Name: 近接標識プロテオミクスを用いたニューロンリソソームインタラクトームの特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T14:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: 学ぶ近接標識プロテオミクスを用いたヒトiPSC由来ニューロンにおけるリソソーム微小環境の解析法。ライブ細胞でリソソーム膜タンパク質と相互作用を定量化し、脳疾患の分子標的発見に貢献する。

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この研究は、NIH助成金(R01NS121608)によってサポートされています。AMFは、ARCS-メトロワシントン支部奨学金とバーボンF.スクリブナー基金フェローシップを認めています。国立神経障害・脳卒中研究所(NINDS)のマイケル・ウォード研究室の分子生物学支援とi3ニューロン技術開発に感謝します。

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著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

このLAMP1-APEXプローブを使用して、リソソーム膜上および近傍のタンパク質をビオチン化し、濃縮します。典型的なリソソーム直径が100〜1,200 nmの場合、この方法は10〜20 nmの標識半径で優れた細胞内分解能を提供します。LAMP1は豊富なリソソーム膜タンパク質であり、ライソソームの古典的マーカーであり、内因性発現レベルでのリソソームAPEX標識のための優れたベイトタンパク質として機能します。しかしながら、LAMP1は後期エンドソームおよび非分解性リソソームにも存在するため、リソソームを標的とするためにLAMP1を使用する場合にも制限が存在する35。ほとんどのリソソームマーカーは後期エンドソームでも発現し、最終的にはリソソームに成熟します。リソソームを標的とする代替餌タンパク質は、LAMPTOR、LAMP2、およびTMEM19235,36,37である。反応性ビオチンラジカルは膜を貫通しないこと...

リソソームは、リソソーム-オートファジー経路1を介して高分子を分解する異化細胞小器官です。分解に加えて、リソソームはシグナル伝達、栄養感知、分泌などの多様な細胞機能に関与しています2,3,4。リソソーム機能の摂動は、リソソーム蓄積障害、癌、老化、および神経変性に関与しています3,5,6,7。有糸分裂後および高度に分極したニューロンの場合、リソソームは、ニューロン細胞の恒常性、神経伝達物質の放出、および軸索に沿った長距離輸送において重要な役割を果たします8、9、10、11。しかし、ヒトのニューロンのリソソームを調べることは困難な作業でした。人工多能性幹細胞(iPSC)由来のニューロン技術の最近の進歩により、以前はアクセスできなかった生きたヒトニューロンの培養が可能になり、動物モデルとヒト患者の間のギャップを埋めてヒト脳を研究するようになりました12,13。特に、高度なi3Neuron技術は、ドキシサイクリン誘導性プロモーターの下で神経ゲニン-2転写因子をiPS細胞ゲノムに安定的に組み込み、iPS細胞を2週間で純粋な皮質ニューロンに分化させる14,15。
非常に動的なリソソーム活性のため、他の細胞成分とのリソソーム相互作用を捕捉することは、特にハイスループット方式で技術的に困難です。近接標識技術は、並外れた空間特異性で安定したタンパク質相互作用と一過性/弱いタンパク質相互作用の両方を捕捉できるため、これらの動的相互作用の研究に適しています16,17。操作されたペルオキシダーゼまたはビオチンリガーゼは、ベイトタンパク質に遺伝的に融合することができる。活性化されると、反応性の高いビオチンラジカルが生成され、隣接するタンパク質に共有結合で標識され、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)プラットフォームを介して下流のボトムアッププロテオミクス用のストレプトアビジンコーティングビーズによって濃縮されます17、18、19、20、21。
内因性リソソーム近接標識プロテオミクス法は、i3Neurons22の動的リソソーム微小環境を捕捉するために最近開発されました。操作されたアスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX2)は、iPS細胞のリソソーム関連膜タンパク質1(LAMP1)のC末端にノックインされ、皮質ニューロンに分化することができます。LAMP1は、豊富なリソソーム膜タンパク質であり、古典的なリソソームマーカー23である。LAMP1は後期エンドソームでも発現し、リソソームに成熟します。これらの後期エンドソームリソソームおよび非分解性リソソームは、すべてこのプロトコルではリソソームと呼ばれる。この内因性LAMP1-APEXプローブは、生理学的レベルで発現し、LAMP1の誤局在および過剰発現アーティファクトを低減することができる。数百のリソソーム膜タンパク質とリソソーム相互作用物質を、生きたヒトニューロンにおいて優れた空間分解能で同定および定量することができます。
ここでは、ヒトiPS細胞由来ニューロンにおけるリソソーム近接標識プロテオミクスのための詳細なプロトコルを、最近公開された方法22からのさらなる改良を加えて説明する。全体的なワークフローを 図 1 に示します。このプロトコルには、hiPSc由来のニューロン培養、ニューロンにおける近接標識活性化、蛍光顕微鏡によるAPEX活性の検証、最適なストレプトアビジンビーズとインプットタンパク質の比率の決定、ビオチン化タンパク質の濃縮、ビーズ上のタンパク質消化、ペプチドの脱塩と定量、LC-MS分析、およびプロテオミクスデータ分析が含まれます。トラブルシューティングのガイドラインと実験的な最適化についても説明し、近接ラベリングの品質管理とパフォーマンスを向上させます。

<table><tbody><tr><td>10% (w/v) サポニン溶液</td><td>Acros Organics 419231000</td><td></td><td>蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>細胞剥離液, 細胞培養</td></tr><tr><td>B27 サプリメント</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>17504044</td><td>細胞培養, 皮質ニューロン培地</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-02</td><td>細胞培養, 皮質ニューロン培地</td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td>細胞培養、ホウ酸緩衝液</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A8806</td><td>総タンパク質濃度を測定するための標準溶液を作るには</td></tr><tr><td>脳物理学 ニューロン培地</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5790</td><td>細胞培養、皮質ニューロン培地</td></tr><tr><td>CD45R (B220) 抗体 アレクサフルオロ 561</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>505-0452-82</td><td>蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>Chroman1 ROCK inhibitor</td><td>Tocris</td><td>716310</td><td>Cell Culture</td></tr><tr><td>cOmplete mini Protease Inhibitor</td><td>Roche</td><td>4693123001</td><td>cocktail inhibitor in Lysis Buffer</td></tr><tr><td>DC Protein Assay Kit II</td><td>Bio-Rad</td><td>5000112</td> 細胞溶解物ジメチルスルホキシド (DMSO) <td>の総タンパク質濃度を測定するには</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>近接標識反応</td></tr><tr><td>DMEM/F12培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11320082</td><td>細胞培養、ディッシュコーティング</td></tr><tr><td>HEPESによるDMEM/F12培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11330057</td><td>細胞培養、誘導培地</td></tr><tr><td>ロバ血清</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D9663</td><td>蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>ドキシサイクリンヒクレート、&ge;98% (HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td>細胞培養、誘導培地</td></tr><tr><td>エッセンシャル 8 培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1517001</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>エッセンシャル 8 サプリメント (50x)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1517101</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>抽出プレート真空マニホールドキット</td><td>ウォーターズ</td><td>WAT097944</td><td>ペプチド脱塩</td></tr>ギ<tr><td>酸 (FA)</td> <td>用フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A11750LC-MS</td><td>分析用</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-10</td><td>細胞培養、皮質ニューロン培地</td></tr><tr><td>ヘキスト染料</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>62239</td><td>蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>HPLCグレードメタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>A452</td>ペプチド<td>脱塩</td></tr><tr><td>HPLCグレード水</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>W5</td><td>ペプチド用。脱塩</td></tr><tr><td>ヒト誘導多能性幹細胞</td><td>Corriell Institute</td><td>GM25256</td><td>Cell Culture</td></tr><tr><td>過酸化水素、ACS、29-32% w/w aq. soln., stab.</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td></td><td>AA33323AD 近接標識反応</td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド(IAA)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>I6125</td><td>タンパク質消化用</td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23017015</td><td>細胞培養、皮質ニューロン培地</td></tr><tr><td>LC-MSグレード アセトニトリル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A955</td><td>LC-MS分析用</td></tr><tr><td>LC-MSグレードの水</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>W64</td><td>LC-MS分析用</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>25-030-081</td><td>細胞培養、誘導培地</td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-774-552</td><td>基底膜マトリックス、細胞培養、ディッシュコーティング</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトLAMP1モノクローナル抗体</td><td>開発研究 ハイブリドーマバンク</td><td>h4a3</td><td>蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>N-2 サプリメント (100x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-502-048</td><td>細胞培養、誘導培地</td></tr><tr><td>ニトロセルロースメンブレン、プレカット、0.45 &micro;m, 7 x 8.5 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>1620145</td><td>ビーズ滴定のためのドットブロットアッセイの実施</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 (NEAA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-140-050</td><td>Cell Culture, Induction Medium</td></tr><tr><td>NT-3</td><td>PeproTech</td><td>450-03</td><td>Cell Culture, Cortical Neuron Medium</td></tr><tr><td>Oasis HLB 96-well 固相抽出プレート</td><td>Waters</td><td>186000309</td><td>ペプチド脱塩用</td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer (TBS)</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-50000</td><td>ビーズ滴定のためのドットブロットアッセイの実施</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>15710</td><td>蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>フェノールビオチン (1,000倍ストック)</td><td>Adipogen</td><td>41994-02-9</td><td>近接標識反応</td></tr><tr><td>カルシウムまたはマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td>細胞培養、近接標識反応、蛍光顕微鏡法</td></tr><tr><td>Pierce 定量的比色ペプチドアッセイ</td><td>Thermo Fisher</td><td>23275</td><td>ペプチド濃度アッセイ</td></tr><tr><td>ポリ-L-オルニチン(PLO)</td><td>ミリポア Sigma</td><td>P3655</td><td>細胞培養、ディッシュコーティング</td></tr><tr><td>アスコルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>近接標識 クエンチバッファー、溶解バッファー</td></tr><tr><td>ナトリウムアジド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td>近接標識 Quench Buffer, Lysis Buffer, 蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271500</td><td>Cell Culture, Horate Buffer</td></tr><tr><td>Dodecyl Sufate (SDS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1311220</td><td>Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>細胞培養、ホウ酸緩衝液</td></tr><tr><td>四ホウ酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732</td><td>細胞培養、ホウ酸緩衝液</td></tr><tr><td>SpeedVac 濃縮器</td><td></td><td></td><td>真空濃縮器</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン 磁気セファロースビーズ</td><td>Cytiva (正式 GE)</td><td>28-9857-99</td><td>ビオチン化タンパク質の濃縮</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン、Alexa Fluor 680 コンジュゲート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S32358</td><td>ビーズ滴定用のドットブロットアッセイを実施するには</td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td></td><td></td><td>温度制御ミキサー</td></tr><tr><td>トリフルオ酢酸(TFA)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>302031</td><td>ペプチド脱塩用</td></tr><tr><td>トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>C4706</td><td>タンパク質消化用</td></tr><tr><td>トリス-HCl</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP152500</td><td>Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP151500</td><td>Beads wash buffer</td></tr><tr><td>TROLOX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>648471</td><td>Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer</td></tr><tr><td>Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade</td><td>Promega</td><td>V5073</td><td>For Protein Digestion</td></tr><tr><td>TWEEN&nbsp;20</td><td>ミリポア Sigma</td><td>P1379</td><td>ドットブロットアッセイバッファー</td></tr><tr><td>尿素</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP169500</td><td>ビーズ洗浄液およびオンビーズ消化バッファー</td></tr><tr><td>ビトロネクチン</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7180</td><td>細胞培養、ディッシュコーティング</td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK阻害剤</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td>細胞培養</td></tr></tbody></table>

近接標識プロテオミクスを用いたニューロンリソソームインタラクトームの特性評価

Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics

リソソームは、さまざまな生体分子と頻繁に通信して、分解やその他の多様な細胞機能を実現します。ニューロンは有糸分裂後であり、細胞の恒常性を維持するためにオートファジー-リソソーム経路に大きく依存しているため、リソソームは人間の脳機能にとって重要です。さまざまなリソソーム機能の理解が進んでいるにもかかわらず、リソソームと他の細胞成分との間の非常に動的なコミュニケーションをキャプチャすることは、特にハイスループットの方法で技術的に困難です。ここでは、最近発表されたヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)由来ニューロンにおける内因性(ノックイン)リソソーム近接標識プロテオミクス法の詳細なプロトコルを提供します。 
ライソソーム膜タンパク質と半径10〜20 nm以内のリソソーム周囲のタンパク質の両方を、生きたヒトニューロンで確実に同定し、正確に定量することができます。プロトコルの各ステップ、すなわち、hiPSCニューロン培養、近接標識、ニューロン収穫、蛍光顕微鏡、ビオチン化タンパク質濃縮、タンパク質消化、LC-MS分析、およびデータ分析が詳細に説明されています。要約すると、このユニークな内因性リソソーム近接標識プロテオミクス法は、生きたヒトニューロンにおける非常に動的なリソソーム活性を研究するためのハイスループットで堅牢な分析ツールを提供します。

このリソソーム近接標識プロテオミクス研究は、ヒトiPS細胞由来のニューロンで実施され、生きたニューロンの動的なリソソーム微小環境 をin situ でキャプチャしました。異なる時点におけるhiPS細胞およびhiPSC由来ニューロンの細胞形態を 図2Aに示す。ヒトiPS細胞はE8培地中のコロニーで増殖する。分化は、iPS細胞をドキシサイクリン含有ニューロン誘導培地にプレーティングすることによって開始されます。神経突起の伸長は、3日間の分化中に毎日より目に見えるようになります。ニューロン媒体中でPLOコーティングプレートに切り替えた後、神経突起はニューロン間にネットワークを形成し、ニューロンが2週間で成熟するにつれて軸索伸長がより目に見えるようになります。i3ニューロンでは、APEXプローブの局在は、急速なAPEX活性化後の蛍光顕微鏡によって検証されます。ビオチン化タンパク質はストレプトアビジン(SA)抗体を用いて染色され、リソソームは抗LAMP1抗体を用いて染色される。マージされた画像は、ベイトタンパク質へのLAMP1-APEXの正しい局在...

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおける動的リソソーム微小環境を特徴付けるために、ニューロンリソソーム近接標識プロテオミクスプロトコルについて説明します。リソソーム膜タンパク質およびリソソームと相互作用するタンパク質(安定または一過性)は、生きたヒトニューロンにおいて優れた細胞内空間分解能でこの方法では正確に定量することができる。

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to ...

リソソームは細胞のゴミ処理システムです。リソソームの活動は非常に動的であり、捕捉することは非常に困難です。本研究では、生きたヒトニューロンのリソソーム微小環境を解読するための近接標識プロテオミクスアプローチを開発しました。このアプローチは、リソソーム膜タンパク質と、リソソームおよびiPS細胞由来のニューロンとの安定で一過性の相互作用を捕捉します。リソソーム機能障害は、さまざまな脳疾患に大きく関係しています。この手法は、さまざまな脳疾患を理解し、新しい治療法を設計するための潜在的な分子標的を提供するために適用できます。近接標識の手順を開始するには、顕微鏡でニューロンを観察して、ニューロンが生きていて健康であることを確認します。培養液から半分の量の培地を取り出し、ビオチンフェノールと混合し、摂氏37度のインキュベーターで30分間、最終濃度500マイクロモルでニューロンに戻します。新たに調製した過酸化水素溶液を最終濃度1ミリモルでニューロン培養液に加えることにより、標識反応を開始します。1分間のインキュベーション後、培地を吸引し、クエンチバッファーで培養物を3回すすぎます。プレートを傾けて、すべての残留バッファーを吸引します。氷冷溶解バッファーを加えた後、細胞ライセートを冷たい1.5ミリリットルのチューブにこすり落とします。100ワット以上の氷冷水浴中でチューブを15分間超音波処理し、40秒オンと20秒オフの交互サイクルを行います。細胞溶解後、摂氏マイナス20度の冷たいアセトンを4倍容量の細胞ライセート溶液でサンプルに加えます。ボルテックスを短時間行い、マイナス20°Cで3時間インキュベートしてタンパク質を沈殿させ、残留ビオチンフェノールを除去します。細胞ライセートチューブを摂氏2度で10分間16、500倍Gで遠心分離し、タンパク質ペレットを乱すことなく上清を注意深く除去します。その後、ペレットをマイナス20°Cで1ミリリットルのアセトンで2回洗浄し、遠心分離して上清を除去した。次に、タンパク質ペレットを真空濃縮器で1分間乾燥させます。細胞溶解バッファーを加えて、ペレットを渦または超音波処理で完全に溶解します。20マイクロリットルのアリコートを取り、DCAアッセイによって総タンパク質濃度を測定します。残りの細胞溶液は摂氏マイナス80度で保管します。マイナス80°Cの冷凍庫からタンパク質ライセートサンプルを取り出し、サンプルチューブを30秒間超音波処理してすばやく解凍します。ボルテックス、ベンチトップミニ遠心分離機で短時間遠心分離し、試料管を氷上に置く。次に、250マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズスラリーを各1.5ミリリットルのチューブに移します。これらのチューブを磁気ラックに1分間置き、1ミリリットルの2%ドデシル硫酸ナトリウム溶液でビーズを3回洗浄し、残留バッファーを取り除きます。細胞ライセートの総タンパク質濃度とビーズ滴定アッセイの結果に基づいて、250マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズスラリーに必要な計算量のタンパク質サンプルを追加します。次に、細胞溶解バッファーを磁気ビーズ-ライセート混合物に全容量1マイクロリットルまで加え、チューブを摂氏4度で一晩回転させます。翌日、ベンチトップマイクロ遠心分離機でサンプルチューブを短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックに1分間置いて上清を除去します。その後、1ミリリットルの洗浄バッファーAを用いてビーズを室温で5分間回転させて2回洗浄した。各洗浄バッファーでこのプロセスを、バッファーB、バッファーC、およびバッファーDで摂氏4度で2回、順番に繰り返します。チューブを磁気ラックに1分間置き、上清を取り除きます。次に、ビーズを50ミリモルのトリス緩衝液中の100マイクロリットルの5ミリモルTCEPに再懸濁し、摂氏37度のサーモミキサーで30分間インキュベートした後、暗所で15ミリモルのIAAを30分間添加し、5ミリモルのTCEPを5分間添加して残留IAAをクエンチします。サンプルチューブをマイクロ遠心分離機で短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックに1分間置き、上清を除去します。50ミリモルのトリスバッファーに200マイクロリットルの5ミリモルTCEPを加えて、ビーズを再懸濁します。1マイクログラムのトリプシン/ Lys-Cミックスを1, 200 RPMおよび摂氏37度で14時間加えます。14時間後、さらに0.2マイクログラムのトリプシン/Lys-Cミックスを3時間加え、サンプルチューブを回転させて、磁気ラックに1分間置きます。次いで、ペプチド上清を清浄なチューブに移す。次に、ビーズを50マイクロリットルの50ミリモルトリス緩衝液で5分間振とうしながら洗浄し、ペプチド上清を混ぜ合わせ、30マイクロリットルの10%トリフルオロ酢酸をチューブに加えてpHを3未満に下げます。ペプチド脱塩後、乾燥する。ペプチドサンプルをLC-MS分析のためにLCバッファーに再懸濁します。上清をLCサンプルバイアルに移し、ナノLC-MSで分析します。LC-MS メソッドファイルで、ストレプトアビジン、トリプシン、Lys-C などの非常に豊富な夾雑ペプチドピークの特定の質量と保持時間範囲を含むカスタム LC-MS 除外リストを追加します。プロテオミクスデータ解析ソフトウェアでLC-MC生データを解析します。2つのFASTAライブラリ、スイスプロットホモサピエンス参照データベース、およびUniProt IDに汚染物質プレフィックスを持つ新しく構築されたユニバーサル汚染物質FASTAライブラリを含めますタンパク質およびペプチドスペクトルマッチング同定のための1%の偽発見率でデータ分析パラメーターを設定します。3つの切断漏れ、シスチンカルバミジルメチル化の固定修飾、メチオニン酸化の可変修飾、およびタンパク質末端アセチル化を伴うトリプシン消化を選択します。ラベルフリー定量では、ペプチドMS-Iピーク強度を内因性ビオチン化カルボキシラーゼPCCAに正規化し、近接標識実験の変動を減らします。プロテオミクスソフトウェアからタンパク質レベルの結果をExcelファイルとしてエクスポートします。統計解析の前に、汚染物質タンパク質およびPSMが1つしかない、または定量結果が得られないタンパク質を除去します。iPS細胞ニューロンの異なる時点における細胞形態は、3日間の分化期間中の神経突起伸長を示した。ニューロン培地でポリ-L-オルニチンコートプレートに切り替えた後、神経突起はニューロン間にネットワークを形成し、2週間で成熟した後に軸索伸長がより目に見えるようになりました。蛍光イメージングでは、ビオチン化タンパク質のLAMP1頂点活性をストレプトアビジンで染色し、ニューロンのLAMP1染色と共局在させました。ビーズ滴定アッセイの結果は、ストレプトアビジンビーズ量を増加させると、捕捉されていないビオチン化タンパク質シグナルの減少を示した。5マイクロリットルのストレプトアビジンビーズは、内因性LAMP1頂点サンプルからの50マイクログラムのインプットタンパク質に最適でした。トリプシン/Lys-Cミックスによるビーズ上での消化により、トリプシン単独と比較して、タンパク質とペプチドの同定が多くなり、切断漏れが少なくなりました。さらに、1〜1.5マイクログラムのトリプシン/ Lys-Cがビーズ上での消化に最適であり、同定されたタンパク質の数が最も多く、切断の見逃しの割合が最も低いことがわかりました。既知のリソソーム膜タンパク質は、LAMP1頂点で増加し、頂点コントロールなしと比較して増加しました。内因性ビオチン化タンパク質は非常に豊富ですが、変化しません。GO用語とタンパク質ネットワーク解析は、LAMP1頂点プロテオミクスにおいて、エンドリソソーム輸送および輸送に関連する安定なリソソーム膜タンパク質および一過性リソソーム相互作用因子が濃縮されていることを示唆した。頂点近接標識は、酸化ストレスと実験の変動を減らすために、正確に1分で急冷する必要があります。私たちは最近、ビオチン化タンパク質を濃縮することを可能にする切断可能なビオチン法を開発しました。この方法は、現在の方法と組み合わせることで、ストレプトアビジンや内因性ビオチン化タンパク質からの干渉を減らすことができます。この方法は、脳疾患を引き起こす遺伝的変異を持つ野生型ニューロンと変異型ニューロンの両方に適用できます。これは、遺伝子変異がヒトニューロンのリソソーム微小環境にどのように影響するか、そしてなぜ影響を与えるのかを理解するのに役立ちます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、線虫細胞におけるin...

In Situタンパク質間相互作用を研究するための近接ライゲーションアッセイ

ここでは、固定された細胞内小胞体とミトコンドリアの間に内因性の相互作用を視覚化し、高感度で定量化するための手順について説明します。プロトコルは、ミトコンドリア関連膜界面での75 /電位依存性アニオンチャネル/シクロフィリンD複合体イノシトール1,4,5-三リン酸受容体/グルコース調節タンパク質を標的と現場での近接連結アッセイに最適化されています。...

小胞体とミトコンドリアの相互作用の研究によって、<em&gt;その場で</em固定された細胞における&gt;近接ライゲーションアッセイ

タンパク質間相互作用は、細胞の核と細胞質の両方で発生する可能性があります。これらの相互作用を調べるために、従来の共免疫沈降と最新の近接ライゲーションアッセイが適用されます。本研究では、これら2つの方法を比較して、核と細胞質におけるNF90-RBM3相互作用の分布を可視化します。...

共免疫沈降により核および細胞質画分中のタンパク質間相互作用の可視化と<em&gt;その場で</em&gt;近接ライゲーションアッセイ

記載されているプロテオミクスワークフローは、目的とするタンパク質の免疫親和性濃縮と標識フリー質量分析法を用いて核細胞内分画からタンパク質相互作用パートナーを同定するためのプロテオミクスワークフローである。このワークフローには、細胞内分画、免疫沈降、フィルター支援サンプル調製、オフラインクリーンアップ、質量分析、下流バイオインフォマティクスパイプラインが含まれます。...

大規模核インターロームプロファイリングのためのラベルフリー免疫沈降質量分析ワークフロー

ここで説明する近接標識法は、ニコチアナベンタミアナ葉組織におけるNLR免疫受容体のTIRドメインの相互作用パートナーの同定のための方法である。また、ニコティアナおよび他の植物種におけるこの技術を用いて、関心のある他のタンパク質間の相互作用を同定するための詳細なプロトコルも提供される。...

タンパク質相互作用ネットワークのインプランタ同定のためのTurboIDベースの近接標識

ここでは、質量分析ベースのプロテオミクスによる感染時の宿主と病原体の相互作用をプロファイルするプロトコルを提示する。このプロトコルは、標識のない定量を使用して、1回の実験で、宿主(例えばマクロファージ)と病原体(例えば...

発見駆動型宿主間相互作用のためのラベルフリー定量プロテオミクスワークフロー

我々は、データの前処理、共発現クラスタリング、経路濃縮、タンパク質間相互作用ネットワーク解析を含む詳細なプロトコルを用いて、定量的プロテオミクスデータのネットワーク解析を実行および視覚化するためのシステム生物学ツールJUMPnを提示する。...

JUMPn:プロテオミクスにおけるタンパク質共発現クラスタリングとネットワーク解析のための合理化されたアプリケーション

ここでは、AT4G18020(APRR2)-AirIDタンパク質をモデルとして、キュウリ(Cucumis sativus...

植物におけるタンパク質間相互作用のためのAirIDベースの近接標識

膜接触部位(MCS)を研究するための新しいアプローチの必要性は、これらの細胞構造とその構成要素の研究への関心の高まりにより高まっています。ここでは、MCSに存在するオルガネラ内およびオルガネラ間タンパク質複合体を同定および定量するために、以前に利用可能であった顕微鏡技術を統合したプロトコルを紹介します。...

近接ライゲーションアッセイによるER-ミトコンドリア接触部位における内因性オルガネラ内タンパク質相互作用の可視化と定量

この研究では、ビオチン補給や卵巣解剖から、質量分析のためのビオチン化ペプチドの導入遺伝子発現検証や濃縮までのステップをカバーする、 D. melanogaster 卵巣におけるTurboIDベースの近接標識(PL)の詳細なプロトコルを確立します。...

インビボTurboIDに基づく近接ラベリングのDrosophila melanogasterへの応用

ここでは、化学プローブと質量分析を使用して、天然細胞および組織からの疾患特異的タンパク質間相互作用の捕捉と同定を可能にするプロトコルを提示します。得られた相互作用データセットは、専用のWebベースのプラットフォームを介して分析され、動的なネットワーク機能不全と疾患に関連する経路の変化を明らかにします。...

疾患における機能不全タンパク質間相互作用のマッピング

学ぶ近接標識プロテオミクスを用いたヒトiPSC由来ニューロンにおけるリソソーム微小環境の解析法。ライブ細胞でリソソーム膜タンパク質と相互作用を定量化し、脳疾患の分子標的発見に貢献する。

近接標識プロテオミクスを用いたニューロンリソソームインタラクトームの特性評価

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