下流循環フリーDNAアプリケーションのための標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル
2022年9月16日
リキッドバイオプシーは、腫瘍学のトランスレーショナル研究へのアプローチに革命をもたらし、サンプルの収集、品質、および保管は、臨床応用を成功させるための重要なステップです。ここでは、ほとんどのトランスレーショナルリサーチラボで適用できる、下流の循環のないDNAアプリケーションのための標準化され検証されたプロトコルについて説明します。
これは、循環遊離DNAに基づくダウンストリームリキッドバイオプシーアプリケーション用の血液サンプルの処理と保存のための標準プロトコルです。これは公開された最初の標準プロトコルですが、この手法は数年前から使用されています。ほとんどのトランスレーショナルラボまたは科学ラボで利用可能な標準機器で簡単にフォローできます。
プロトコルは、すべてのラボスタッフが実行できます。このプロトコルは、サンプルの収集と保管の方法を標準化するのに役立ち、最終的にはクリニックに影響を与え、精度が最も重要な同じまたは類似のダウンストリーム分析を実行する異なるセンター間のばらつきを減らします。この方法は、腫瘍学研究および臨床応用において特に有用である。
ただし、リキッドバイオプシーも使用される他の非癌疾患にも適用できます。血液サンプルを遠心分離した後、除去する血漿または血清の量を知ることは難しい場合がありますが、この特定のガイドラインに従うことはこれに役立ちます。プロトコルの残りの部分は、実験室での経験が限られているため、非常に簡単に理解できます。
手順を実演するのは、私たちの研究室の技術者であるホルヘです。まず、新鮮な血液を含むチューブを室温で1600倍gで10分間遠心分離し、最大のブレークを適用します。遠心分離機からチューブを慎重に取り外します。
血清上清の上相は透明で黄色がかって見えます。サンプルに溶血の兆候が見られるかどうかを確認し、必要に応じて溶血の存在を記録します。クラスIIバイオセーフティキャビネットで、血清を250マイクロリットルのアリコートとして収集チューブに移します。
アリコートは正しくラベル付けされている必要があります。すぐに保存ボックス内の血清を摂氏マイナス80度で直立凍結し、サンプル保存時間を記録します。サンプルが必要な 4 時間以内に処理されたことを確認します。
EDTAチューブを室温で1600倍gで10分間遠心分離し、最大のブレークを適用します。遠心分離後、血漿上清は透明で黄色がかったように見えます。サンプルに溶血の兆候が見られるかどうかを確認し、使い捨ての血清学的ピペットを使用して細胞層を乱すことなく、血漿を15ミリリットルの遠沈管に移します。
細胞層の上に約5ミリメートルの少量の残留血漿を残します。溶血が観察された場合は、さらなる分析のためにサンプルを廃棄してください。血漿と15ミリリットルの遠沈管を遠心分離して、最初の遠心分離ステップから持ち越された残りの無傷の血球を除去します。
チューブの下部にある細胞ペレットではなく、遠心分離機からチューブを慎重に取り外し、使い捨ての血清学的ピペットを使用して、1〜4ミリリットルの血漿を1〜4ミリリットルのポリプロピレン極低温BIOSまたはエッペンドルフに移します。血漿が血球で汚染されないように、チューブの底に残留量の血漿を残す必要があります。直ちにマイナス80°Cで保存ボックス内のプラズマを直立凍結し、サンプル保存時間を記録します。
サンプルが正しくラベル付けされ、必要な4時間以内に処理されたことを確認します。P1000とろ過されたチップを使用して細胞層を収集し、それを2ミリリットルのチューブに移します。すぐに凍結し、マイナス80°Cで保管してください。
ダウンストリームアプリケーションに使用できる高品質のcfDNA抽出の例がここに示されていますが、このグラフィック画像は、高レベルのゲノム汚染を伴う不適切なサンプルの例を表しています。血漿または血清画分は黄色でなければならない。これは、個々のサンプルによって異なる場合があります。
溶血のあるサンプルは廃棄する必要があります。血漿画分を除去するときは、細胞ペレットを除去しないように注意してください。.このプロトコルは、免疫検出技術を用いた血清および血漿サンプル中のノンコーディングRNAまたはタンパク質の検出など、他の核酸ベースおよびタンパク質アプリケーションにも使用できます。
これは多くの研究室で使用されている非常に標準的な技術です。このプロトコルは、将来の臨床応用に必要な重要な側面であるため、研究者が分析を実行する方法を標準化するのに役立ちます。
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概要
この記事は、循環遊離DNAに焦点を当てた液体バイオプシー応用のための血液サンプルの処理と保存に関する標準化されたプロトコルを提示します。このプロトコルは、従うのが簡単で、ほとんどの翻訳研究室で実施できるように設計されています。
主要な研究要素
科学の分野
- 腫瘍学
- 翻訳研究
背景
- 液体バイオプシーは、腫瘍学の翻訳研究を変革しました。
- サンプルの収集、品質、および保存は臨床応用にとって重要です。
- これはこの技術のために公開された最初の標準プロトコルです。
- この方法は数年間使用されています。
研究の目的
- サンプルの収集と保存を標準化する。
- 類似の分析を実行する異なるセンター間の変動性を減少させる。
- 臨床応用における精度の向上。
使用された方法
- 血液サンプルの処理。
- 循環遊離DNAの保存プロトコル。
- 標準的な実験室機器の利用。
- すべての実験室スタッフがアクセス可能なプロトコル。
主な結果
- 標準化されたプロトコルはサンプルの取り扱いを改善します。
- ダウンストリーム分析の変動性を減少させます。
- 腫瘍学研究においてより良い臨床結果を促進します。
結論
- このプロトコルは、液体バイオプシー応用の信頼性を向上させるために重要です。
- 標準化は臨床実践に前向きな影響を与えます。
- これは、腫瘍学研究における精度の増大する必要性をサポートします。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Standardized preanalytical protocols for liquid biopsy are critical for ensuring reproducible, high-quality circulating-free DNA (cfDNA) samples across translational and clinical research pipelines. This protocol directly addresses variability in sample handling, supporting predictive confidence and enabling robust downstream molecular analyses. Its adoption impacts early discovery, assay development, and translational continuity in oncology and other disease areas utilizing cfDNA.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent cfDNA sample quality for hypothesis-driven biomarker studies.
- Reduces preanalytical variability, supporting functional target validation.
- Facilitates reliable comparison of molecular signatures across cohorts.
Screening & Assay Development
- Provides standardized input material for assay optimization and validation.
- Supports reproducibility and quantitative output in cfDNA-based assays.
- Enables scalable sample processing for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sample handling with requirements for translational biomarker studies.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation of cfDNA markers.
- Reduces risk of sample-related artifacts in disease-relevant model systems.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions preanalytical sample handling as a foundational step from early discovery through lead identification and translational research. Its standardization supports robust data generation and cross-study comparability.
- Discovery Biology: Ensures cfDNA integrity for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Delivers reproducible, high-quality samples for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative, contamination-minimized inputs for downstream molecular analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical model validation with consistent sample quality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, cross-team protocol for cfDNA sample processing in diverse R&D settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cfDNA studies.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability across laboratories.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cfDNA-driven programs.
Implementation Considerations
- Requires basic laboratory expertise and adherence to biosafety protocols.
- Needs standard centrifugation and cold storage infrastructure.
- Demands rigorous sample labeling and time-tracking for cross-team standardization.
- Adaptable to various nucleic acid and protein applications in plasma and serum.
- Sample quality is limited by hemolysis and processing time constraints as specified.
