Name: カエノラブディティス・エレガンスにおける2つの化学物質のペアリングによる嫌悪的連想学習と記憶形成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学ぶ Caenorhabditis elegansを用いた嫌悪的連想学習のプロトコル。1-プロパノールと塩酸の化学刺激で条件付けを行い、短期・長期記憶形成の遺伝的要因を解析する神経科学研究手法です。

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村山隆氏、斎田英一郎氏、イオウ・ヴェン・チャン氏、大滝瞳氏の技術支援と原稿へのコメントに感謝いたします。株は、NIH国立研究資源センター(NCRR)によって資金提供されているCaenorhabditis Genetics Centerによって提供されました。この研究は、沖縄科学技術大学院大学からの資金提供を受けて行われました。

1. レシピ
<ol><li>NGM寒天プレート(ステップ2.1)<ol><li>6 cm NGMプレートを調製するには、2.5 gのペプトン、3 gのNaCl、および17 gの寒天を850 mLの二重脱イオンH 2 O(ddH2O)に溶解します。ddH2Oで総容量を972 mLにします。</li>
		<li>オートクレーブ後、~65°Cまで冷却し、エタノールに溶解した5 mg/mLコレステロール1 mL、1 M CaCl2 および1 M MgSO4各1 mL、および1 Mリン酸カリウム(pH 6.0)25 mLを加えます。よく混合した後、直径6 cmのペトリ皿にそれぞれ8 mLを分注します。</li>
		<li>蓋付きのプレートを室温(RT)のベンチに1日間保管し、使用するまで冷蔵室のプラスチック製品に保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>10 gのトリプトン、5 gの酵母エキス、および10 gのNaClを1 LのddH 2 Oに溶解して、Luria-Bertani(LB)培地を調製し(ステップ2.1.)、5 N NaOH(数滴)でpHを7.0に調整し、オートクレーブ滅菌します。<ol><li>LB培地に15 gの寒天を加えてLBプレートを調製します。オートクレーブ後、~60°Cまで冷却し、直径9cmのペトリ皿に12mLずつ分注します。プレートは、使用するまで冷蔵室のプラスチック製品に保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>動物コレクターを作るには(ステップ2.4)、透明なアクリル円筒パイプ(長さ3.5 cm、外径3 cm、壁厚2 mm)の底にナイロンメッシュ(30 μmメッシュサイズ)を接着剤で取り付けます。</li>
	<li>0.25%ゼラチン水溶液を作るには(ステップ2.4)、0.25gのゼラチンを100mLのddH2Oに溶解し、オートクレーブ滅菌する。</li>
	<li>走化性アッセイプレート(ステップ5.1。<ol><li>走化性アッセイ用の寒天プレートを作製するには、15 gの寒天をオートクレーブ滅菌により993 mLのddH2Oに溶解し、溶液を~65°Cに冷却します。</li>
		<li>次に、オートクレーブ滅菌した1 M リン酸カリウム(pH 6.0)5 mL、1 M CaCl2 1 mL、および1 M MgSO4 1 mLを寒天溶液に加えます。これらの溶液はすべてオートクレーブ滅菌によって別々に滅菌されます。</li>
		<li>混合溶液10 mLを6 cmのシャーレに分注します。蓋付きのプレートをRTのベンチに2日間置き、使用するまでRTのプラスチック製品で濡れたペーパータオルの上に置きます。これらのプレートは最大10日間使用できます。</li>
	</ol></li>
	<li>走化性アッセイバッファーを作製するには(ステップ5.4)、5 mLの1 Mリン酸カリウム(pH 6.0)、1 mLの1 M CaCl 2、1 mLの1 M MgSO4、および993 mLのddH2Oを混合し、オートクレーブ滅菌によってこれらすべての溶液を別々に滅菌します。</li>
	<li>40 mL CS/US混合溶液(1%水性1-プロパノールおよびHCl [pH 4.0])を作るには(ステップ3.1およびステップ4.1)、0.4 mLの絶対1-プロパノールと4 μLの5 M HCl(最終濃度で0.1 mM)を39.6 mLのddH2Oに加えます。</li>
	<li>ddH 2 Oを作るには、浄水システムで水道水を2倍処理します( 材料表を参照)。</li>
	<li>新鮮なコロニーにつまようじを10 mLのLB培地に接種し、37°Cで7〜8時間インキュベートすることにより、大腸菌OP50の液体培養物(OD600 = ~0.7)を準備します。長期間培養された細菌は、おそらく二次代謝産物のために、コンディショニングの結果に影響を与える可能性があります。</li>
</ol>2.同期Cの準備。 エレガンス
<ol><li>標準的な方法26を用いて、6cmNGMプレート上で動物を培養する(ステップ1.1。NGMプレートは、0.2 mLの 大腸菌 OP50液体培養物をLB培地に広げ(ステップ1.9を参照)、RTで24時間以内インキュベートすることによって調製されます(古い細菌はコンディショニングの結果に影響を与える可能性があります)。 注: C.エレガンスの 学習と記憶は、機械的、化学的、および温度のストレスに非常に敏感です。したがって、動物を培養し、水を含むすべての試薬を維持し、すべてのアッセイを17°C〜20°CのRTで実行することを強くお勧めします。 ボルテックス、ラフピペッティング、遠心分離などの物理的および機械的刺激は避ける必要があります。新鮮な1-プロパノールは、未知の理由で最長で3ヶ月ごとに使用する必要があります。重要なことに、飢餓はコンディショニングの結果に深刻な影響を与える可能性があるため、動物は十分な食物で栽培する必要があります。</li>
	<li>1日目に、十分に給餌された5匹の妊娠動物を選び(ゆっくりと産卵する変異動物を4匹の6 cm NGMプレートのそれぞれに白金ワームピッカーで置き、RTで3時間~50個の卵を産ませて、成体動物の同期集団を取得します。プラチナワームピッカーでプレートから親動物を取り除くことによって産卵を停止します。 注:動物へのストレスを最小限に抑えるために、播種したプレートはRTに保つ必要があります。</li>
	<li>RTで動物を約5日間培養しますが、これは動物が若年成人期ではなく成熟した成体段階に達するのにかかる時間です。 注:若い成体動物は成熟した成体動物よりもコンディショニングに使用される化学物質に敏感であるため、4.5日から5.5日までの培養期間は条件に応じて調整する必要があります(補足図1)。コンディショニング後、若い成体動物はより低い走化性指数(CI)値を示す可能性があります。.</li>
	<li>動物コレクターに~200匹の成体動物を集め(ステップ1.4を参照)、各プレートを1 mLの0.25%水性ゼラチンで洗浄します(ステップ1.4)。この水性ゼラチンは、ピペットチップなどのプラスチックの表面への動物の付着を防ぎます。</li>
	<li>コレクター内の動物をddH 2 Oで洗浄し(ステップ1.8.)、~10 mLのddH 2 Oでコレクターを2倍に軽く上下に動かします。 細菌汚染を防ぐために、このプロセスを~10 mLのddH 2 Oでさらに2倍(合計3倍)繰り返します。 注:細菌汚染は動物の走化性に深刻な影響を及ぼします。</li>
</ol>3.短期連想学習と記憶のためのマストレーニング
注: 一括トレーニングのワークフローについては、 図 1 を参照してください。
<ol><li>~200匹の動物を含む動物コレクターを、1%1-プロパノールとHClの混合物40 mL(1-プロパノールと混合した後のpH 4.0、ステップ1.7を参照)に~1秒間結晶化皿に静かに浸します。 注:対照動物についても同じことを行いますが、1%水性1-プロパノールにのみ浸します。HCl(pH 4.0)の動物を別の対照としてのみ治療する方が良いでしょう。</li>
	<li>コレクター1xを6ウェル組織培養プレートのウェル内の10mLのddH2Oに非常に穏やかに浸漬することにより、コレクター内の動物を洗浄する。 注意: この洗浄ステップは非常に穏やかでなければならず、長時間の洗浄は学習を妨げる可能性があるため、1回だけ実行する必要があります。</li>
	<li>手順 3.1 を繰り返します。および3.2。中断なしで10倍(トライアル間隔[ITI]、0分)。 注意: RTでは毎回新しいddH2Oを使用してください。</li>
	<li>動物を休ませるために、コレクターを6 cm NGMプレートの上の 大腸菌 OP50芝生にRTで10分間置きます。</li>
	<li>コレクター内の動物をddH 2 Oで洗浄し、コレクターを~10 mLのddH2Oで2倍に軽く上下に動かします。 細菌汚染を防ぐために、このプロセスをそれぞれ~10 mLのddH 2 Oでさらに2倍(合計3倍)繰り返します。</li>
	<li>以下に説明するように走化性アッセイに進む(ステップ5)。</li>
</ol>4.長期連想学習と記憶のための間隔トレーニング
注: 間隔を空けたトレーニング ワークフローについては、 図 2 を参照してください。
<ol><li>~200匹の動物を含む動物コレクターを、1%1-プロパノールとHClの混合物40 mL(1-プロパノールと混合した後のpH 4.0、ステップ1.7を参照)に~1.0秒間結晶化皿に静かに浸します。 注:対照としてのみ1%水性1-プロパノールで同じことを行います。HCl(pH 4.0)の動物を別の対照としてのみ治療する方が良いでしょう。</li>
	<li>コレクター1xを6ウェル組織培養プレートのウェル中の10mLのddH2Oに非常に短時間浸漬することにより、コレクター内の動物を洗浄する。 注意: 長時間の洗浄は学習を妨げる可能性があるため、この洗浄は非常に短くする必要があります。</li>
	<li>動物を休ませるために、直径6 cm(直径)のペトリ皿のNGM寒天プレート上の 大腸菌 OP50芝生にコレクターをRTで10分間置きます。 注:ITIは、動物がLTMの形成のために記憶を統合するために重要であるため、これを10分間休ませます。</li>
	<li>手順 4.1.-4.3 を繰り返します。10倍。</li>
	<li>RTに保たれている~10mLのddH 2 Oでコレクターを2倍にゆっくりと上下に動かして、コレクター内の動物をddH 2 Oで洗います。 細菌汚染を防ぐために、このプロセスをそれぞれ~10 mLのddH 2 Oでさらに2倍(合計3倍)繰り返します。</li>
	<li>後述する走化性アッセイに進む(ステップ5。</li>
</ol>5.走化性アッセイ
<ol><li>走化性アッセイ用の寒天プレートを6 cmのプラスチック製ペトリ皿に調製します(ステップ1.5を参照)。</li>
	<li>プラスチック製のペトリ皿蓋の平らな面に置かれたコレクター内の動物(ステップ2.5)を、>1 mm(内径)の開口部を有する切断ピペットチップを使用して、1mLの0.25%水性ゼラチンを含む2 mLの微量遠心チューブに移します。 注:動物へのせん断応力を最小限に抑えるために、切断されたピペットチップを使用することが重要です。</li>
	<li>動物が重力によってチューブの底に~1分間落ち着いた後、チューブから上清を取り除きます(遠心分離しないでください)。</li>
	<li>動物を1 mLの走化性アッセイバッファーに静かに再懸濁し(ステップ1.6を参照)、重力によってチューブの底に~1分間落ち着かせます(遠心分離しないでください)。ピペッティングでできるだけ多くの上清を取り除きます。</li>
	<li>その間、図3Aに示すように、2箇所に5%水性1-プロパノールの各々4μLを斜めにスポットし、他の2箇所にddH2Oを各々4μLスポットした。1-プロパノールに対する感受性が低い変異体の走化性アッセイでは、補足表1に示すように、ナイーブ変異体の走化性指数(C.I.)値が~0.6になる高濃度の1-プロパノール水溶液を見つけます。 注意: スポッティング手順をできるだけ早く完了することが重要です。スポット5%水性1-プロパノールは1%水性1-プロパノールが弱すぎて走化性アッセイにおいて動物を引き付けることができないからである。対照的に、1%よりも高濃度の水性1−プロパノールで処置された動物はより低いCI値を示すので、コンディショニングに1%水性1−プロパノールを使用する。</li>
	<li>~1.0 mm(内径)の開口部を有する切断ピペットチップを使用して、走化性アッセイ用の3つのプレートの中央に、~60匹の動物を含む走化性アッセイバッファー(ステップ5.4.4.)中の動物懸濁液の6 μL部分を見つけます。動物に触れずに実験用ティッシュ芯でできるだけ液体を取り除き、プレートに蓋をします。 メモ: これらの手順は、できるだけ早く完了することが重要です。</li>
	<li>動物をRTで10分間プレート上を自由に動かし、次にプレートを氷上のガラスペトリ皿に3分間移して走化性を停止させます。次に、プレート上の動物の数を数えるまで、プレートを冷蔵庫に保管します。</li>
	<li>実体顕微鏡下で、中央の円の動物を除く4つのセクションの動物の数を数え、 図3Bに示す式を使用して走化性指数(C.I.)を計算します。C.I.値から、参照動物のC.I.値と馴化動物のC.I.値の差として学習指標(L.I.)値を計算します(L.I.=C.I.参照-C.I.コンディショニング)。 注:参照動物のC.I.値(C.I.参照)は、1%水性1-プロパノールのみでコンフィグレーションされた動物のC.I.値の平均値です。.</li>
</ol>

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<li>Gustafsson, B., Wingstrom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+mechanisms+underlying+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Physiological mechanisms underlying long-term potentiation.</a> Trends in Neuroscience. 11 (4), 156-162 (1988).</li>
<li>Kauer, J. A., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+persistent+postsynaptic+modification+mediates+long-term+potentiation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A persistent postsynaptic modification mediates long-term potentiation in the hippocampus.</a> Neuron. 1 (10), 911-917 (1988).</li>
<li>Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synaptic+model+of+memory%3A+Long-term+potentiation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synaptic model of memory: Long-term potentiation in the hippocampus.</a> Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).</li>
<li>Bailey, C. H., Giustetto, M., Huang, Y. Y., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+heterosynaptic+modulation+essential+for+stabilizing+Hebbian+plasticity+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Is heterosynaptic modulation essential for stabilizing Hebbian plasticity and memory.</a> Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 11-20 (2000).</li>
<li>Miyashita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mg2%2B+block+of+Drosophila+NMDA+receptors+is+required+for+long-term+memory+formation+and+CREB-dependent+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mg2+ block of Drosophila NMDA receptors is required for long-term memory formation and CREB-dependent gene expression.</a> Neuron. 74 (5), 887-898 (2012).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

本研究では、すべての試薬を平均して~18°CのRTに保ち、動物へのストレスを避けるためにRTのベンチで動物を培養しました。さらに、すべての実験手順はRTで実施され、動物は最初に20°Cのインキュベーターで培養され、次にRTの試薬を使用して~24°Cのベンチでコンディショニングされました。これらの条件下では、条件付けの結果は非常に変動した。低RTでは、 C.エレガンスは ゆっくりと成長し、若い成体動物は成熟した成体動物よりもコンディショニングに使用される化学物質に敏感であり、より低いCI値を示す可能性があるため、動物が成熟した成体期に達するまで20°Cよりも長く培養する必要があります。
コンディショニングを成功させるための最も重要なステップは、各化学処理の直後にddH2Oで動物を洗浄することです。したがって、機械的および温度的ストレスは、切断されたピペットチップを使用し、試薬をRTに保ち、動物コレクターをddH2Oで非常にゆっくりと上下に動かすことによって動物を非常に穏やかに洗浄することによって最小限に抑える必要があります。走化性アッセイプレートの状態も結果に大きく影響します。プレートが乾燥しすぎたり湿りすぎたりすると、動物のスムーズな移動が妨げられます。プレートは、工程1に記載のように調製した。良いプレートとは、ddH2Oまたは5%水性1-プロパノールの4μLスポットが、スポット後約5分で寒天に完全に吸収されるプレートです。上記のように、動物の年齢もコンディショニングを成功させるために重要です。若年成体動物は機械的および化学的処理に敏感であり、その結果、結果はさまざまですが、非常に高齢の動物もコンディショニングに適していない可能性があります。
1-プロパノールの貯蔵寿命はブランドとロットによって異なり、RTで3ヶ月未満です。ナイーブ動物のCI値が悪化した場合、コンディショニングおよび走化性アッセイに新鮮な1-プロパノールを使用することをお勧めします。
大量訓練による記憶の形成は、翻訳阻害剤(シクロヘキシミドおよびアニソマイシン)および転写阻害剤(アクチノマイシンD)による動物の治療によって影響を受けなかったが、間隔訓練による記憶の形成は阻害剤によって著しく阻害された20,21。さらに、前者はコールドショックによって記憶が衰退したが、後者は前者よりも長期間保持され、コールドショックに耐性があった。これらの結果は、前者がSTMであり、後者がLTMであることを示しています、それぞれ20,21。しかし、STMはCREB転写因子に弱く依存するため、大量トレーニングによって形成される記憶はSTMと中期(中期)記憶からなる可能性があります(図5A)。これは、STMが1時間20,21を超えて保持されたという結果と一致しています。STMとLTMの両方の形成はnmr-1に大きく依存しており、これはC.エレガンス27,28の6対のニューロン(AVA、AVD、AVE、RIM、AVG、およびPVC)でのみ発現します。したがって、これらのニューロンでは、NMDA受容体は、シナプス可塑性のための1%水性1-プロパノールおよびHCl(pH 4.0)シグナルの分子一致検出器として作用する可能性があり、STMおよびLTMの両方に必要なシナプス強化は、シナプス前およびシナプス後のニューロンの偶然の発火から生じる可能性がある29,30,31,32,33。したがって、介在ニューロン間で嫌悪連想記憶が形成される可能性があります。
本研究で説明した方法は、食欲をそそる嗅覚学習と、CSとして1-ノナノール、US21として塩化カリウムを使用する短期および長期連想記憶に適用できるはずです。食欲記憶と嫌悪記憶の形成に関与する神経回路を比較することは興味深いです。

学習と記憶は、動物が変化する環境を効率的にナビゲートすることによって生き残り、繁殖するために不可欠です。C. elegansは、神経系が単純であるため、分子および細胞レベルで学習と記憶を研究するための魅力的なモデル生物であり、その化学的および電気的配線図は、薄い切片の直列電子顕微鏡写真から完全に再構築されました1,2,3。
C.エレガンスは、栽培温度と飢餓を関連付けることを学び、数時間続く嫌悪記憶でその成長温度から離れます4,5。食物の非存在下でC.エレガンスを塩化ナトリウム(NaCl)でコンディショニングすると、NaCl 6,7,8に対する走化性が低下します。食べ物と組み合わせると、食欲をそそる学習の結果としてブタノンの魅力が高まります9,10,11。これらの現象は連想学習と記憶10,12として解釈されるが、連想学習と非連想感作、慣れ、適応との区別は、C.エレガンスの学習と記憶のパラダイム13,14では明確ではない。実際、ブタノンと食物欠乏(嫌悪条件付け)で条件付けられた動物は、AIA介在ニューロンを含む他のニューロンからのインスリン信号によってブタノン感覚ニューロンAWCONの標的ニューロンへの結合の低下を示し、ブタノンと食物で条件付けられた動物(食欲条件付け)は、標的ニューロンへのAWCONの結合の増強を示した15。.インスリンシグナル伝達は、核EGL-4および他の転写調節因子によって誘導される遺伝子発現変化を引き起こす16,17。したがって、この嫌悪的で食欲をそそる学習と記憶は、Aplysia18,19のえら離脱反射におけるシナプス前感覚ニューロンの非連想的慣れと感作とそれぞれ類似しています。
条件刺激(CS)と無条件刺激(US)の2つの化学物質を組み合わせることにより、私たちと他の人は、米国のように食物や飢餓を使用せずに連想学習と記憶を形成するためのC.エレガンスの条件付けのためのプロトコルを開発しました20,21,22,23。本研究では、プロトコルを変更して、1-プロパノールと塩酸(HCl、pH 4.0)をそれぞれCSおよびUSとして、嫌悪学習および短期記憶(STM)および長期記憶(LTM)として動物を条件付けます。ナイーブC.エレガンスは1-プロパノール24に引き付けられ、酸25にはじかれます。1-プロパノールとHClの混合物(pH 4.0)でコンディショニングした場合、C.エレガンスはもはや1-プロパノールに誘引されないか、非常に弱く引き付けられました。

<table><tbody><tr><td>500mlビーカー</td><td>HARIO</td><td>B-500-H32</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro;L ピペットチップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>H-104-96RS-Q</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL ピペットチップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>TTW110RS-Q</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mL ピペットチップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>H-111-R100NS-Q</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL プラスチックチューブ</td><td>0030120086</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL プラスチックチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>10 mLセロジカルピペット</td><td>As One</td><td>2-5237-04</td><td></td></tr><tr><td>50 mL セロロジカルピペット</td><td>As One</td><td>2-5237-06</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養プレート</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Aron Alpha (プラスチック用接着剤)</td><td>東亞合成</td><td>高速EX</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>タカラトミー デジタルバイオロジー</td><td>SX-300</td><td></td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td></td><td>BD 211677</td><td></td></tr><tr><td>ボトルトップ0.2&micro;m フィルターユニット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>ブンゼンバーナー</td><td>EISCO</td><td>SKU&nbsp;</td><td></td>CH0089A</tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>ナカライテスク</td><td>06730-15</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans 変異株</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>和光純薬工業</td><td>034-03002</td><td></td></tr><tr><td>透明アクリル円筒パイプ</td><td>旭化成</td><td></td><td>長さ3.5cm、外径30mm、厚さ2mm</td></tr><tr><td>結晶化皿</td><td>パイレックス</td><td>3140-80</td><td></td></tr><tr><td>デンタルバーナー</td><td>フェニックスデント</td><td>APT-3</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二カリウム水素</td><td>ナカライ テスク</td><td>28726-05</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌 OP50</td><td>カエノーラブディティス 遺伝学センター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電動ピペッター</td><td>ドラモンド・サイエンティフィック</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>和光純薬工業</td><td>073-06295</td><td></td></tr><tr><td>ガラスシャーレ(直径10cm)</td><td>As One&nbsp;</td><td>貿易 フラット マーク</td><td></td></tr><tr><td>加熱マグネチックスターラー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SP131324</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>ナカライ テスク</td><td>37345-15</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>三洋</td><td>MIR-553</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプ S-200</td><td>日本製紙 クレシア</td><td>62011</td><td></td></tr><tr><td>ラボコート</td><td>トーヨー リントフリー</td><td>FH240C</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>ナカライテスク</td><td>21002-85</td><td></td></tr><tr><td>マグネチックスターラーバー</td><td>SANSYO</td><td>93-5412</td><td></td></tr><tr><td>金属ヘラ</td><td>富士フイルム和光</td><td>647-06531</td><td></td></tr><tr><td>ニトリル手袋</td><td>キンバリークラーク</td><td>KC100</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ (メッシュサイズ:30μ;m)</td><td>SEFAR</td><td>NY30-HD</td><td></td></tr><tr><td>P10 ピペットマン</td><td>ギルソン</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>P200 ピペットマン</td><td>ギルソン</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>P1000 ピペットマン</td><td>ギルソン</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>pH メーター</td><td>堀場製作所&nbsp;</td><td>ナビ F-52</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックペトリ皿(直径9cm)</td><td>イワキ</td><td>SH90-15E</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックペトリ皿(直径6cm)</td><td>SARSTEDT</td><td>82.1194.500</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック計量ボート</td><td></td><td>1-5233-01</td><td></td></tr><tr><td>ウォームピック用プラチナ線</td><td>ニラコ</td><td>PT-351265</td><td></td></tr><tr><td>1-プロパノール</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>279544</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28721-55</td><td></td></tr><tr><td>安全ゴーグル</td><td>Kimberly-Clark</td><td>#25646</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-05</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>つまようじ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>浄水システム</td><td>メルク</td><td>エリックスエッセンシャル 10 UV</td><td></td></tr><tr><td>Water urification systemytem</td><td>Merck</td><td>Milli-Q Synthesis A10</td><td></td></tr><tr><td>Weighing balance</td><td>メトラー&nbsp;</td><td>トレド</td><td></td></tr><tr><td>野生型 C. elegans N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

カエノラブディティス・エレガンスにおける2つの化学物質のペアリングによる嫌悪的連想学習と記憶形成

Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans

線虫 Caenorhabditis elegans は、その神経系の単純さのために、分子および細胞レベルで学習と記憶を研究するための魅力的なモデル生物であり、その化学的および電気的配線図は、薄い切片の連続電子顕微鏡写真から完全に再構築されました。ここでは、短期記憶(STM)と長期記憶(LTM)の形成のための質量トレーニングと間隔トレーニングによる C.エレガンスの コンディショニングのための詳細なプロトコルについて説明します。1-プロパノールと塩酸をそれぞれ条件刺激と無条件刺激としてペアリングすることにより、 C.エレガンスは 嫌悪的な連想性STMとLTMを形成するように訓練されることに成功しました。ナイーブな動物は1-プロパノールに引き付けられましたが、訓練された動物はもはや1-プロパノールに引き付けられなかったか、非常に弱く引き付けられませんでした。 アプリシア や ショウジョウバエなどの他の生物と同様に、「学習遺伝子と記憶遺伝子」は記憶形成に重要な役割を果たします。特に、 C. elegansでは6対の介在ニューロンに発現するNMDA型グルタミン酸受容体は、STMとLTMの両方の形成に必要であり、おそらく偶然の要因として必要です。したがって、メモリトレースは介在ニューロンの間に存在し得る。

C. elegansは、1%水性1-プロパノールとHCl(pH 4.0)をそれぞれCSとUSとしてペアリングすることにより、短期間の嫌悪連想記憶を形成するために大量トレーニングによって条件付けられました。上記のプロトコールに従って、同期動物を18°CのRTのベンチ上で5日間培養し、18°CのRTでddH2Oで2回非常に穏やかに洗浄した。 次いで、動物を1%水性1−プロパノールおよびHClの混合物(pH 4.0)で1秒間馴化した。また、ddH2Oのみ、1%水性1-プロパノールのみ、およびHCl(pH 4.0)のみを基準として動物を訓練しました。コンディショニング後、動物をddH2Oで1回洗浄した。コンディショニングを中断することなく10回繰り返しました(ITIなし)。成功したコンディショニングは、手順を7倍以上10倍まで繰り返すことによって達成されました。10倍以上のコンディショニングは、学習効率の低下をもたらしました21。訓練後、動物を細菌性食物の上でRT(18°C)で10分間休ませた。ddH2O3xで洗浄した後、動物を0.25%ゼラチン水溶液中に懸濁することによって微小遠心管に移し、重力によって底部に沈降させた。上清を可能な限り除去した後、動物を走化性アッセイバッファーに穏やかに再懸濁し、次いで重力によってチューブの底まで沈降させた。
できるだけ多くの上清を除去した後、動物懸濁液を18°CのRTに保持した走化性アッセイプレートの中心円上にスポットし、次いで動物を18°CのRTで10分間プレート上を自由に移動させた。 C.I.値は、 図3Bに示す式を用いて算出した。 図4Aに示されるように、1%1-プロパノールおよびHClの混合物で馴化された動物は、走化性アッセイのために寒天プレート上にスポットされた5%1-プロパノールにもはや引き付けられなかったが、ナイーブ動物および参照動物は同様に5%1-プロパノールに引き付けられた。大量トレーニング(ステップ3)の後、記憶は3時間20以内に観察されなくなりました。さらに、集団訓練によって形成された記憶は、コールドショック20に敏感であった。これらの結果は、 C.エレガンスが 集団訓練によって嫌悪性STMの形成に成功したことを示しています。
動物はまた、訓練ステップの間に10分間のITIを有する10倍の間隔トレーニングによって馴化された(ステップ4。ITIの間、動物と共にコレクターを、18°CのRTで6cmNGMプレート上の細菌芝生上に置いた。 1%水性1-プロパノールとHCl(pH 4.0)の混合物による間隔トレーニングによってコンディショニングされた動物は、1%1-プロパノールのみ、HCl(pH 4.0)のみ、またはddH2Oのみで処理した動物と比較して、5%1-プロパノールに引き付けられなくなりました(図4B)。間隔を空けた訓練の後、動物は12時間20,21以上記憶を保持した。さらに、動物が翻訳または転写阻害剤で治療された場合、記憶は形成されず、コールドショックに耐性がありました20,21。したがって、C.エレガンスは間隔を空けたトレーニングによって嫌悪LTMを形成することに成功しました。
また、「学習・記憶遺伝子」の変異がSTMとLTMの形成に及ぼす影響についても検討した。crh-1遺伝子はユビキタス転写因子cAMP応答エレメント結合タンパク質(CREB)をコードし、glr-1およびnmr-1はそれぞれα-アミノ-3-ヒドロキシル-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸(AMPA)型およびN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)型グルタミン酸受容体サブユニットをコードし、スタウ-1は二本鎖RNA結合タンパク質Staufenアイソフォームをコードする。これらの遺伝子は、C.エレガンス、ショウジョウバエ、アプリシア、およびマウスの古典的条件付けに重要な役割を果たします。1%水性1-プロパノールとHClの混合物(pH 4.0)を用いて、STMおよびLTMの形成は全ての遺伝子に依存していた(図5A、B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64137/64137fig01.jpg"> 図1:マストレーニングの実験概略図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64137/64137fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64137/64137fig02.jpg"> 図2:間隔を空けたトレーニングの実験回路図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64137/64137fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64137/64137fig03.jpg"> 図3:走化性アッセイおよび走化性指数。 (a)走化性アッセイプレートの概略図。シャーレ(直径6cm)を図のように4つの領域に分離し、中心から2cm離れた2箇所ずつ、5%水性1-プロパノールまたはddH2Oをそれぞれ4μL斜めに点在させた。(b)走化性指数値は、走化性終了後の領域「a」及び「b」の動物数をカウントして示した式から算出した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64137/64137fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64137/64137fig04.jpg"> 図4:化学物質で馴染めた動物の走化性指数値。同期野生型N2動物を、(A)大量訓練10倍または(B)間隔訓練10倍によって示される化学物質で馴化した。使用したマストレーニングプロトコルと間隔トレーニングプロトコルのフローチャートをそれぞれ図1と図2に示します。コンディショニング後、動物を走化性アッセイのために6cm寒天プレート上で10分間自由に動かし、RT18°Cで行った。 C.I.値は、図3Bに示す式を用いて算出した。この図のデータは、補足表1に記載されています。ナイーブ動物からのデータは、両方の図パネルに再プロットされました。棒グラフは、第1四分位数、中央値、および第3四分位数を示します。アスタリスク(*P &lt; 0.05)は、一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定によって決定された統計的に有意な差を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64137/64137fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64137/64137fig05.jpg"> 図5:馴化変異動物の学習指標値。 示された野生型N2と変異動物を、(A)10倍の大量トレーニングまたは(B)10倍の間隔トレーニングによって1%水性1-プロパノールとHClの混合物(pH 4.0)で馴化した。使用したマストレーニングプロトコルと間隔トレーニングプロトコルのフローチャートを それぞれ図1 と 図2に示します。コンディショニング後、動物を走化性アッセイのために6cm寒天プレート上で10分間自由に動かし、RT18°Cで行った。 この図のデータは 、補足表2に記載されています。棒グラフは、第1四分位数、中央値、および第3四分位数を示します。アスタリスク(*P &lt; 0.05)は、一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定によって決定された統計的に有意な差を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64137/64137fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:若年成体動物は化学処理に敏感です。 孵化後の4日目および5日目の野生型N2動物を、中断することなくHCl、pH 4.0で10倍大量訓練し、次いで5%水性1-プロパノールへの走化性についてアッセイした。バーは S.E.M. (n = 19) ±平均です。アスタリスク(*P &lt; 0.05)は、二元配置分散分析とそれに続くテューキー・クレイマー事後検定によって決定された統計的に有意な差を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64137/Supplementary%20Figure%20S1.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:図4に対応するデータ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64137/Supplemental%20Table%20S1.zip" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表2:図5に対応するデータ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64137/Supplemental%20Table%20S2.zip" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

我々はこれまでに、 カエノラブディティス・エレガンスが 、それぞれ質量トレーニングと間隔トレーニングによって短期および長期の連想記憶を形成するためのプロトコルを開発しました。ここでは、1-プロパノールと塩酸をそれぞれ条件刺激と無条件刺激としてペアリングして嫌悪連想記憶を形成することにより、 C.エレガンスの コンディショニングに関する詳細なプロトコルについて説明します。

The nematode Caenorhabditis elegans is an attractive model organism to study learning and memory at molecular and cellular levels because of the ...

学習と記憶は、動物が絶えず変化する環境を効率的にナビゲートすることによって生き残り、繁殖するために不可欠です。また、神経科学で研究される主要な科目の1つでもあります。Caenorhabditis elegansは、その神経系の単純さのために学習と記憶の研究のための魅力的な生物です。その化学的および電気的配線図も完全に再構築されています。Caenorhabditis elegansの行動分析は非常にトリッキーであり、化学的、機械的、温度ストレスなどの多くのパラメータの影響を受けます。まず、0.2ミリリットルの大腸菌OP50液体培養物をLuria-Bertani培地に広げ、室温で24時間以内インキュベートすることにより、6センチメートルの線虫増殖培地またはNGMプレートを準備します。初日に、プラチナワームピッカーを使用して、6センチメートルのNGMプレートに5匹の十分に給餌された妊娠動物をピックアンド置き、室温で3時間約50個の卵を産ませて、成体動物の同期集団を取得します。産卵を止めるには、プラチナワームピッカーでプレートから親動物を取り除きます。動物を室温で約5日間培養して、若年成人期ではなく成熟成人期に到達します。5日後、ピペットチップなどのプラスチックの表面への動物の付着を防ぐ1ミリリットルの0.25%水性ゼラチンで各プレートを洗浄することにより、約200匹の成体動物を動物コレクターに集めます。次に、コレクターを10ミリリットルの二重蒸留水で2回ゆっくりと上下に動かして動物を洗います。このプロセスを2回繰り返します。約200匹の動物を含む動物コレクターを、pH 4の1%1-プロパノールと塩酸の混合物40ミリリットルに結晶化皿に1秒間静かに浸します。コレクター内の動物を、10ミリリットルの二重蒸留水を含む6ウェル組織培養プレートのウェルにコレクターを1回非常に穏やかに浸して洗浄します。次に、コレクターを6センチメートルのNGMプレート上の大腸菌OP50芝生に10分間置き、動物を休ませます。次に、コレクターをゆっくりと上下に動かして、コレクター内の動物を10ミリリットルの二重蒸留水で洗います。この洗浄を3回繰り返し、走化性アッセイに進む。前に示したように、プロパノール混合物および二重蒸留水でコレクター内の動物をそれぞれ1回ずつ順次洗浄する。次に、コレクターを6センチメートルのペトリ皿のNGM寒天の上の大腸菌OP50芝生に10分間置き、動物を休ませます。次に、細菌汚染を防ぐために、10ミリリットルの二重蒸留水でコレクターを2回ゆっくりと上下に動かして動物を3回洗浄し、走化性アッセイに進みます。走化性アッセイ用のオーガープレートを6センチメートルのプラスチック製ペトリ皿に準備します。次に、1ミリメートルを超える開口部を有する切断されたピペットチップを使用して、動物をコレクターから1ミリリットルの0.25%水性ゼラチンを含む2ミリリットルのマイクロ遠心管に移します。動物が重力によってチューブの底に落ち着いた後、チューブから上清を取り除きます。動物を1ミリリットルの走化性アッセイバッファーに再懸濁し、重力によってチューブの底まで約1分間落ち着かせます。その後、ピペッティングでできるだけ多くの上清を除去します。次に、2か所で4マイクロリットルの5%水性1-プロパノールを斜めにスポットし、次にペトリプレートの他の2か所で4マイクロリットルの二重蒸留水を見つけます。次に、開口部が1ミリメートルの切断ピペットチップを使用して、3つのプレートの中央にある約60匹の動物を含む走化性アッセイバッファーに6マイクロリットルの動物懸濁液を見つけます。動物に触れずに実験用組織の芯でできるだけ液体を取り除きます。プレートに蓋をし、動物がプレート上で室温で10分間自由に動くようにします。走化性を止めるには、このプレートを氷の上のガラスのペトリ皿に3分間移します。次に、プレート上の動物の数を数えるまでプレートを冷蔵庫に入れます。実体顕微鏡で中央の円の動物を除く4つのセクションの動物の数を数え、式を使用して走化性指数を計算します。走化性指数値から、基準動物の走化性指数値と馴化動物の走化性指数値との差として学習指標値を計算する。走化性アッセイでは、1-プロパノールと塩酸の混合物で条件付けられた動物は、寒天プレートにスポットされた5%1-プロパノールに引き付けられませんが、ナイーブ動物と参照動物は5%1-プロパノールに引き付けられました。1-プロパノール水溶液と塩酸の混合物による間隔トレーニングによって調整された動物は、1%1-プロパノールまたは塩酸、または二重蒸留水のみで処理された動物と比較して、5%1-プロパノールに引き付けられなくなりました。.記憶に対する突然変異の影響を研究すると、短期および長期の記憶形成は、動物の古典的な条件付けに不可欠な役割を果たす遺伝子に依存していることが明らかになりました。各コンディショニングの後、動物は二重蒸留水で一度だけ穏やかに洗われるべきです。この手順を使用して長期記憶が形成された後、カルシウムイメージングと電気生理学は、記憶の原因となる神経回路を特定することができます。遺伝子および単一ニューロン分析を通じて、メモリの保存および検索プロセスを分子レベルおよび単一細胞レベルで対処できます。

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神経科学

ここでは、線虫の連合学習と短期と長期の連想記憶をテストする方法を説明します。これらの人口のアッセイは、揮発性の臭気物質に向かってchemotaxにワームの能力を採用しており、走化性ブタノンで食べ物をペアリング時に正の関連付けを形成する。コンディショニング期間の数を増やすと、長期記憶を誘導する。...

C. elegansの正ブタノンの学習、短期、および長期連想記憶アッセイ

ショウジョウバエの幼虫は味覚報酬で匂い刺激を関連付けることができます。ここでは、食欲の連想嗅覚学習の分析を可能にする単純な行動パラダイムを記述します。...

で食欲連想嗅覚学習<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

触覚馴応アッセイ:C.エレガンスにおける非連想学習の研究方法

ここでは、有機体がよく摂食された状態から飢えた栄養状態に進行するにつれて、銅回避行動の変化および共通の食物源を見つける能力を評価するために設計されたCaenorhabditis elegans特異的アッセイを提示する。...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;栄養状態ベースの銅回避アッセイ

個人を自由に移動可能ではない分析のレベルで視覚的学習と記憶の形成を研究に研究を可能にするよう注意を払うアリの古典的条件づけのためのプロトコルを提案します。...

木蟻で visual の古典的条件付け

ここでは、ショウジョウバエの学習と記憶の文脈で、前および/または後のカルシウムを視覚化できるプロトコルを提示する。シナプス的に局在するカルシウムセンサを用いた生体内カルシウムイメージングでは、この種の連想学習の根底にあるシナプス可塑性が決定され得るように、古典的な嗅覚調節パラダイムと組み合わされる。...

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

この研究は、成体果実ハエにおける回避的な連想学習の分析を可能にする単純な行動パラダイムを記述する。この方法は、特定の環境コンテキストと感電との間に形成された関連付けによる自然負のジオタキシス行動を抑制することに基づいています。...

ショウジョウバエ 連想回避学習を研究する新たなパラダイムとしての受動的回避行動

線虫Caenorhabditis elegansの走化性における連想学習の測定

Caenorhabditis elegansにおける揮発性性フェロモン抽出と化学吸引アッセイ

測定運動機能、学習、およびメモリ能力のための行動アッセイ...

でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエ</em神経変性の>モデル

学ぶ Caenorhabditis elegansを用いた嫌悪的連想学習のプロトコル。1-プロパノールと塩酸の化学刺激で条件付けを行い、短期・長期記憶形成の遺伝的要因を解析する神経科学研究手法です。

カエノラブディティス・エレガンスにおける2つの化学物質のペアリングによる嫌悪的連想学習と記憶形成

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