニウム-89のDFO-Bn-NCSのキレート化効率は、放射性TLCで測定すると異なります。ジルコニウム-89で放射性標識したさまざまな細胞の7日間にわたる安定性をここに示します。放射性標識細胞によるジルコニウム-89放射能の保持は、研究したすべての細胞で安定しており、標識後7日間で観察された排出はごくわずかであることがわかりました。ジルコニウム-89-DBNを用いたさまざまな細胞タイプにおける細胞放射性標識効率をこの表に示します。細胞の放射性標識効率は、洗浄後の放射性標識細胞ペレットで観察される未補正収率として20〜50%まで変化します。このプロトコルの最も重要なステップは、キレート化混合物へのDFO-Bn-NCSの添加と放射性標識細胞の品質評価です。この技術の応用は、細胞ベースの治療の薬物動態を理解するのに役立ちます。また、細胞療法のクリアランスプロファイルを変更する臨床的必要性についても疑問が生じます。

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JoVE Journal

Cancer Research

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