カエノラブディティス・エレガンスにおける2つの化学物質のペアリングによる嫌悪的連想学習と記憶形成
2022年6月23日
我々はこれまでに、 カエノラブディティス・エレガンスが 、それぞれ質量トレーニングと間隔トレーニングによって短期および長期の連想記憶を形成するためのプロトコルを開発しました。ここでは、1-プロパノールと塩酸をそれぞれ条件刺激と無条件刺激としてペアリングして嫌悪連想記憶を形成することにより、 C.エレガンスの コンディショニングに関する詳細なプロトコルについて説明します。
学習と記憶は、動物が絶えず変化する環境を効率的にナビゲートすることによって生き残り、繁殖するために不可欠です。また、神経科学で研究される主要な科目の1つでもあります。Caenorhabditis elegansは、その神経系の単純さのために学習と記憶の研究のための魅力的な生物です。
その化学的および電気的配線図も完全に再構築されています。Caenorhabditis elegansの行動分析は非常にトリッキーであり、化学的、機械的、温度ストレスなどの多くのパラメータの影響を受けます。まず、0.2ミリリットルの大腸菌OP50液体培養物をLuria-Bertani培地に広げ、室温で24時間以内インキュベートすることにより、6センチメートルの線虫増殖培地またはNGMプレートを準備します。
初日に、プラチナワームピッカーを使用して、6センチメートルのNGMプレートに5匹の十分に給餌された妊娠動物をピックアンド置き、室温で3時間約50個の卵を産ませて、成体動物の同期集団を取得します。産卵を止めるには、プラチナワームピッカーでプレートから親動物を取り除きます。動物を室温で約5日間培養して、若年成人期ではなく成熟成人期に到達します。
5日後、ピペットチップなどのプラスチックの表面への動物の付着を防ぐ1ミリリットルの0.25%水性ゼラチンで各プレートを洗浄することにより、約200匹の成体動物を動物コレクターに集めます。次に、コレクターを10ミリリットルの二重蒸留水で2回ゆっくりと上下に動かして動物を洗います。このプロセスを2回繰り返します。
約200匹の動物を含む動物コレクターを、pH 4の1%1-プロパノールと塩酸の混合物40ミリリットルに結晶化皿に1秒間静かに浸します。コレクター内の動物を、10ミリリットルの二重蒸留水を含む6ウェル組織培養プレートのウェルにコレクターを1回非常に穏やかに浸して洗浄します。次に、コレクターを6センチメートルのNGMプレート上の大腸菌OP50芝生に10分間置き、動物を休ませます。
次に、コレクターをゆっくりと上下に動かして、コレクター内の動物を10ミリリットルの二重蒸留水で洗います。この洗浄を3回繰り返し、走化性アッセイに進む。前に示したように、プロパノール混合物および二重蒸留水でコレクター内の動物をそれぞれ1回ずつ順次洗浄する。
次に、コレクターを6センチメートルのペトリ皿のNGM寒天の上の大腸菌OP50芝生に10分間置き、動物を休ませます。次に、細菌汚染を防ぐために、10ミリリットルの二重蒸留水でコレクターを2回ゆっくりと上下に動かして動物を3回洗浄し、走化性アッセイに進みます。走化性アッセイ用のオーガープレートを6センチメートルのプラスチック製ペトリ皿に準備します。
次に、1ミリメートルを超える開口部を有する切断されたピペットチップを使用して、動物をコレクターから1ミリリットルの0.25%水性ゼラチンを含む2ミリリットルのマイクロ遠心管に移します。動物が重力によってチューブの底に落ち着いた後、チューブから上清を取り除きます。動物を1ミリリットルの走化性アッセイバッファーに再懸濁し、重力によってチューブの底まで約1分間落ち着かせます。
その後、ピペッティングでできるだけ多くの上清を除去します。次に、2か所で4マイクロリットルの5%水性1-プロパノールを斜めにスポットし、次にペトリプレートの他の2か所で4マイクロリットルの二重蒸留水を見つけます。次に、開口部が1ミリメートルの切断ピペットチップを使用して、3つのプレートの中央にある約60匹の動物を含む走化性アッセイバッファーに6マイクロリットルの動物懸濁液を見つけます。
動物に触れずに実験用組織の芯でできるだけ液体を取り除きます。プレートに蓋をし、動物がプレート上で室温で10分間自由に動くようにします。走化性を止めるには、このプレートを氷の上のガラスのペトリ皿に3分間移します。
次に、プレート上の動物の数を数えるまでプレートを冷蔵庫に入れます。実体顕微鏡で中央の円の動物を除く4つのセクションの動物の数を数え、式を使用して走化性指数を計算します。走化性指数値から、基準動物の走化性指数値と馴化動物の走化性指数値との差として学習指標値を計算する。
走化性アッセイでは、1-プロパノールと塩酸の混合物で条件付けられた動物は、寒天プレートにスポットされた5%1-プロパノールに引き付けられませんが、ナイーブ動物と参照動物は5%1-プロパノールに引き付けられました。1-プロパノール水溶液と塩酸の混合物による間隔トレーニングによって調整された動物は、1%1-プロパノールまたは塩酸、または二重蒸留水のみで処理された動物と比較して、5%1-プロパノールに引き付けられなくなりました。.記憶に対する突然変異の影響を研究すると、短期および長期の記憶形成は、動物の古典的な条件付けに不可欠な役割を果たす遺伝子に依存していることが明らかになりました。
各コンディショニングの後、動物は二重蒸留水で一度だけ穏やかに洗われるべきです。この手順を使用して長期記憶が形成された後、カルシウムイメージングと電気生理学は、記憶の原因となる神経回路を特定することができます。遺伝子および単一ニューロン分析を通じて、メモリの保存および検索プロセスを分子レベルおよび単一細胞レベルで対処できます。
概要
本研究では、1-プロパノールおよび塩酸を刺激として用い、Caenorhabditis elegansに嫌悪連想記憶を形成させるための条件付けプロトコルについて記述します。遺伝的要因の役割を調査することで、単純な神経系における短期および長期記憶の形成に関する知見を提供します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 行動解析
- 学習と記憶
背景
- Caenorhabditis elegansは神経系が単純であるため、学習と記憶を研究するための理想的なモデルです。
- 本研究では、連合条件付けを通じて短期記憶と長期記憶の両方を誘発させる戦略に焦点を当てています。
- 学習と記憶は、変化する環境下で動物が生存するために不可欠です。
- 行動はさまざまな外部要因に影響されるため、解析が複雑になります。
研究目的
- C. elegansにおける嫌避記憶の条件付けプロトコルについて説明する。
- 連合記憶の形成における特定の遺伝子の役割を探索する。
- 条件付けが生物の移動行動に及ぼす影響を評価する。
使用した手法
- 実験手順には、NGMプレートでの培養および条件付けのためのさまざまな化学的処理が含まれます。
- 使用される生物学的モデルはC. elegansであり、化学刺激に対する行動応答に焦点を当てています。
- 重要なステップとして、成体個体群の同期化と、それに続く化学走性アッセイが含まれます。
- アッセイに向けた個体の洗浄および条件付けの詳細なプロトコルが記載されています。
- 解析には、顕微鏡下で特定条件における刺激に対する個体の応答数をカウントすることが含まれます。
主な結果
- 条件付けされた動物は1-propanolへの誘引性の低下を示し、嫌悪記憶が正常に形成されたことが示された。
- 長期記憶の形成は、古典的条件付けに不可欠な特定の遺伝的要因に関連していた。
- ナイーブな動物と条件付けされた動物の比較結果から、顕著な行動の違いが強調された。
- 化学走性の応答に基づいた記憶指数の校正が可能となる手法が用いられた。
結論
- 本研究は、単純な神経回路における連合記憶形成プロセスの理解を深めるものである。
- 異なる記憶タイプに寄与する遺伝的基盤を特定し、今後の研究への道を開いた。
- 得られた結果は神経生物学、特に記憶メカニズムの解明において、より広範な意義を持つ。
よくある質問
産業界における重要性
Caenorhabditis elegansにおける連合学習と記憶形成は、行動適応の根底にある分子および神経メカニズムを解析するための、遺伝学的に扱いやすいシステムを提供します。このモデルにより、初期の探索段階において信頼性の高いターゲット検証とメカニズムのリスク低減が可能となり、仮説生成から前臨床研究に至るまでの予測的な連続性が担保されます。このアプローチは、神経生物学に重点を置いたポートフォリオにおいて、堅牢で定量的なリードアウトを求めるバイオファーマチームにとって直接的に有用です。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 定義された遺伝的背景を用いて、学習および記憶経路の解析を可能にする。
- シナプス可塑性と記憶形成に関与する候補遺伝子の機能的検証をサポートする。
- 分子的な摂動と行動表現型を関連付けることで、メカニズムのリスク低減を促進する。
- 個体レベルのコンテキストにおいて、迅速な仮説検証を行うためのプラットフォームを提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 記憶フェノタイプの定量評価に向けた、標準化された化学走性と学習指数を提供します。
- 遺伝学的または薬理学的スクリーニングに適した、再現性のある行動解析を可能にします。
- 規定のプロトコルとコントロールにより、アッセイの拡張性と研究間での比較可能性をサポートします。
- 神経回路を標的とする化合物の後続評価に向け、検証済み生物学的システムを準備します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 保存された記憶経路をモデル化することで、疾患に関連するメカニズムと整合させます。
- 遺伝学的発見から単純な神経回路における機能的検証までの連続性を可能にします。
- 翻訳的ポテンシャルを持つ神経生物学的ターゲットの、リスクを調整した進展をサポートします。
- 前臨床モデルの選択およびバイオマーカー戦略に寄与する機序的な洞察を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期の仮説検証からリード化合物の同定、そして神経生物学プログラムにおける前臨床検証に至るまでの創薬研究の連続的なプロセスに組み込まれています。
- 探索生物学： 記憶関連ターゲットに対する帰無仮説の検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： アッセイ開発および化合物の選別に向けた、再現性のある定量的な行動出力を提供します。
- 分析： 化学走性および学習指数の算出を可能にし、遺伝的条件や治療条件の比較を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ： 分子レベルの知見を個体レベルのシステムにおける機能的な結果へと結びつけます。
- 企業の再利用： 反復的な遺伝学的、薬理学的、または機序的な研究に利用可能な再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用の価値：行動解析アッセイを標準化し、チーム間での再現性と拡張性を確保します。
- 戦略的価値：分子レベルの変化を機能的アウトカムに関連付けることで、意思決定（go/no-go）の精度と資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：神経生物学的ターゲットおよび経路について、リスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 行動神経科学およびC. elegansの遺伝子操作に関する専門知識が必要です。
- 顕微鏡、化学走性アッセイのインフラ、および定量的解析ツールへのアクセスが必要です。
- 条件付けおよびアッセイプロトコルの、チーム間での厳格な標準化が求められます。
- 異なる遺伝的背景や環境条件に合わせて調整が必要な場合があります。
- 行動出力は外部ストレス因子の影響を受ける可能性があるため、慎重な実験的コントロールが必要です。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:43
Preparation of Synchronized Caenorhabditis elegans
2:06
Mass Training for Short-Term Associative Learning and Memory
2:54
Spaced Training for Long-term Associative Learning and Memory
3:27
Chemotaxis Assay
5:47
Results: Aversive Associative Learning and Memory Formation in Caenorhabditis elegans
6:39
Conclusion
