Name: 下流循環フリーDNAアプリケーションのための標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: 学ぶ標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル。血液サンプルの処理・保存方法を統一し、循環フリーDNAを用いた下流解析の変動を減らし、がん研究の精度を向上させる実用的な手法です。

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我々は、がんの生物医学研究ネットワーク(CIBERONC)の支援と、次のプロジェクト助成金に感謝したいと思います:LB CIBERONCプラットフォーム:リキッドバイオプシーの標準化と促進のためのシベロンクプラットフォーム。PI ロドリゴ・トレド, (CIBERONC), 2019-2021.

血液サンプルの抽出前に、参加センターから事前の倫理的承認が得られました。血清および血漿単離のための以下のプロトコールは、生物医学研究のための倫理的原則に従って実施された。
メモ: プロトコルを開始する前の事前の考慮事項については、こちらを参照してください。生物医学研究におけるヒトサンプルの使用には、対応するインフォームドコンセントとともに、事前の倫理的承認が必要です。血液サンプルを処理するには、クラスIIバイオセーフティキャビネットが必要です。白衣、保護手袋、眼鏡は、血液媒介性病原体による感染を避けるために、手順全体を通して着用する必要があります。血清サンプルの処理には最低30分が必要です。抗凝固剤を含まないチューブで血液を抽出した後、凝塊形成を可能にするために室温(RT)で30〜45分間維持する。血漿調製には最低40分が必要であり、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)チューブを使用する場合は抽出時から4時間以内、細胞安定化収集チューブまたは特定の無細胞DNA収集チューブを使用する場合は24〜48時間以内にサンプルを処理する必要があります。しかし、一部のメーカーによると、サンプルはこれらの特殊なチューブで最大2週間安定しています。血漿または血清画分に赤みを帯びた外観を与える溶血をチェックすることが重要です。ディスカッションの溶血サンプルについては、トラブルシューティングのセクションを参照してください。
1. リキッドバイオプシー研究のための血清製剤
メモ:この手順の実行に必要な合計時間は30分です(図1)。
<ol><li>抗凝固剤(赤または赤/灰灰黒キャップ)を含まないチューブで4〜10mLの血液を抽出し、RTで30〜45分間維持する。抽出時から4時間以内にこれらのサンプルを処理します。</li>
	<li>サンプル抽出の日時と被験者識別(ID)を、適切に設計されたサンプルデータベースに記録します。</li>
	<li>白衣、保護手袋、眼鏡を着用し、鮮血液の入ったチューブをRT(15°C-25°C)で1,600(±150)x gで10分間遠心分離し、最大ブレークを適用します。</li>
	<li>遠心分離後、チューブを遠心分離機から慎重に取り外します。血清上清の上相は、透明で黄色がかったように見えます(図2)。サンプルが溶血の兆候を示しているかどうかを確認し(図3)、必要に応じて溶血の存在を記録します。</li>
	<li>クラスIIバイオセーフティキャビネットで、血清を250μLアリコートとして収集チューブに移します。 注:アリコートの量は、試験要件に合わせて調整する必要があります。</li>
	<li>直ちに血清を-80°Cの貯蔵ボックス内で直立して凍結し、サンプル貯蔵の時間を記録する。</li>
	<li>サンプルが必要な 4 時間枠内に処理されたことを確認します。</li>
</ol>2. リキッドバイオプシー研究のための血漿調製
メモ:この手順の実行に必要な合計時間は40分です(図4)。
<ol><li>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含むチューブに血液4〜10mLを抽出する。抽出時から4時間以内にサンプルを処理します。</li>
	<li>サンプル抽出の日時とサブジェクト ID を、適切に設計されたサンプル・データベースに記録します。</li>
	<li>白衣、保護手袋、眼鏡を着用し、EDTAチューブをRT(15°C-25°C)で1,600(±150)x gで10分間遠心分離し、最大ブレークを適用します。 メモ: 他の収集チューブを使用する場合は、製造元の指示書を参照してください。</li>
	<li>遠心分離後、血漿上清は透明で黄色がかった色に見えます。サンプルが溶血の徴候を示しているかどうかを確認し(図3)、使い捨て血清学的ピペット(または使い捨てバルブピペットまたはフィルターチップ付きp1000ピペット)を使用して細胞層を乱すことなく血漿(上清)を15 mL遠沈管に移します。プラズマの残留体積をセル層の上に残しておきます(約5mm)。</li>
	<li>溶血が観察された場合は、さらなる分析のためにサンプルを廃棄してください。(図5)。溶血を評価するには、「ディスカッション」のトラブルシューティングセクションを参照してください。</li>
	<li>血漿を15 mL遠沈管中でRT(15°C-25°C)で3,000(±150)x gで10〜20分間遠心分離します 。 このステップを実行して、第1の遠心分離ステップから引き継がれた残留無傷の血球を除去する。</li>
	<li>遠心分離後、遠心分離機からチューブを慎重に取り出し、使い捨て血清学的ピペット(または使い捨て電球ピペットまたはフィルターチップ付きp1000ピペット)を使用して、1〜4mLの血漿を1〜4mLポリプロピレン極低温バイアルに移す。血漿の残留量(約0.3mLまたは高さ7mm)は、血漿を血球で汚染しないようにチューブの底部に残す必要があります(図5)。</li>
	<li>直ちに-80°Cで貯蔵ボックス内のプラズマを直立して凍結し、サンプル貯蔵の時間を記録する。サンプルが必要な 4 時間枠内に処理されたことを確認します。</li>
	<li>P1000とろ過した先端を使用して細胞層(バフィーコート)を集め、2mLチューブに移します。直ちに凍結し、-80°Cで保存する。</li>
</ol>

<ol><li>Alix-Panabières, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA+as+liquid+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+exosomes+as+liquid+biopsy+in+clinical+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144(2020).</li>
<li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsies%3A+Genotyping+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA.</a> Nature Medicine. 4 (6), (2014).</li>
<li>Heitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+a+practical+implementation+of+circulating+tumor+DNA+mutation+testing+in+metastatic+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22ESMO+Open%22%5BJournal%5D)">Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer.</a> ESMO Open. 7 (2), 100399(2022).</li>
<li>Gennari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESMO+Clinical+Practice+Guideline+for+the+diagnosis%2C+staging+and+treatment+of+patients+with+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%3A+Official+Journal+of+the+European+Society+for+Medical+Oncology%22%5BJournal%5D)">ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).</li>
<li>Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+monitor+hemolysis+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple method to monitor hemolysis in real time.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5101(2020).</li>
<li>Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy+enters+the+clinic+-+implementation+issues+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).</li>
<li>Sidstedt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+mechanisms+of+hemoglobin%2C+immunoglobulin+G%2C+and+whole+blood+in+digital+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).</li>
<li>Maass, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sampling+to+sequencing%3A+A+liquid+biopsy+pre-analytic+workflow+to+maximize+multi-layer+genomic+information+from+a+single+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube.</a> Cancers. 13 (12), 3002(2021).</li>
<li>Greytak, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonizing+cell-free+DNA+collection+and+processing+practices+through+evidence-based+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%3A+An+Official+Journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).</li>
<li>Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+that+influence+quality+and+yield+of+circulating-free+DNA%3A+A+systematic+review+of+the+methodology+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature.</a> Heliyon. 4 (7), 00699(2018).</li>
<li>Boissier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrifuge+brake+impacts+neither+routine+coagulation+assays+nor+platelet+count+in+platelet-poor+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).</li>
<li>Johansson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+and+quality+controls+when+analyzing+cell-free+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078(2019).</li>
<li>Casas-Arozamena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+of+uterine+aspirates+and+cfDNA+as+an+integrative+liquid+biopsy+strategy+in+endometrial+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585(2020).</li>
<li>Alcoceba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy%3A+a+non-invasive+approach+for+Hodgkin+lymphoma+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping.</a> British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).</li>
<li>Szpechcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+levels+in+plasma+of+patients+with+non-small-cell+lung+cancer+and+inflammatory+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease.</a> British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).</li>
<li>Earl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutation+profiling+in+the+liquid+biopsy+and+clinical+analysis+of+hereditary+and+familial+pancreatic+cancer+cases+reveals+kras+negativity+and+a+longer+overall+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival.</a> Cancers. 13 (7), 1612(2021).</li>
<li>Lampignano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+evaluation+of+circulating+cell-free+DNA+extraction+and+downstream+analyses+for+the+development+of+standardized+%28pre%29analytical+work+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows.</a> Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).</li>
<li>Febbo, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+technical+data+elements+for+liquid+biopsy+data+submitted+to+public+databases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).</li>
<li>De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+use+liquid+biopsies+to+treat+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22ESMO+Open%22%5BJournal%5D)">How to use liquid biopsies to treat patients with cancer.</a> ESMO Open. 6 (2), 100060(2021).</li>
</ol>

ベアトリズ・ベロシージョ(BB):BBは、アムジェン社、アストラゼネカ社、バイオカルティス社、ヤンセン社、メルク社セロノ社、ノバルティス社、キアゲン社、ロシュ社ダイアグノ社、ロシュ社ファーマ社、サーモフィッシャー社、ファイザー社、BMS社から講演者、コンサルタント業、またはアドバイザリー職の謝礼を受けました。Sara López-Tarruella (SL): SLは、Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo、MSD、Novartis、Pfizer、Roche Pharma、Gilead、Lilly、Pierre Fabre、Seagen、GlaxoSmithKline、Veracyteから講演者、コンサルタント、またはアドバイザリーの役割に対して名誉賞を受賞しました。ノエリア・タラゾナ(NT):NTは、アムジェン社、ファイザー社、メルク・セロノ社、セルビエ社、SEOM、ESMO社から講演者、コンサルタント業、またはアドバイザリー役の謝礼を受けました。ハビエル・エルナンデス=ロサ(JHL):アストラ・ゼネカ、ヤンセン、ノバルティス、ロシュ・ダイアグノスティックス、ロシュ・ファーマ、サーモフィッシャー、リリー、ダイアセウティクスから講演者、コンサルタント、またはアドバイザリーの役割に対して謝礼を授与されました。Rodrigo Toledo(RT)は、ノバルティスからこの研究に関連する研究助成金を受け、アストラゼネカとベイジーンからこの研究とは無関係の研究助成金を受け取ったと報告しています。残りの著者は、原稿に関して開示していません。

リキッドバイオプシーは、癌の管理中の異なる時期に多数の潜在的な用途を有する。第一に、診断時に、臨床的にさらに調査される可能性のある潜在的な腫瘍病変の存在を示唆する腫瘍分子マーカーを同定する。第二に、治療中に疾患のリアルタイムモニタリング、治療分子応答の評価、クローン進化、および疾患再発または治療抵抗性の早期発見を行う。最後に、外科的処置の後、最小限の残存疾患を検出するためのツールとして。欧州腫瘍医学会(ESMO)は最近、実用的な治療標的を同定するために、転移性非小細胞肺癌(NSCLC)におけるctDNA変異検査の実施に関するガイドラインを発表しました。これらのガイドラインには、方法論的考察、ctDNAプロファイリングの技術的評価と検証、体細胞モザイク、低バリアント対立遺伝子頻度(VAF)、および付随的な生殖細胞系列病原性バリアント検出などのいくつかの課題の議論が含まれます4。転移性乳がん患者の診断、病期分類、および治療に関する最近発表されたESMO臨床実践ガイドラインは、治療アプローチに変更がある場合、または臨床試験に入るための必要条件である場合のctDNAベースの分析を示しています<su...

用語「リキッドバイオプシー」は、2010年1 月に、原発腫瘍に由来する血液および他の体液中の分子(例えば、タンパク質、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA))、細胞、または細胞外小胞(例えば、エキソソーム)の存在として定義された。リキッドバイオプシーサンプルの使用は、組織生検としてのトランスレーショナル腫瘍学研究に革命をもたらしており、特定の瞬間に特定の領域に限定され、腫瘍の不均一性のために関連するクローンを見逃す可能性がある。さらに、リキッドバイオプシーは、侵襲的な生検を回避し、患者のコストとリスクを軽減する可能性があるため、一次組織が乏しい、またはアクセスできない腫瘍タイプにおいて適切な役割を果たします。さらに、腫瘍分子特性は、主に治療圧力のために絶えず進化しており、リキッドバイオプシーサンプルは、ベースライン、治療、最良の応答、および疾患の進行時またはそれ以前など、疾患のさまざまな臨床的および治療的時間において、縦方向に採取することができるため、腫瘍クローンダイナミクスを捕捉することができる。「リアルタイムリキッドバイオプシー」の概念は、腫瘍の動的変化をリアルタイムで監視できることを意味し、この疾患における精密医療を可能にする。リキッドバイオプシーは、がんのスクリーニングと早期発見、疾患のリアルタイムモニタリング、最小限の残存疾患の検出、治療抵抗性のメカニズムの研究、治療レベル1での患者の層別化など、診療所で数多くの潜在的な用途があります。疾患の再発および進行の早期発見は、多くの腫瘍タイプにおいて満たされていない臨床的ニーズであり、がん患者の生存率および生活の質を高める上で重要な要素である。日常的な画像化モダリティおよび可溶性腫瘍マーカーは、このタスクに必要な感度および/または特異性を欠いている可能性がある。したがって、循環遊離核酸に基づくものなど、診療所において新規な予測マーカーが緊急に必要とされている。
リキッドバイオプシー研究に使用されるサンプルの種類には、血液、尿、唾液、および便サンプルが含まれますが、これらに限定されません。他の腫瘍特異的試料は、細胞吸引液、脳脊髄液、胸水、嚢胞液および腹水、喀痰、および膵液2であり得る。前者の液体は、異なるタイプの癌由来物質、循環腫瘍細胞(CTC)、またはエキソソームおよび無細胞循環腫瘍DNA(ctDNA)などの断片を含んでもよい。核酸は、細胞外小胞(EV)に封入されるか、または細胞死および損傷のために体液中に放出され得る。循環遊離DNA(cfDNA)は、主にアポトーシス細胞または壊死細胞から血流に放出され、すべての個体に存在し、炎症性または腫瘍学的疾患におけるレベルの増加を示す3。エキソソームは、核酸、タンパク質、および脂質を含む細胞によって分泌される小さな細胞外小胞(〜30〜150nm)である。これらの小胞は、細胞間通信ネットワークの一部を形成し、多くの種類の体液2に一般的に見られる。EV内部に封入された核酸は、体液中の過酷な環境から保護されているため、リキッドバイオプシー環境でこれらの分子を研究するためのより堅牢な方法を提供します。
全体として、リキッドバイオプシーサンプル中の循環核酸のレベルは非常に低いため、デジタルPCRや次世代シーケンシング(NGS)などの検出には高感度な方法が必要です。サンプルの事前分析管理は、血球溶解および無傷のDNAの放出を防ぎ、cfDNAとゲノムDNAの汚染を引き起こすために不可欠です。さらに、サンプルを抽出する際には、酵素ベースの分析方法の阻害剤の存在を避けるために注意する必要があります。
ここでは、循環核酸分析を含むリキッドバイオプシーベースの下流アプリケーションにとって重要な最初のステップである、血漿および血清サンプルの収集と保存のための標準化された方法を紹介します。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL エッペンドルフチューブ</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td>任意の標準チューブ/機器が使用可能</td></tr><tr><td>10 mL 血清学的ディスポーザブルピペット</td><td>BIOFIL</td><td>GSP010010</td><td>任意の標準チューブ/機器が使用可能</td></tr><tr><td>10 mL Vacutainer K2 EDTAチューブ</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>367525</td><td>これらのチューブは血漿採取に使用できます</td></tr><tr><td>15 mLポリプロピレン遠心分離チューブ</td><td>BIOFIL</td><td>CFT411150</td><td>標準的なチューブや機器であれば、どのような標準でも使用可能</td></tr><tr><td>3.5mL BDバキュテイナーチューブ 抗凝固剤を含まない</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>368965</td><td>8.5mLまたは3.5mLのチューブを血清採取に使用可能</td></tr><tr><td>4mLポリプロピレン製極低温バイアル、丸底、自立</td>型 <td>コーニング</td><td>430662</td><td>標準的なチューブ/機器であれば、</td></tr><tr><td>4mL Vacutainer K2 EDTAチューブ</td><td>ベクトン・ディキンソン367864</td><td></td><td>これらのチューブは、血漿収集</td></tr><tr><td>4200 TapeStationシステム</td><td>Agilent</td><td>G2991BA</td><td>いくつかの定量化方法は、a&nbsp;cfDNA</td></tr><tr><td>5 mL血清学的使い捨てピペット</td>のための特定のアプリケーションで利用可能です <td>BIOFIL</td><td>GSP010005</td><td>任意の標準チューブ/機器は、</td></tr><tr><td>抗凝固剤なしで8.5mL BDバキュテイナーチューブ</td>を使用することができます <td>ベクトン・ディキンソン</td><td>366468</td><td>8.5 mLまたは3.5 mLのチューブを血清採取に使用できます</td></tr><tr><td>遠心分離機、スイングバケットローター付きで~3000 x gが可能</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST 16 &nbsp;10688725</td><td>任意の標準チューブ/機器を</td></tr><tr><td>1&ndash用の冷凍庫収納ボックスで使用できます。4 mL極低温バイアル</td><td>Corning</td><td>431120</td><td>これらのボックスは、4 mLバイアルをストレージに使用するときに必要です</td></tr><tr><td>p1000ピペットチップ</td><td>CORNING</td><td>4809</td><td>任意の標準チューブ/機器を使用することができます</td></tr><tr><td>QIAamp循環核酸キット</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>cfDNA分離に特化した市販のキットは、この血液処理プロトコルで使用できます。</td></tr><tr><td>ストレック&nbsp;無細胞 DNA BCT CE チューブ 10 mL</td><td>Streck</td><td>218997</td><td>これらのチューブは、血漿収集に使用することができます</td></tr><tr><td>温度冷凍庫 (-80 &deg;C)</td><td>ESCO</td><td>2180104</td><td>任意の標準チューブ/機器を使用できます</td></tr></tbody></table>

下流循環フリーdnaアプリケーションのための標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

リキッドバイオプシー(LB)という用語は、原発性および/または転移性腫瘍に由来する血液および他の体液中のタンパク質、DNA、RNA、細胞、または細胞外小胞などの分子を指す。LBはトランスレーショナルリサーチの柱として浮上し、臨床腫瘍学の実践の一部となり始めており、固形生検に代わる低侵襲の代替手段を提供しています。LBは、血液などの低侵襲サンプル抽出 を介して 腫瘍のリアルタイムモニタリングを可能にします。これらのアプリケーションには、がんの早期発見、疾患進行の検出のための患者フォローアップ、最小限の残存疾患の評価、分子進行および耐性のメカニズムの潜在的な同定が含まれる。診療所で報告できるこれらのサンプルの信頼性の高い分析を達成するためには、分析前の手順を慎重に検討し、厳密に従う必要があります。サンプルの収集、品質、および保管は、ダウンストリームアプリケーションでの有用性を判断する重要なステップです。ここでは、循環のないDNAに基づく下流のリキッドバイオプシー分析のために、血漿および血清サンプルを収集、処理、および保存するための当社のリキッドバイオプシー作業モジュールからの標準化されたプロトコルを紹介します。ここで紹介するプロトコルは、標準的な機器を必要とし、生物学的手順に焦点を当てたほとんどの研究室に適用するのに十分な柔軟性があります。

抗凝固剤を含まない血液チューブの遠心分離後、上相は淡黄色で表示され、血清画分に相当する(図2)。この画分は慎重に除去され、その後の分析のために小分けされます。
溶血は血漿または血清画分のいずれかに存在することができ、上相は赤みを帯びた外観を有し、これは溶血の存在および程度を示す(図3)。
EDTAチューブの遠心分離後、いくつかの相または層が明らかになる。上相(淡黄色)は血漿画分であり、総血液量の55%を占める。薄い灰色がかった白い界面は、白血球および血小板を含むバフィーコート層であり、総血液量の&lt;1%を占める。下相(赤色)には赤血球が含まれており、これは総血液量の45%を占める)。白血球層の1cm上方を吸引し、血球細胞による血漿の汚染を減らすために細胞層が乱れていないことを確認します(図5)。この画分は慎重に除去し、その後の分析のために小分けす...

リキッドバイオプシーは、腫瘍学のトランスレーショナル研究へのアプローチに革命をもたらし、サンプルの収集、品質、および保管は、臨床応用を成功させるための重要なステップです。ここでは、ほとんどのトランスレーショナルリサーチラボで適用できる、下流の循環のないDNAアプリケーションのための標準化され検証されたプロトコルについて説明します。

下流循環フリーDNAアプリケーションのための標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

これは、循環遊離DNAに基づくダウンストリームリキッドバイオプシーアプリケーション用の血液サンプルの処理と保存のための標準プロトコルです。これは公開された最初の標準プロトコルですが、この手法は数年前から使用されています。ほとんどのトランスレーショナルラボまたは科学ラボで利用可能な標準機器で簡単にフォローできます。プロトコルは、すべてのラボスタッフが実行できます。このプロトコルは、サンプルの収集と保管の方法を標準化するのに役立ち、最終的にはクリニックに影響を与え、精度が最も重要な同じまたは類似のダウンストリーム分析を実行する異なるセンター間のばらつきを減らします。この方法は、腫瘍学研究および臨床応用において特に有用である。ただし、リキッドバイオプシーも使用される他の非癌疾患にも適用できます。血液サンプルを遠心分離した後、除去する血漿または血清の量を知ることは難しい場合がありますが、この特定のガイドラインに従うことはこれに役立ちます。プロトコルの残りの部分は、実験室での経験が限られているため、非常に簡単に理解できます。手順を実演するのは、私たちの研究室の技術者であるホルヘです。まず、新鮮な血液を含むチューブを室温で1600倍gで10分間遠心分離し、最大のブレークを適用します。遠心分離機からチューブを慎重に取り外します。血清上清の上相は透明で黄色がかって見えます。サンプルに溶血の兆候が見られるかどうかを確認し、必要に応じて溶血の存在を記録します。クラスIIバイオセーフティキャビネットで、血清を250マイクロリットルのアリコートとして収集チューブに移します。アリコートは正しくラベル付けされている必要があります。すぐに保存ボックス内の血清を摂氏マイナス80度で直立凍結し、サンプル保存時間を記録します。サンプルが必要な 4 時間以内に処理されたことを確認します。EDTAチューブを室温で1600倍gで10分間遠心分離し、最大のブレークを適用します。遠心分離後、血漿上清は透明で黄色がかったように見えます。サンプルに溶血の兆候が見られるかどうかを確認し、使い捨ての血清学的ピペットを使用して細胞層を乱すことなく、血漿を15ミリリットルの遠沈管に移します。細胞層の上に約5ミリメートルの少量の残留血漿を残します。溶血が観察された場合は、さらなる分析のためにサンプルを廃棄してください。血漿と15ミリリットルの遠沈管を遠心分離して、最初の遠心分離ステップから持ち越された残りの無傷の血球を除去します。チューブの下部にある細胞ペレットではなく、遠心分離機からチューブを慎重に取り外し、使い捨ての血清学的ピペットを使用して、1〜4ミリリットルの血漿を1〜4ミリリットルのポリプロピレン極低温BIOSまたはエッペンドルフに移します。血漿が血球で汚染されないように、チューブの底に残留量の血漿を残す必要があります。直ちにマイナス80°Cで保存ボックス内のプラズマを直立凍結し、サンプル保存時間を記録します。サンプルが正しくラベル付けされ、必要な4時間以内に処理されたことを確認します。P1000とろ過されたチップを使用して細胞層を収集し、それを2ミリリットルのチューブに移します。すぐに凍結し、マイナス80°Cで保管してください。ダウンストリームアプリケーションに使用できる高品質のcfDNA抽出の例がここに示されていますが、このグラフィック画像は、高レベルのゲノム汚染を伴う不適切なサンプルの例を表しています。血漿または血清画分は黄色でなければならない。これは、個々のサンプルによって異なる場合があります。溶血のあるサンプルは廃棄する必要があります。血漿画分を除去するときは、細胞ペレットを除去しないように注意してください。.このプロトコルは、免疫検出技術を用いた血清および血漿サンプル中のノンコーディングRNAまたはタンパク質の検出など、他の核酸ベースおよびタンパク質アプリケーションにも使用できます。これは多くの研究室で使用されている非常に標準的な技術です。このプロトコルは、将来の臨床応用に必要な重要な側面であるため、研究者が分析を実行する方法を標準化するのに役立ちます。

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学ぶ標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル。血液サンプルの処理・保存方法を統一し、循環フリーDNAを用いた下流解析の変動を減らし、がん研究の精度を向上させる実用的な手法です。

下流循環フリーDNAアプリケーションのための標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル

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