培養ヒト間葉系幹細胞からの細胞外小胞の単離、特性評価、および治療応用

この手順は、簡便で信頼性の高い間葉系幹細胞由来の細胞外小胞採取の必要性と、研究の翻訳への応用の必要性に対処しました。差動遠心分離による細胞外小胞の収集は、簡単で、容易にスケーラブルで、再現性があり、この分野に役立ちます。細胞外小胞は不明瞭}不明瞭から}間葉系幹細胞は不明瞭です}現代の疾患治療における応用。

私は間違いを恐れません。この操作はシンプルで習得が簡単です。このシンプルなプログラムには、ビデオを通じてより適切に提示できる多くの詳細があります。

まず、間葉系幹細胞を90%以上のコンフルエントまで培養します。各ディッシュの培養液を8 mLのα-MEMを添加したものと交換します。48時間の培養後、培養液を50 mLの遠沈管に完全に集めるために、細胞を均一に増殖させる必要があります。

次に、培養液を800 x gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を1.5 mLコニカルチューブに移し、細胞断片と細胞破片を除去します。上清を16, 000 x gで摂氏4度で30分間遠心分離します。

ピペットを使用して、懸濁液を超遠心チューブに移します。その後、150, 000 x gで摂氏4度で2時間遠心分離します。マイクロベシクルペレットをディッシュあたり50 uLのPBSに再懸濁します。

上清を捨て、エキソソームである残留物を集める。7皿の細胞からエキソソームを50 uLのPBSに再懸濁します。15 mLチューブ中で、1 uLの細胞外小胞を1,499 uLのPBSで希釈し、混合します。

次に、トラッキングアナライザーと互換性のあるソフトウェアを起動します。サンプルセルに蒸留水を満たし、装置がセルチェックを開始できるようにします。準備した標準溶液で機器を校正します。

ソフトウェア検出インターフェイスに表示されるパーティクル数が 50 〜 400 の間、できれば 200 前後であることを確認し、[OK] をクリックします。次に、サンプルセルを5mLの蒸留水ですすいでください。サンプル分析の前に、1 mLの蒸留水でチャネルを洗い流してください。

ソフトウェア検出インターフェイスに表示されるパーティクル数が 10 未満であることを確認します。1.5 mLのコニカルチューブで、細胞外小胞を250 uLのPBSで再懸濁します。別の1.5 mLコニカルチューブで、PKH26色素の作業溶液を調製します。

再懸濁した細胞外小胞を作業溶液と混合します。室温で5分間静置してから、EVが枯渇したFBSを500 uL加えて反応を停止します。マイクロベシクルの場合は、摂氏4度で30分間16, 000 x gで遠心分離します。

上澄み液を捨てる。1 mLのPBSを加えて残留物を洗い流します。再度遠心分離し、上清を捨て、未結合色素を除去する。

マイクロベシクルの場合は、摂氏4度で30分間16, 000 x gで遠心分離します。残留物を200 uLのPBSで再懸濁します。20 uLの懸濁液をスライドに滴下し、蛍光顕微鏡で観察します。

細胞外小胞を200 uLのPBSに再懸濁し、ヘパリン溶液と10:1の容量比で混合します。マウスを尾静脈イメージングシステムに置きます。スイッチを押してレバーを持ち上げます。

尾静脈イラストレーターの助けを借りて、尾静脈を通して細胞外小胞懸濁液の体系的な注射を行います。NTAを用いた粒度分布の解析により、ヒト間葉系幹細胞由来のエクソソームのサイズは40〜335 nmの範囲であり、ピークサイズは約100 nmであることが示されました。また、マイクロベシクルのサイズは50〜445 nmの範囲であり、ピークサイズは150 nmでした。

エキソソームの形態学的特徴は、それらが典型的なカップ形状を示すことを示した。細胞外小胞はPKH26によって効率的に標識され、これは標識ペレットとして肉眼視によって観察され、蛍光顕微鏡によって観察された。間葉系幹細胞の不明瞭な}に保持された放出されたEVを完全に収集するには、細胞を均等に吹き飛ばす必要があるため、上清の収集中はオペレーターに注意を払う必要があります。

注射の成功を検証するために、蛍光標識されたEVの生体分布のin vivoイメージングまたは生着の特定の組織部位の凍結切片を行うことができる。