Name: 陽電子放射断層撮影法を用いた実験的自己免疫性脳脊髄炎マウスモデルにおけるCD19+ B細胞のイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T12:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学ぶPETイメージングによる実験的自己免疫性脳脊髄炎マウスモデルにおけるCD19⁺ B細胞の動態解析。抗CD19抗体を用いた放射性標識法で中枢神経系のB細胞を可視化し、高精度な脊髄シグナル定量が可能です。

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スタンフォード大学のSCi3小動物イメージング施設と、PET/CTに関する技術支援をしてくれたFrezghi Habte博士に感謝しています。 LC-MSは、スタンフォード大学質量分析(SUMS)コア施設のコアスタッフによって行われており、このサービスを提供してくれたスタッフに感謝します。hCD19-mAbを提供してくださったHorizon Therapeutics社、特に技術指導とサポートをいただいたJodi Karnell社に感謝します。この研究は、NIH NINDS (1 R01 NS114220-01A1) から資金提供を受けました。

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<li>Chen, D., Gallagher, S., Monson, N. L., Herbst, R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inebilizumab%2C+a+B+cell-depleting+anti-CD19+antibody+for+the+treatment+of+autoimmune+neurological+diseases%3A+Insights+from+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inebilizumab, a B cell-depleting anti-CD19 antibody for the treatment of autoimmune neurological diseases: Insights from preclinical studies.</a> Journal of Clinical Medicine. 5 (12), 107(2016).</li>
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<li>Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+imaging+of+neuroinflammation+using+%5B11C%5DDPA-713+in+a+mouse+model+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PET imaging of neuroinflammation using [11C]DPA-713 in a mouse model of ischemic stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57243(2018).</li>
<li>Lyons, J. -A., Ramsbottom, M. J., Cross, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+antigen-specific+antibody+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+induced+by+recombinant+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Critical role of antigen-specific antibody in experimental autoimmune encephalomyelitis induced by recombinant myelin oligodendrocyte glycoprotein.</a> European Journal of Immunology. 32 (7), 1905-1913 (2002).</li>
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<li>James, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+B+cells+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis+using+64Cu-Rituximab+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging B cells in a mouse model of multiple sclerosis using 64Cu-Rituximab PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1845-1851 (2017).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-mediated+methodology+for+the+site-specific+radiolabeling+of+antibodies+based+on+catalyst-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).</li>
<li>Lyons, J. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+are+critical+to+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+by+protein+but+not+by+a+short+encephalitogenic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells are critical to induction of experimental allergic encephalomyelitis by protein but not by a short encephalitogenic peptide.</a> European Journal of Immunology. 29 (11), 3432-3439 (1999).</li>
</ol>

CD19抗体はHorizon Therapeutics社から提供されました。

本稿では、CD19-PETを用いたMSマウスモデルにおけるヒトCD19+ B細胞のイメージングの合理化された方法について説明します。多発性硬化症の症状は不均一であり、治療に対する反応も異なるため、診療所でのその管理は困難な場合があり、治療法の選択とモニタリングのための新しいアプローチが非常に必要とされています。PETイメージングは、疾患の進行とB細胞枯渇療法に対する個々の反応をモニタリングするための強力なツールとして役立つ可能性があります。MSに加えて、CD19-PETイメージングは、リンパ腫および白血病または他のB細胞媒介性疾患のサブタイプにおける治療後のB細胞枯渇のモニタリングに使用できる。このプロトコルと代表的なデータは、神経疾患におけるイメージングB細胞の有用性を示しています。
MSの文脈でヒトCD19+ B細胞を研究するために、我々はB細胞依存性MOG1-125 EAEモデル7を選択しました。他のEAEモデルと同様に、このモデルは進行性の麻痺と中枢神経系への免疫細胞の浸潤の症状を示します。しかし、MOG1-125モデルは、髄膜、脳幹、実質、および心室のくも膜下腔にさまざまな数のB細胞を含むB細胞駆動モデルであるという点で独特です。これらのリンパ球は、これらの領域全体にまばらに散在したり、卵胞のような構造を形成したりすることがあり、MS 8,9のヒトでも観察されます。ナイーブマウスをコントロールとして使用することに加えて、完全なフロイントアジュバント(CFA)のみの誘導キットを使用できます(すなわち、MOGタンパク質を含まないEAEマウスに投与されるものと同じ誘導エマルジョン)。EAEマウスモデルでは、血液脳関門(BBB)が機能不全に陥っており、抗体などのより大きな実体が通過することを可能にしています。CD19-mAb放射性トレーサーは、B細胞が存在する場合にのみ結合してCNSに留まります。トレーサーは、B細胞が存在しない場合、血液プールに循環して戻ります。これは、ガンマカウントと、組織内の放射能レベルを測定する前に灌流することにより、CNS組織のex vivoオートラジオグラフィーを使用して実証しました。また、中枢神経系のB細胞を検出するためのモノクローナル抗体ベースのPET放射トレーサー(免疫PETイメージングアプローチ)の使用を報告した以前の論文でも、このことを実証しています1,2。
DOTAキレート剤は、銅-64標識ペプチドおよび抗体を用いた臨床PETイメージングに使用されてきたため、MS患者の臨床画像にhCD19-mAbを翻訳することを目指しています。DOTAは、in vivoで銅-64に十分な結合親和性を持っています。遊離64Cuが肝臓に行き、結合した放射性トレーサーのシグナルを不明瞭にする可能性があるため、in vivoの安定性は非常に重要です。したがって、肝臓の信号を測定して、他の臓器と比較した相対的な信号を計算することが重要です。筋肉は通常、対照組織として摂取されますが、EAEの場合、筋肉に炎症が存在する可能性があります。64Cu の半減期は 12.7 時間であり、DOTA-hCD19-mAb がターゲットに結合するのに十分な時間を確保しながら、PET でシグナルを測定できます。コンジュゲートを調製する場合は、小規模(75-125 μg)の試験反応を実施して、目的のDOTA/mAb比を生成するためにmAbに添加するDOTAの量を決定する必要があります(たとえば、mol mAbあたり6〜10倍の過剰DOTA-NHS-エステルの反応により、1〜2 DOTA/mAbのコンジュゲートが得られます)。反応時間と温度(例:2〜4時間、または4°Cまたは室温で一晩)もDOTA/mAb比に影響を与えるため、最適化する必要があります。非放射性銅による滴定を実施して、モノクローナル抗体あたりの DOTA の数を計算できます。ただし、より信頼性が高く正確な結果を得るためには、MALDI-MSおよび/またはLC-MSを実行することをお勧めします。
計算された DOTA/mAb 比は、特定のサンプルの平均値であり、多少の変動が予想されます。MALDIの場合、標識モノクローナル抗体と非標識モノクローナル抗体について、サンプルごとに数回のショットが撮影されます。次に、結合型と非結合型の比率を計算して、DOTA/mAb の平均数を決定します。キレート剤が多すぎると抗体結合が阻害され、少なすぎると放射性標識に一貫性がなく、シグナルが低下するため、DOTA/mAb 比は重要です。この比率は、一貫したシグナル強度と結合速度を維持するために、コンジュゲートのバッチ間で非常に近いものでなければなりません。理想的には、特定の研究内のすべての実験に同じコンジュゲートのバッチを使用する必要があります。過剰結合の可能性による免疫反応性への潜在的な影響を低減する有望な手法は、キレート剤結合が抗体の重鎖糖鎖に対して部位選択的であり、mAbあたり1つのキレート剤の添加を保証する部位特異的結合10 を使用することです。
抗体、DOTA/mAb比、 64Cuモル活性の違いなどが放射性標識に影響を与えるため、放射性標識反応条件は、最高の標識効率と収率を確保するために最適化する必要があります。最適な 64の Cu 対 mAb コンジュゲート比を使用すると、放射性トレーサーを精製せずに使用でき、放射性標識に必要な時間や、重力流塔や放射性崩壊による損失を削減できます。また、同じ 64Cuとモノクローナル抗体のコンジュゲート比を用いることで、一貫した信頼性の高いモル活性が得られることがあり、これは、マウスの複数のコホートやイメージング研究で結果を比較する場合に特に重要です。ITLC条件は、各ユーザーに合わせて変更することもできます。精製が必要な場合は、モル活性を計算できるように、HPLCおよび/またはUV/Vis分光光度法用にアリコートを保存する必要があります。
放射性標識抗体をイメージングに使用することは困難な場合があることに注意することが重要です。放射性トレーサーに使用される抗体は、生理学的効果を及ぼさないように生物学的に不活性であることが不可欠です。さらに、抗体は血液中の滞留時間が長いため、画質を損なうことなく適切なシグナル/バックグラウンドを確保するためには、特定のモノクローナル抗体の循環、結合、クリアランスを十分に待つ必要があります。通常、64 Cu標識モノクローナル抗体は20〜48時間待つだけで十分ですが、新しいモノクローナル抗体PETトレーサーを評価する場合は、注入後2、4、6、12、 24、48時間で画像化して、特定のげっ歯類モデルでのイメージングに最適な時点を決定する必要があります。S/B/バックグラウンド比が最も高いARG画像を取得する場合も同様です。このプロトコルの代表的な画像は、注射後18〜20時間で撮影されましたが、使用する放射性同位元素に応じて他の時点を使用できます。CD19の異なるエピトープに結合する抗体が異なれば、結果も異なるため、厳密に特性評価する必要があります。
脊髄信号を解析する際には、マウスをスキャニングベッドに仰向けに寝かせて、呼吸による動きを抑えることが重要です。さらに、仰臥位は、EAE疾患の進行により脊椎の湾曲が増加したマウスの脊椎をまっすぐにするのに役立つ可能性があります。脊椎と脊髄のシグナルを検出することを目指す際に考慮すべきもう一つの重要な側面は、注射部位がこれらの領域に関連する免疫応答のためにトレーサーに結合する可能性があるため、脇腹にMOG1-125 を注入することを避けることです。注射部位が近接していると、脊髄分析が妨げられる可能性があります。したがって、胸部への注射は、本明細書に記載の用途にとって好ましい。
使用される画像解析技術は、CNSイメージングに特化しています。画像解析ソフトウェア内の脳アトラスツールは、PETとCTのレジストレーションが正確である限り、再現性と信頼性の高い結果を提供します。半自動の3D脳アトラスを使用し、各マウスの頭蓋骨に合うように調整することで、動物間で一貫したROIを得ることができます。現在、脊髄の信号を分析するための自動または半自動のアプローチはないため、手動のROIを描画する必要があります。特に、CD19+ B細胞(または骨髄と脊髄の両方に存在する任意の細胞タイプ)を定量する場合、脊柱と骨髄から生じるシグナルを可能な限り排除することが重要です。その理由は、ナイーブマウスはEAEマウスよりも多くのCD19+ B細胞を骨髄に含んでいることが知られており、B細胞は末梢を離れて中枢神経系に浸潤するためである5,11。この骨髄信号は、脊髄の真の信号を不明瞭にする可能性があります。
脊柱と骨髄からの信号の寄与を最小限に抑えながら、真の脊髄信号を描写するために、CT画像のOtsu閾値を使用して、脊柱の不変のROIを作成できます。その後、別の脊髄ROIを脊柱内に容易に描くことができる。同じ手法を大腿骨の骨髄測定にも適用できます。これは、脊髄におけるトレーサー結合に関する洞察を得るのに非常に有用な方法です。しかし、PETの空間分解能は比較的低く、マウスの小さな解剖学的領域をスキャンする際の部分体積効果に関する問題があるため、追加の ex vivo 確認技術(ガンマカウント、ARGなど)を使用すると、血液、脳脊髄液、または脊柱からの漏れ出るシグナルの存在なしに、脊髄における放射性トレーサー結合の検証が可能になります。
EAEマウスでは、子宮頸部/胸部脊髄のシグナルは、疾患の重症度や獲得免疫応答中に浸潤するB細胞の数によって変化する傾向があります。浸潤するB細胞の数のこの変動、およびナイーブマウスの骨盤/脊髄骨髄のB細胞と比較してCNSのB細胞の量が少ないため、マウスでは脊髄組織の in vivo 定量が困難になる可能性があります。小動物イメージングにおけるPETの空間分解能を考えると、骨髄からの信号が脊髄信号にこぼれる可能性があります。ここで完了した生体 外生体 内分布とオートラジオグラフィーは、椎骨と脊髄組織のPET信号を検証するのに役立ちます。マウスは解剖前に灌流され、血液プール中の結合していないトレーサーを除去し、ガンマカウントとオートラジオグラフィーの結果が、臓器の血液プールにあるトレーサーではなく、各臓器に実際に結合しているトレーサーを反映するようにします。
放射性トレーサーは血液中を循環し、特に抗体トレーサーでは、最初の注射後数週間は血液中に結合していない放射性トレーサーが存在することがよくあります。多くの血管を持つ脳や脊髄を画像化しているため、信号のどの部分が本当に目的の脳/組織でのトレーサー結合によるものか、血液プールに存在するものかを理解することが重要です。したがって、脳信号を心臓/血液プールの信号で分割する必要があります。臨床現場では、脊椎の大津閾値や脊髄組織のROIと同じ画像解析技術を定量化に用いることができます。ヒトではマウスに比べて組織体積が大きいため、部分的な体積効果による影響は大幅に少なくなり、精度が向上し、in vivo所見を確認するためのex vivo技術の必要性がなくなります。クリニックでのPETの使用により、臨床医は個々のB細胞負荷に応じて各患者の治療をパーソナライズすることができます。
ARGは、脳幹や小脳などの小さな領域におけるトレーサー結合の空間的位置をより正確に描写できる高解像度画像の取得に特に有用です。同じ切片および/または隣接する切片を免疫組織化学的染色のために保存し、B細胞の存在を確認することができます。我々は以前、中枢神経系組織をCD45R/B220(補足図S1)で染色し、B細胞の数をPETおよびARGシグナルと相関させた5,9。次に、染色をARGの結果と空間的に比較して、放射性トレーサーシグナルが染色パターンと一致することを確認できます。B細胞は、脳幹全体にクラスター状に存在することもあれば、びまん性に存在することもあります。PET感度はシグナルを測定するのに十分高く、臨床翻訳に有利です。脊髄ARGの場合、椎骨から脊髄を取り除くことで、測定された信号が骨髄や血液ではなく、脊髄組織でのトレーサー結合によるものであることが保証されます。
ARGと同様に、 ex vivo ガンマカウンティングは、個々の臓器における放射性シグナルの定量化を可能にします。この特定の技術では、チューブをガンマカウンターに配置する前に、組織の湿重量を測定し、それらがそれぞれのチューブの底にあることを確認することが重要です。チューブには、正しいチューブが使用されるように、マウス番号と組織をラベル付けする必要があります。次に、チューブを校正された天びんで計量し、臓器をマイクログラム(0.0001 mg)の最も近い10分の1まで挿入します。組織によっては極端に小さく、前後のチューブ質量の差は0.0001mg程度になります。解剖後すぐに組織を計量して、水分の損失を防ぎ、質量を減少させる必要があります。計量後、脳と脊髄の管をPBSで満たして乾燥を防ぎ、これらの組織をARG用に凍結する必要があります。

多発性硬化症は免疫介在性神経障害です。各患者のユニークな症状は、患者と臨床医の両方にとって管理を困難にする可能性があります1。この疾患自体は、脱髄病変の存在と脳および脊髄における免疫細胞浸潤を特徴とし、身体的および認知的障害をもたらす2。多発性硬化症がT細胞媒介性疾患であるという従来のパラダイムは、B細胞のCD20+サブセットを標的とする治療法であるリツキシマブ3の画期的な第II相臨床試験で初めて挑戦されました。その後、より広い範囲のB細胞に発現する汎B細胞バイオマーカーであるCD194を標的とする追加のB細胞療法が開発されており、診断的にも治療的にも有利です。さらに、治療効果を評価する既存の方法(すなわち、再発回数と磁気共鳴画像法[MRI]活動のモニタリング)では、反応の早期測定ができないため、患者は最適ではない治療法の選択と最適化により、CNS損傷の重大なリスクにさらされます。したがって、中枢神経系およびMS患者の末梢において、CD19+ B細胞などの特定の免疫細胞をリアルタイムで監視する戦略が決定的に必要とされています。
PETイメージングは、CD19などの特定の標的を in vivoで 全身に可視化できる堅牢なイメージング技術です。採血、再発率の記録、MRI による 病変モニタリングは、治療効果のスナップショットを提供しますが、PETイメージングにより、研究者や臨床医は全身で治療の有効性を監視できます。治療モニタリングに対するこの積極的なアプローチにより、臨床医は投薬効果をリアルタイムで評価し、必要に応じて迅速な調整が可能になります。疾患に関連する細胞集団の位置と密度をモニタリングすることで、患者固有の解剖学的情報を使用して重症度の縦断的評価も可能になります。したがって、臨床および前臨床の現場でPETイメージングの可能性を確実に最大限に引き出すために、再現性のある分析法を確立することが不可欠です。
この論文では、ヒト組換えミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質1-125(MOG1-125)を用いて、ヒトCD19(hCD19)を発現するトランスジェニックマウスで誘導されたMSの実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)マウスモデルにおいて、16C4-TM(64 Cu-hCD19-mAb)として知られる64Cu標識抗ヒトCD19モノクローナル抗体(mAb)を用いてCD19+ B細胞のPETイメージング、ex vivoガンマカウント、およびオートラジオグラフィー(ARG)を行う方法(図1)について説明します).また、脳と脊髄における放射性トレーサーの結合を正確かつ再現性よく評価する方法も提供しており、このモデルや他の神経変性モデルでしばしば深刻な影響を受ける病因の重要な部位です。これらの技術は、疾患の病理学におけるB細胞の役割の非侵襲的な研究を可能にし、MSにおける抗B細胞療法の有効性を評価するために臨床的に翻訳される可能性を秘めています。

<table><tbody><tr><td>0.5 mL 50 kDa MWCO 遠心フィルター</td><td>MiliporeSigma</td><td>UFC505008</td><td>遠心フィルター</td></tr><tr><td>64Cu-CuCl3</td>ワシントン<td>大学 セントルイス;ウィソンシン大学、マディソン;または別の</td>ベンダーAR-2000<td></td><td></td></tr><tr><td>ラジオTLCイメージング</td><td>スキャナーEckert&Ziegler</td><td>AR-2000</td><td></td></tr>オート<tr><td>ラジオグラフィーカセット</td><td>コールパー</td><td>マーEW-21700-34</td><td>アルミニウム、8 "x 10"</td></tr><tr><td>オートラジオグラフィーフィルム</td><td>&nbsp;GEライフサイエンス</td><td>28-9564-78</td><td>ストレージ蛍光体スクリーン BAS-IP SR 2025 E 超解像、20 x 25 cm、スクリーンのみ</td></tr><tr><td>バタフライニードルカテーテル</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>BLF-24</td><td></td></tr><tr><td>DOTA-NHS-ester</td><td>Macrocyclics</td><td>B-280</td><td></td></tr><tr><td>EAE Induction Kit</td><td>Hooke Laboratories</td><td>EK-2160</td><td></td></tr><tr><td>Geiger Counter</td><td>Ludlum</td><td>14C</td><td></td></tr><tr><td>GNEXT PET/CT スキャナー</td><td>ソフィー</td><td>GNEXT</td><td></td></tr><tr><td>Hidex 自動ガンマカウンター</td><td>Hidex</td><td>AMG</td><td></td></tr><tr><td>HPLC カラム</td><td>フェノメネックス</td><td>&nbsp;00H-2146-K0</td><td>5 &mu;m SEC-s3000 400 &Aring;, 300 x 7.8 mm</td></tr><tr><td>Illustra NAP-5 カラム</td><td>Cytiva</td><td>17085301</td><td>DNA 重力カラム</td></tr><tr><td>画像 J</td><td>NIH</td><td></td><td>ARG 解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>Low Protein Binding Collection Tubes (1.5 mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI90410</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite 分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>840281400</td><td>UV-Vis マイクロ/ナノ分光光度計</td></tr><tr><td>PCR チューブ 0.2 mL、DNA グレード</td><td>Eppendorf</td><td>30124707</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 蛍光体イメージャー用 9410</td><td>GE Healthcare</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>VivoQuant</td><td>Invicro</td><td>バージョン 4 パッチ 3</td><td>PET 分析ソフトウェア、Brain Atlas Add-on</td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalting Columns、7K MWCO、0.5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI89882</td><td>Desalting カラム</td></tr>の購入が必要</tbody></table>

陽電子放射断層撮影法を用いた実験的自己免疫性脳脊髄炎マウスモデルにおけるcd19+ b細胞のイメージング

Imaging CD19+ B Cells in an Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mouse Model using Positron Emission Tomography

多発性硬化症(MS)は、若年成人が罹患する最も一般的な脱髄性中枢神経系(CNS)疾患であり、疾患が進行するにつれて神経学的欠損や障害を引き起こすことがよくあります。Bリンパ球は、多発性硬化症の病理学において複雑かつ重要な役割を担っており、臨床試験においていくつかの治療薬の標的となっています。現在、特定の抗B細胞療法の患者を正確に選択する方法や、これらの治療が中枢神経系および末梢臓器のB細胞負荷に及ぼす影響を非侵襲的に定量化する方法はありません。陽電子放射断層撮影(PET)イメージングは、生体内のB細胞の時空間分布と負荷に関する非常に特異的で定量的な情報を提供する大きな可能性を秘めています。
この論文では、ヒト組換えミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質1-125で誘導されるMS、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の確立されたB細胞駆動マウスモデルにおいて、ヒトCD19 + B細胞に特異的なPETトレーサーを合成および使用する方法を報告します。ここでは、in vivo PETイメージングを用いて、脳および脊髄のCD19+ B細胞を検出および定量するための最適化された技術について説明します。さらに、この論文では、骨髄、脊髄、脾臓などの疾患関連臓器のex vivoガンマカウントの合理化された方法と、CNS組織におけるCD19トレーサー結合の高解像度オートラジオグラフィーについて報告します。

hCD19-mAb は、図 2 に示すように、DOTA 標識され、64Cu で放射性標識されました。EAEおよびナイーブマウスは、64 Cu-DOTA-hCD19-mAbを注入してから18〜24時間後にPET/CTスキャン(図3)を受けました。PET/CT画像はPET解析ソフトウェアを用いて同時登録し、中枢神経系組織は手動ROIまたは半自動3D脳アトラスを用いて解析した。ROIにおける放射性トレーサーの結合(図4)は、ナイーブマウスよりもEAEマウスの方が高かった。Ex vivoガンマカウントとARGは、ナイーブマウスと比較して、EAEマウスの脊髄(腰椎と頸部の両方の胸部セグメント)と脳(ARGのみ)での結合の増加を示しました(図5および図6)。灌流マウスのex vivoガンマカウントでは、脾臓、大腿骨、骨髄などの末梢臓器における放射性トレーサー結合の減少も示され(図5)、このEAEモデルではB細胞が末梢を離れて中枢神経系に浸潤することと一致しています。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig02.jpg"> 図2:品質管理データに加えて、64個のCu標識ヒト特異的CD19モノクローナル抗体である16C4-TM mAb(64Cu-DOTA-hCD19-mAb)を生成するための標識および放射性標識スキーム。 (A)DOTA-NHS-エステルとhCD19モノクローナル抗体の反応によるhCD19-DOTAコンジュゲート(スケールではない)の産生、および64 Cu-CuCl3による放射性標識による64Cu-DOTA-hCD19-mAbの産生。(B)代表的なITLCクロマトグラフ。40〜60cmのピークは放射性標識抗体です。非結合の 64Cu-CuCl3 は移動相とともに移動し、200 〜 240 cm で存在します。このクロマトグラフには、検出可能な遊離 64Cu-CuCl3 は含まれていません。(C)放射性標識抗体の品質管理仕様。略語:DOTA-NHSエステル= 1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸モノ-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル;ITLC / HPLC =インスタント薄層クロマトグラフィー/高速液体クロマトグラフィー。MALDI/LC-MS = マトリックス支援レーザー脱離/イオン化/液体クロマトグラフィー-質量分析;CPM = 1分あたりのカウント数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig03.jpg"> 図3:PETスキャナー内の3Dプリントベッドにマウスを固定し、動きを最小限に抑えながら脊髄と脳の高品質イメージングを可能にする方法を示す写真。 (A)発熱体と麻酔チューブを備えた3Dプリントされた4匹のマウススキャナーベッド(「マウスホテル」とも呼ばれる)。(b)脊椎の真直度を最大化するために仰臥位で麻酔をかけたマウス、各マウスのベッド位置が記録されます。(C)マウスは、頭部にテープを貼って脳内の動きを最小限にし、腹部を横切って呼吸に影響を及ぼすことなく呼吸による動きを最小限にした。(D)マウスベッドをスキャナー内に配置し、スキャンベッドにテープで固定します。麻酔チューブはスキャナーからベッドに接続され、イソフルランは2%に設定されました。マウスの呼吸をモニターし、適切なイソフルラン濃度を確認してからスキャナーのドアを閉めました。略語:PET = 陽電子放出断層撮影法。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig04.jpg"> 図4:PET解析ソフトを用いた脊髄画像と脳の解析結果。 (A) i) 腰椎を胸椎および頸椎から分離し、大津閾値処理用の画像を準備するために脊椎に描画された ROI (ピンクと黄褐色)。 ii )脊椎(ターコイズブルーと赤)は、Otsu Thresholdingを使用してセグメント化されました。 iii) 次に、椎骨を3D ROIメニューで不変にし、脊髄を頸椎/胸椎(紫色)と腰椎(海軍)のROIに分割しました。 iv) 脊髄ROIを除去し、脊髄ROIと代表的な脳アトラスを適用した。(B)各動物の心臓のROIに正規化された%ID/gとして表されるさまざまなCNS領域からのPET結果の代表的な分析。PET取得は、PET/CTイメージング による 10分間の静的スキャンでした。半自動脳アトラスアプローチを用いて定量化された脳領域(パネル A)。 iv) 代表的な結果は、脳および胸部脊髄におけるトレーサー結合の有意な増加または有意な増加傾向のいずれかを示しています。スチューデントの t検定(*:p &lt; 0.0332)を使用して統計量を算出します。略語:PET =陽電子放出断層撮影法;ROI = 関心領域;CNS = 中枢神経系;CT = コンピュータ断層撮影;%ID / g =組織のグラムあたりの注射量の割合。EAE = 実験的自己免疫性脳脊髄炎。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig05.jpg"> 図5:EAEおよびナイーブマウスのさまざまな臓器における ex vivo ガンマカウントの代表的な定量は、%ID/gで表されます。 PETスキャン後、マウスにPBSを灌流して、血液中に存在する放射性トレーサー(遊離細胞または血液常在性CD19+ B細胞に結合)を除去し、臓器を迅速に解剖して、各臓器の正確な重量を持つように重量を量りました。EAEマウスの脾臓および骨髄におけるトレーサー結合は、ナイーブマウスと比較して有意に低下する。放射性トレーサー結合の増加は、EAEマウスの腰椎および頸椎/胸部脊髄セグメントの両方で観察されます。脳は放射性トレーサー信号の有意な増加を示しませんが、有意な増加傾向にあります。スチューデントの t検定(*:p &lt; 0.0332; ****: p &lt; 0.0001)を使用して統計量を算出します。略語:PET =陽電子放出断層撮影法;%ID / g =組織のグラムあたりの注射量の割合。EAE = 実験的自己免疫性脳脊髄炎;PBS = リン酸緩衝生理食塩水。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig06.jpg"> 図6: Ex vivo ARG画像は、ナイーブマウスと比較したEAEの矢状脳切片および脊髄全体における 64個のCu-DOTA-hCD19-mAb結合を示しています。 デジタル蛍光体記録フィルムは、放射性組織サンプルに約10半減期(127時間または5日)曝露した後、蛍光体イメージャーを使用してスキャンしました。得られた画像は、ナイーブマウスの脳切片と比較して、EAEマウスの脳内の信号が視覚的に高いことを示しており、これは、このモデル5でB細胞を含むことが知られている領域のために予想される。具体的には、EAEマウスの脳切片の脳幹、小脳、および心室でトレーサーシグナルが増加しています。EAEマウスの脳切片に対するシグナルのこの増加は、上記の全脳PET定量で見出されたものを反映しています。同様に、ナイーブな脊髄と比較して、頸椎/胸部および腰椎の両方の脊髄セグメントで放射性トレーサー結合が増加しており、ex vivo γカウントを使用して発見されたことを反映しています。略語:PET =陽電子放出断層撮影法;EAE = 実験的自己免疫性脳脊髄炎;ベント=心室;Cb =小脳;BS =脳幹;TSc = 胸部脊髄と頸部脊髄の組み合わせ。LSc = 腰椎脊髄。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S1:ナイーブマウスおよびEAEマウス脳組織のCNS組織をCD45R/B220で染色 。B細胞は、EAEマウスの脳幹、髄膜、および白質で観察されます(n = 7 EAE、n = 5 naive マウス、1匹あたり平均4スライス)。この図は 5のものです。スケールバー = 矢状脳画像では 5 mm (低倍率 [1x])、脳幹、髄膜、小脳白質では 100 μm (高倍率 [20x])。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/Suppl%20Fig%201.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

この論文では、ヒト特異的抗CD19モノクローナル抗体の放射性標識法と、 in vivo PETイメージング、 ex vivo ガンマカウント、およびオートラジオグラフィーアプローチを用いて、多発性硬化症のマウスモデルの中枢神経系および末梢組織のB細胞を定量する方法について詳しく説明します。

陽電子放射断層撮影法を用いた実験的自己免疫性脳脊髄炎マウスモデルにおけるCD19+ B細胞のイメージング

Multiple sclerosis (MS) is the most common demyelinating central nervous system (CNS) disease affecting young adults, often resulting in neurological ...

PETイメージングを用いて、中枢神経系におけるB細胞のin vivo分布と動態を解明する手法です。私たちのアプローチは、脊髄が罹患しているため分析が困難になる神経疾患の研究に有益です。このように、私たちの手法にはいくつかの主な利点があります。まず、汎B細胞バイオマーカーを追跡するための新しいツールを作成し、さまざまなB細胞サブセットを捕捉し、in vivoで可視化できるようにしました。第二に、私たちの脊髄分析法は、この領域のPET信号の高精度で再現性の高い定量を可能にします。私たちの技術の素晴らしいところは、病気にとらわれないことです。前臨床から臨床まで、B細胞や脊髄が関心のあるあらゆるシナリオで使用できます。放射性標識を行い、抗体をマウスに注入してから18〜24時間後に、眼球ゲルを眼に塗布してマウスをスキャン用に準備します。4匹のマウススキャニングベッドに、イソフルランを1.5〜2%に設定した加熱パッドが装備されていることを確認するマウスをスキャニングベッドの仰臥位に置き、マウスの尾をそっと引いて背骨をまっすぐにします。マウスが仰臥位になったら、頭と腹に柔らかい顕微鏡テープでしっかりとテープを貼り、呼吸による動きを最小限に抑えます。各マウスのスキャン位置を実験ノートに記録します。第1グループを確保したら、ベッドを閉じ、CTスキャンを実行してベッドの配置を確認します。CTセンターフィールドオブビューをクリックし、ベッドが所定の位置に配置されたら、CTテストスキャンを実行して、配置が正しいことを確認します。ベッドの位置が満足のいくものになるまで繰り返します。スキャナーベッドに小さな白いテープを貼って、研究の残りの部分の正しいベッドの位置をマークします。モーションコントローラーメニューを開き、PETセンターフィールドオブビューをクリックして、マウスをPETリングに移動します。ベッドがPETリングに入ったら、[実行]をクリックしてスキャンシーケンスを開始し、スキャナーが自動的にPETスキャンを完了するのを待ち、PETリングからCTに移動してCTを取得します。実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、病気の進行により脊椎の湾曲が顕著であるため、背中からスキャンすることで脊椎をまっすぐにすることができます。動物の背側を切開し、皮膚と毛皮を取り除き、脊柱を露出させます。首の脊柱、胸郭の真下、骨盤の上部を通る3つの横面に沿って切断し、腰椎を頸部および胸部から分離します。セグメント化された脊柱を慎重に取り外して、腰椎と頸椎胸部の2つの部分を取得します。次に、腰椎脊髄が見えるまで脊柱を骨盤端から慎重にトリミングすることにより、腰椎脊柱を分離します。腰椎脊髄を排出するには、PBSを充填したスリップチップシリンジを使用し、親指と人差し指を使用してシリンジと脊柱の間にシールを作成します。PBSをシリンジにそっと押し込んで脊髄を吸収パッドに排出し、シリンジを子宮頸部側から挿入して頸部胸脊髄についても繰り返します。脊髄組織をガンマカウントチューブに入れます。乾燥重量を記録し、PBSを添加して、組織がチューブの底にあることを確認し、乾燥を防ぎます。カウントの準備ができるまでチューブを氷の上に置きます。脊髄の関心領域の解析を開始するには、ナビゲーションメニューから 3D 関心領域ツールを開きます。[関心領域] ヘッダーで、メニューの下部にあるプラス記号を使用して、腰部関心領域、頸部胸部関心領域、腰骨格、胸骨格、腰部脊髄、胸部脊髄の 6 つの関心領域を作成します。PET信号からの視覚的な干渉を避けるために、F3をクリックしてPETをオフにします。3D Region of Interest Tool Operatorの上部に移動し、カーソル記号の右側にある実線の点をクリックして、3Dペイントモードと侵食/拡張メニューを開きます。[球体] を選択し、サイズを 20 ピクセルに変更します。同様に、拡張をプラス 5 に設定します。先に進む前に、メニューの下部に移動し、関心のある腰椎領域が選択されていることを確認してください。CTで、脊柱のL6椎骨を見つけます。L6より上の1つの椎骨から始めて、腰の上の5つの椎骨の上に大まかな腰椎領域を描きます。次に、頸部胸部の関心領域に切り替え、脊椎の残りの部分を頭蓋骨の基部までトレースします。ジェネラライズされた関心領域を描画した後、演算子の上部に移動し、[セグメンテーション アルゴリズム] メニューを選択します。ドロップダウンメニューからOtsu Thresholdingを選択し、入力に腰椎の関心領域を選択し、メニューの下部で腰椎骨格が選択されていることを確認します。[画像]の横のドロップダウンメニューで、CTスキャンが選択されていることを確認します(ここでは数字のゼロで示されています)。[適用]をクリックし、頸部胸部関心領域と胸部骨格の手順を繰り返します。Otsu Thresholdingを使用してスケルトン関心領域を作成した後、ナビゲーションメニューに戻り、関心領域を削除するか、粗い腰椎と頸部胸部の両方の関心領域のH列にチェックマークを付けて非表示にします。両方の骨格領域の I 列にチェックマークを付け、編集できないようにします。最後に、[3D 関心領域ツール](3D Region of Interest Tool)オペレータの上部に戻り、[3D ペイント](3D Paint)メニューに移動して、脊髄の関心領域を描画します。球体ツールを再度選択し、腰椎と胸椎の両方の骨格内の脊髄をトレースし、メニューの下部で正しい関心領域が選択されていることを確認します。関心領域を消去するには、コマンド/コントロールをクリックし、消去する部分に描画します。3 つの平面すべてから脊髄の関心領域をチェックして、関心領域が脊柱の外側に描画されていないことを確認します。PET信号がオフになっていた場合は、関心領域が描かれた後にF3を押してPETをオンに戻すか、ビジュアルコントローラーを選択してPETバーをクリックします。ナビゲーションメニューに戻ります。グリッドアイコンをクリックしてテーブルを表示します。表を表計算ソフトにコピーし、ファイルを保存します。PETイメージングにより、EAEマウスの脳および胸部脊髄における放射性トレーサー結合の上昇が、ナイーブマウスと比較して明らかになりました。Ex vivoガンマカウントでは、腰椎と頸部の両方の胸椎セグメント、およびEAEマウスの脳の結合がナイーブと比較して増加しました。ex vivoオートラジオグラフィー画像は、ナイーブマウスと比較して、矢状脳切片、特にEAEマウスの脳幹、小脳、および心室における放射性トレーサー結合の増加を示しました。同様に、ナイーブ脊髄と比較して、EAEマウスの頸部胸部と腰部の両方の脊髄セグメントで放射性トレーサー結合の増加が観察されました。PETイメージングとガンマカウントの後、フローサイトメトリーや免疫組織化学などの分子生物学的手法を用いて、PETシグナルと目的のターゲットとの関係を調べることができます。私たちの技術は、脳卒中、多発性硬化症、その他の自己免疫疾患、癌など、複数の疾患領域におけるB細胞のin vivoの役割について研究者が疑問を呈する道を開きました。

imaging-cd19-b-cells-an-experimental-autoimmune-encephalomyelitis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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このビデオは、ミエリン由来のペプチドにアジュバントを注入して自己反応性T細胞を活性化し、脳に移動することにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発する方法を示しています。百日咳毒素は、血液脳関門の透過性を高めるために投与され、これらのT細胞や他の免疫細胞が脳に入ることを可能にします。これらの免疫細胞は脱髄を引き起こし、神経伝達の障害とEAEの発症につながります。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の生成

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この原稿は、実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルの誘導と採点の方法、およびさまざまな疾患段階におけるフローサイトメトリーと定量的PCRをそれぞれ使用して、リンパ節、脾臓、血液、脊髄の免疫細胞分布とmRNAサイトカインレベルの評価を説明しています。...

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

我々は、in vivoでのライブ生物発光およびSJL / Jマウスにおける多発性硬化症の実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルにおける視神経炎や脳炎の近赤外イメージングのための技術を示します。...

マウスにおける多発性硬化症のEAEモデルにおける視神経炎と脳炎症の生物発光と近赤外イメージング

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生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

本稿は、マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発するプロトコルを提示する。中枢神経系(CNS)における浸潤リンパ球の単離および特徴付けの方法も提示され、リンパ球がCNS自己免疫疾患の発症にどのように関与しているかを示す。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析

このプロトコルは、多発性硬化症の動物モデルにおける陽電子放出断層撮影(PET)イメージングによる インビボ...

多発性硬化症のリゾレシチンラットモデルにおけるイン ビボ 含有量の測定のための陽電子放出断層撮影

このプロトコールは、臨床的に利用可能なプラットフォームを用いて 、インビボで...

[18F]テトラフルオロホウ酸陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影によるキメラ抗原受容体T細胞の動的イメージング

本プロトコルは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を使用し、臨床スコアリングシステムを使用して疾患プロセスをモニタリングするマウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発を記載しています。実験的自己免疫性脳脊髄炎関連症状は、マウス大腿骨マイクロコンピューター断層撮影分析とオープンフィールドテストを使用して分析され、疾患プロセスを包括的に評価します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導と多様な評価指標

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症(MS)の動物モデルであり、ヒトの疾患と強力な体液性自己免疫応答を共有しています。ここでは、EAE免疫マウスの血清中の自己抗体を定量するためのシンプルで柔軟なELISAプロトコルを報告します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎に対するマウスにおける自己反応性抗体の定量化

学ぶPETイメージングによる実験的自己免疫性脳脊髄炎マウスモデルにおけるCD19⁺ B細胞の動態解析。抗CD19抗体を用いた放射性標識法で中枢神経系のB細胞を可視化し、高精度な脊髄シグナル定量が可能です。

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