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スロベニア研究庁、助成金番号P4-133の支援に感謝します。

1. ミツバチ研究のための基礎組織学
<ol><li>ミツバチ組織の解剖 注意: 働きバチの解剖には、LED光源を備えた解剖顕微鏡を使用してください。最も有用な倍率は~20倍です。<ol><li>操作と解剖<ol><li>働きバチを鉗子で慎重に取り、氷の上(または-20°Cの冷凍庫)に2分間入れて固定します22。ペトリ皿に蜂を胸部の背中の上部から左から右、右から左に2回斜めに固定します。</li>
			<li>体を覆うために昆虫食塩水を注ぐ。ペトリ皿を顕微鏡下に置き、焦点を合わせて調整します。</li>
			<li>機器を準備します( 材料の表を参照)。</li>
		</ol></li>
		<li>中腸の解剖<ol><li>ミツバチの体の右側の中央にあるテルガイトA5(図1)の下にハサミの一点を挿入して、腹部から始めます。テルガイトA2にカットします。</li>
			<li>内臓を傷つけないように、はさみの内刃を体の側面と平行に保ちます。はさみを左に回して1カットします。右に曲がって別のカットを行います。腹部の左側をそっと開いて固定します。反対側で繰り返します。</li>
			<li>片手で鉗子を使用して、ミツバチの胃をそっと上に引き上げ、もう一方の手でハサミで食道の端を切ります。胃と中腸を腹部から引き離し、直腸を切ります。昆虫食塩水を入れたピペットを使用し、糞便や組織の一部を取り除きます。</li>
		</ol></li>
		<li>HPGの解剖<ol><li>ステップ1.1.1で説明されているように、働きバチを氷の上に固定します。頭を切り取り、アンテナを上に向けて小さなプレートに置きます。左複眼と右複眼の2本のピンで頭を固定します。</li>
			<li>ピンの内側にある最初の複眼を横切って切り込みを入れ、唇まで続けてから、反対側に2番目の複眼を横切って別の切り込みを入れます(図2)。</li>
			<li>アンテナを切り取ります。マスクを持ち上げて、まだ取り付けられている場所で切ります。鉗子を取り、脳と複眼の一部と一緒に腺を慎重に取り除きます。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>固定、脱水、パラフィン包埋 注意: 保護手袋を着用してください。<ol><li>組織をペニシリンボトルに入れ、3/4を10%ホルマリンで満たします。4°Cの冷蔵庫に保管してください。</li>
		<li>24時間後、一連のアルコールで組織を脱水します:70%、80%、90%、100%、それぞれ1時間、100%2-プロパノールを1時間、100%2-プロパノールを12時間、最後に100%2-プロパノールを1時間。</li>
		<li>組織をヒストカセットに入れる。印を付け、2-プロパノールとパラフィン(1:1)を入れたガラスチャンバーに入れ、60°Cのインキュベーターで24時間放置します。</li>
		<li>ヒストカセットをパラフィン(I.)を含む別のチャンバーにさらに24時間移動します。新鮮なパラフィンでさらに2回(IIとIII)、両方とも24時間手順を繰り返します。</li>
		<li>最後に、取り付けステーションを準備し、ティッシュをワックスに埋め込み始めます。<ol><li>各ヒストカセットを開き、カバーを取り外します。型をワックスで満たし、型の中央に温かい鉗子で組織を慎重に置きます。</li>
			<li>ヒストカセットを型の上に置き、ワックスで少し覆います。すぐに金型を取り付けステーションの冷たい面に数秒間置き、ワックスが硬化して金型とヒストカセットから分離するまで数分間コールドプレートに置きます。</li>
		</ol></li>
		<li>完成したサンプルは、ほこりや熱から離れた箱に保管してください。</li>
		<li>ミクロトームで4 μmの薄い切片を切断します:最初に2つの切片を互いに取り付け、次に1つを別々に取り付けます。切片を鉗子で移し、蒸留水(42°C)に浮かせてから、対物レンズガラスの左側に2つの切片を一緒に、右側に3番目の切片を別々に配置して、きれいなスライドに集めます。マークされたスライドを加熱装置に一晩置いておき、最後に組織学サンプル専用の箱に保管します。</li>
	</ol></li>
	<li>脱ろうと水分補給 注意: 保護手袋を着用してください。<ol><li>9つのコプリンジャーを準備し、セクションを一連の清澄剤(I.、II.、III.)にそれぞれ5分間入れます。</li>
		<li>2-プロパノール、エタノール96%(I.、II)、アルコール90%および80%、蒸留水にそれぞれ3分間入れます。</li>
	</ol></li>
	<li>ヘマトキシリンとエオシンによる染色 注意: 保護手袋を着用してください。<ol><li>6つのコプリンジャーを準備します。</li>
		<li>ヘマトキシリンおよびエオジン(H&amp;E)染色の場合は、脱ワックス、再水和した切片をヘマトキシリンに5分間入れてから、水道水の下に2分間注意深く置きます。次に、それらを蒸留水に1分間、エオシンに4分間入れます(エオシンの場合、コプリンジャーは必要ありません)。</li>
		<li>スライドをエタノール96%に1分間入れ、次に2-プロパノールに2分間入れ、最後に透明化剤に2分間入れます。</li>
		<li>封入剤とカバーガラスを加え、乾燥させます。光学顕微鏡で観察する。</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64141/64141fig01.jpg"> 図1:ミツバチの体の背側図。A1-A7テルガイト。ミツバチの解剖に関する詳細な手順は、Carreckら24にあります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64141/64141fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64141/64141fig02v2.jpg"> 図2:HPGの背側図、脳に付着した複眼の一部(見えない)。5〜6日齢の若い働き蜂は、ふっくらとしたクリーミーな白いHPGを持っています。腺房は脳上にあり、脳の後ろに達する枝で頭の領域を埋めます。採餌中のミツバチでは、これらの腺は非常に縮小し、細い糸のような残骸だけを残します。このため、組織を失うことを避けるために、さらなる手順でそれを容易にするために、脳と一緒に腺を取り除くことをお勧めします。スケールバー= 500μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64141/64141fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
2.組織切片における細胞死の検出
<ol><li>アポトーシス検出キット(アッセイA) 注意: 製造元のプロトコルに従ってください( 材料表を参照)。<ol><li>コプリンジャーを準備します。</li>
		<li>脱ろうと再水和(ステップ1.3を参照)の後、スライドを0.85%NaCl溶液に浸し、次にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に浸します(5分間)。</li>
		<li>スライドを4%パラホルムアルデヒド2 x 15分に入れます。</li>
		<li>スライドを容器に平らに置き、100 μLのプロテイナーゼK(20 μg / mL)溶液を加えてから、10〜30分間放置します。</li>
		<li>スライドをPBSに入れます(5分)。</li>
		<li>スライドをPBS中の4%パラホルムアルデヒドに入れます(5分)。</li>
		<li>スライドをPBSに浸します(2 x 5分)。</li>
		<li>スライドを容器に平らに置き、100 μLの平衡化バッファーを加えて、5〜10分間放置します。</li>
		<li>100 μLのTdT反応ミックスを加えます。スライドの周りにペーパータオルを容器の中に入れ、タオルを水で湿らせてから、ラップで覆います。スライドを37°Cで60分間インキュベートします。</li>
		<li>スライドを染色ラックに戻し、2x生理食塩水-クエン酸ナトリウム(SSC)に15分間浸します。</li>
		<li>スライドをPBSに3 x 5分浸し、次に0.3%過酸化水素に3〜5分間浸し、次に再びPBSに3 x 5分浸します。</li>
		<li>再度、スライドを容器に平らに置き、100 μLのストレプトアビジンHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)を加え、30分間放置します(ラップで覆います)。</li>
		<li>スライドをPBSに3 x 5分浸します。</li>
		<li>スライドを容器に平らに置き、100 μLの3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)溶液を加えます。明るい茶色の背景を探します。</li>
		<li>スライドをラックに戻し、水で数回洗います(二重蒸留)。</li>
		<li>スライドを封入剤のガラスカバースリップの下に取り付け、平らにして乾かします。</li>
		<li>光学顕微鏡で観察する。</li>
	</ol></li>
	<li>アポトーシス検出キット(アッセイB) 注意: 製造元のプロトコルに従ってください( 材料表を参照)。<ol><li>コプリンジャーを準備します。</li>
		<li>プロテイナーゼK(PBSで希釈した20 μg/mL)を調製します。</li>
		<li>切片を脱ワックスして再水和した後(ステップ1.3)、スライドをPBSに5分間入れます。</li>
		<li>スライドを容器に平らに置き、プロテイナーゼK(20 μg/mL、5 cm²検体あたり60 μL)を加えます。</li>
		<li>スライドを蒸留水で2 x 2分洗浄します。</li>
		<li>室温で内因性ペルオキシダーゼ(3%水素ペルオキシダーゼ中)でクエンチします。</li>
		<li>スライドをPBSまたは水で2 x 5分すすぎます。</li>
		<li>スライドを容器に平らに置き、平衡化バッファー(75 μL/5 cm2)を室温で10秒間適用します。</li>
		<li>ティッシュの周りを慎重に拭きます。</li>
		<li>TdT酵素(末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ)を各切片に加え、加湿チャンバー内で37°Cで1時間インキュベートします。 ペーパータオルをトレイの中、スライドの周りに置き、タオルを水で湿らせ、ラップで覆います。</li>
		<li>インキュベーション後、検体をラックに入れ、ストップ/ウォッシュバッファー(10分)に入れます。</li>
		<li>抗ジゴキシゲニンコンジュゲートを室温に温めます。</li>
		<li>スライドをPBSで洗います(3 x 1分)。</li>
		<li>ティッシュの周りを慎重に拭き取ります。</li>
		<li>抗ジゴキシゲニン-ペルオキシダーゼコンジュゲート(65 μL/5 cm²)を切片に2滴加え、加湿容器で30分間インキュベートします。</li>
		<li>PBS 4 x 2分で洗浄した後、作業強度のペルオキシダーゼ基質を準備し、余分な液体を静かにたたき取り、セクションの周りを吸引します。</li>
		<li>切片をペルオキシダーゼ基質(75 μL/5 cm²)で覆い、5分間染色します。顕微鏡の下にスライドを置き、最適な染色時間を決定します。</li>
		<li>蒸留水(3 x 1分)の染色ラックでスライドを洗います。</li>
		<li>スライドを蒸留水で5分間インキュベートします。</li>
		<li>ヘマトキシリンを2分間対比染色する。</li>
		<li>スライドを水道水の下に3分間置きます。</li>
		<li>スライドを蒸留水で洗います。</li>
		<li>スライドを封入剤のガラスカバースリップの下に取り付け、平らにして乾かします。</li>
		<li>光学顕微鏡で観察する。</li>
	</ol></li>
	<li>アポトーシス検出キット(アッセイC) 注意: 製造元のプロトコルに従ってください( 材料表を参照)。<ol><li>コプリンジャーを準備します。</li>
		<li>組織切片を脱ろうして再水和します(手順1.3を参照)。</li>
		<li>組織をプロテイナーゼK(37°Cで15〜30分)でインキュベートします。</li>
		<li>スライドをラックに戻し、PBSで2回すすぎます。</li>
		<li>50 μLの「TUNEL反応混合物」で覆います。濡れたペーパータオルを容器に入れ、ラップで覆い、37°Cで60分間放置します。</li>
		<li>PBSで3回すすぎます。</li>
		<li>スライドを容器に入れ、組織サンプルの周囲を乾燥させます。</li>
		<li>50 μLのコンバーター-APをサンプルに加え、加湿容器中で37°Cで30分間インキュベートします。</li>
		<li>PBSで3回すすぎます。</li>
		<li>50〜100μLの基質溶液を加え、暗所に10分間放置する。 注:光学顕微鏡で染色を観察します。</li>
		<li>スライドをPBSで3回すすぎます。</li>
		<li>切片をヘマトキシリンに2分間移して対比染色し、水道水で5分間注意深くすすいでください。</li>
		<li>スライドを水性封入剤のガラスカバースリップの下に取り付け、平らにして乾かします。</li>
		<li>光学顕微鏡で観察する。光学顕微鏡下で中腸またはHPGの各サンプル中の70〜100個の細胞を数えることにより、影響を受けた(陽性)細胞を評価します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+in+situ+detection+of+apoptosis+and+necrosis+in+monolayer+cultures+by+TUNEL+and+trypan+blue+staining%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining.</a> BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).</li>
<li>Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+apoptotic+cells+using+a+modified+in+situ+TUNEL+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).</li>
<li>Gregorc, A., Bowen, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera+L.%29+larvae+midgut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut.</a> Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).</li>
<li>Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+honey+bee+%28Apis+mellifera%29+larvae+treated+with+oxalic+or+formic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Apidologie%22%5BJournal%5D)">Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid.</a> Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).</li>
</ol>

著者には利益相反はありません。

生体では、細胞死はアポトーシスまたは壊死25として定義され、オートファジー26を伴うことがあります。アポトーシス細胞と壊死細胞の違いは、アポトーシスはプログラムされた細胞死の一形態であり、正常細胞に現れるのに対し、壊死は致命的な状態(事故、病気など)によって起こることです27,28。アポトーシスは、TUNEL法に基づくアッセイキット(アポトーシス中に生成される二本鎖DNA切断の3'-ヒドロキシル末端を標識することによるDNA断片化の検出)を使用して検出できます。異なるキットは、細胞欠失を検出する際にいくつかのレベルの感度を提供します。
アッセイの1つ(アッセイC)は非常に感度が高く、アポトーシスと壊死の両方を検出します29;他のアッセイ(B)は、アポトーシス細胞死を検出するためのより高い感度を示す<sup class="xr...

ミツバチ(Apis mellifera L.)は、他の野生の花粉媒介者の中でも、農業用植物の最も重要な花粉媒介者です。何千年もの間、変化する環境は、ミツバチが形態、生理学、行動、およびいくつかの病原体や寄生虫に対する耐性を適応させるように影響を与えてきました。したがって、ミツバチは世界中で非常に多様な種と亜種を開発しました1。これらの結果は、ミツバチの消化管構造に遺伝的変異があるという以前の発見と一致していますが、中腸の変化は環境要因によるものであることも示唆しています2,3。
ミツバチの消化管には、前腸、中腸(心室)、後腸4の3つの主要部分があります。心室は花粉と蜜/蜂蜜の消化に不可欠な器官です。後腸では、浸透圧制御は水とイオンの吸収によって行われます2。ミツバチ労働者の下咽頭腺(HPG)は頭にあり、ローヤルゼリー成分を合成して分泌し、ひな、女王、およびコロニーのメンバーに餌を与えます。それらのサイズは年齢や課題によって変化し、適切な栄養(高品質の花粉)に依存します。6〜18日齢の看護師がひなの飼育を行い、HPGのサイズは5,6増加します。採餌ミツバチでは、HPGは変性し、蜂蜜中の複雑な糖を単純な糖(α-グルコシダーゼ、ロイシンアリールアミダーゼ、インベルターゼ)に変換するのに重要な酵素のみを分泌します7。
ミツバチはいくつかの生物的および非生物的ストレッサーにさらされており8、消化管はいくつかの負の覚醒剤の影響を受ける可能性があります。病原体から生物を保護する最初の障壁は、病原体から保護するための腸粘膜からなる中腸の周栄養膜です4。HPGの発生と機能は、食事、年齢、コロニーの状態9に依存し、殺虫剤、殺ダニ剤10、および病原体11、12、13の影響を受けます。バロア防除処理および環境からの農薬による巣箱内の殺ダニ剤残留物は、採餌蜂およびナースミツバチに影響を及ぼす14,15。ミツバチのコロニーに対する最大の脅威は、コロニーの損失に寄与するウイルスのベクターとして、また宿主の脂肪体(ミツバチの重要な重要な器官)の消費者として、ダニVarroaデストラクタであり、その結果、個体の体とコロニーの機能に影響を与えます17。
しかし、集中的な農地の生息地は、ミツバチに短期的な食料供給を提供することができます。したがって、農業環境計画は、農業景観における蜂蜜の花の利用可能性を高めるはずです18。異なる亜種6,19,20,21の形態、または細胞または組織レベル、特に中腸およびHPGでのこれらの因子の亜致死的影響を評価するために、組織学的および免疫組織化学的方法は実用的であり、ミツバチの組織学研究に使用するのに十分正確です。

<table><tbody><tr><td>2-Propanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApopTag ペルオキシダーゼキット (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7100</td><td>Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE;S7101に含まれるポジティブコントロールは</td></tr><tr><td>、デッドエンド比色TUNELシステム</td><td>Promega</td><td>G7360</td>アッセイ<td>A、https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360</td></tr> 解<tr><td></td>剖顕微鏡をカバーし<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ます&nbsp;(ミツバチの解剖用)</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蒸留水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>包埋カセット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EnVision System アルカリホスファターゼキット</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>アルコール</td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td><td>95% (またはそれ以下)、90%、80%</td></tr><tr><td>Faramount 封入剤、水性</td><td>Dako</td><td></td><td>埋込用メディウム</td></tr><tr><td>フラット化テーブル</td><td>ライカ</td><td>HI1220</td><td></td></tr><tr><td>鉗子&nbsp;(ミツバチの解剖用)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11294-00</td><td>標準#4</td></tr>ホル<tr><td>マリン10%</td><td></td><td></td><td>ホルムアルデヒド</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoChoiceクリアリングエージェント</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>クリアリングエージェント</td></tr><tr><td>水素ペルオキシダーゼ3%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベーターBioRad</td><td></td><td></td><td></td></tr>昆虫<tr><td>ピン&nbsp;(ミツバチの解剖用)</td><td>Entosphinx</td><td>44594</td><td>昆虫ピン ステンレス鋼 &ndash; 白、サイズ 2</td></tr><tr><td>ISCDDK、AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase)</td><td>Roche</td><td>11684809910</td><td>Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lab clock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td></td><td></td><td>スライドが入った箱は、ほこりを防ぐためにラップで保存する必要があります</td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>モジュール式組織包埋ステーション</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド4%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラプラスト</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td></td><td></td><td>1.5 mL; 3 mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シャーレ&nbsp;(ミツバチの解剖用)</td><td></td><td></td><td>縮合シリコン充填&nbsp;(キサントプレンLブルーとユニバーサルリキッドプラスアクチベーター)</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>Merck</td><td>21627</td><td></td></tr><tr><td>Ringers' solution&nbsp;(ミツバチの解剖用)</td><td></td><td></td><td>NaCL 7.5 g、Na2HPO4 2.72 g KH2PO4、1 L 蒸留水</td></tr><tr><td>はさみ&nbsp;(ミツバチの解剖用)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>1406-09、14061-09</td>直線<td>および湾曲、9 cm</td></tr><tr><td>ユニバーサル液体プラス活性化剤&nbsp;(ミツバチの解剖用)</td><td>クルツァー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>時計職人s鉗子(ミツバチの解剖用)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>91100-12</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水彩ブラシ</td><td></td><td></td><td>2x</td></tr><tr><td>キサントプレンLブルー&nbsp;(ミツバチの解剖用)</td><td>クルツァー</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ミツバチ組織における組織学の基礎と細胞死検出

Histology Basics and Cell Death Detection in Honeybee Tissue

ミツバチ(Apis mellifera L.)ハイブ内(ナースワーカーや他のハイブミツバチ)とハイブ外(採餌者)は、気候や天候の変化、さまざまな農薬、病原体、栄養失調にさらされ、主に口から侵入し、主に成虫の消化管に影響を与えます。このような外部および内部のストレッサーがミツバチに及ぼす影響を理解し、予防するために、有用な研究方法の1つが免疫組織化学的方法です。組織学的分析のために成体ミツバチの中腸(心室)および下咽頭腺(HPG)を準備するための基本的なプロトコルが説明されています。細胞損傷のレベルを評価し、組織再生の自然なプロセスとして壊死とプログラム細胞死(アポトーシス)を区別するための詳細な方法論が説明されています。シュウ酸と農薬(殺虫剤と殺ダニ剤)による成虫ミツバチの治療結果と、心室とHPGの細胞死の測定が提示されています。方法論の長所と短所についても説明します。

中腸における細胞死の検出 リュブリャナのスロベニア農業研究所の実験養蜂場から新たに出現した働きバチ(Apis mellifera carnica)を、3%シュウ酸(OA)23で個別に処理しました。OAは、 Varroaデストラクタ 制御のための養蜂に頻繁に使用されます。処理後、働きバチ(各群から3匹)を氷上に固定した。中腸を解剖し、10%ホルマリンで固定した。次に、組織を一連のアルコール溶液で脱水し、最後にパラフィンワックスに包埋しました。ミクロトームで7μmの薄切片に切断した後、組織サンプルを分析用に調製した。光学顕微鏡を用いて、罹患細胞(3つの中腸サンプルのそれぞれから70〜100個の細胞)の割合を計算した。アッセイBの結果は、OAによる処理が中腸の細胞に有意に影響を与えることを示しました(図3)。アッセイAは、処理されたミツバチと対照のミツバチの間に差を示さなかった。細胞死率は10%未満であった。砂糖シロップのみを与えられた対照蜂では、中腸の形態は影...

免疫組織化学的方法は、成虫のミツバチの中腸および下咽頭腺におけるアポトーシスおよび壊死のレベルを検出および評価するためのミツバチの研究において有用である。

Honeybees (Apis mellifera L.) inside the hive (nurse workers and other hive bees) and outside the hive (foragers) are exposed to climate and weather ...

このプロトコルは、農薬で処理されたミツバチの多くの生物学的および毒物学的研究に役立ちます。それは、バロアダニに対する治療のためにミツバチのコロニーで使用されるダニ駆除剤のミツバチ組織の細胞応答を検出するのに役立ちます。これは、ミツバチや他の有益な昆虫の行動と組み合わせて、組織へのわずかな影響を検出するための強力なツールです。はじめに、働き蜂を鉗子で慎重に取り、摂氏マイナス20度で氷上または冷凍庫に2分間置いて固定します。ペトリ皿に蜂を胸部の一番上の背中の部分を左から右、右から左に2回斜めに固定します。体を覆うための貧弱な昆虫食塩水。ペトリ皿を実体顕微鏡の下に置き、焦点を合わせて調整します。中腸を解剖するには、ミツバチの体の右側の中央にあるテルガイトA5の下にハサミの1点を挿入して腹部から始めます。テルガイトA2にカットします。内臓を傷つけないように、はさみの内刃を体の側面と平行に保ちます。はさみを左に回して切ります。腹部の左側をそっと開いて固定します。片手で鉗子を使用して、ミツバチの胃をそっと上に引き上げ、もう一方の手でハサミで食道の端を切ります。胃と中腸を腹部から引き離し、直腸を切ります。昆虫食塩水を入れたピペットを使用し、糞便や組織の一部を取り除きます。下咽頭腺の解剖のために、前述のように働き蜂を氷の上に固定します。ヘッドを切り取り、アンテナを上に向けて小さなプレートに置きます。左複眼と右複眼の2本のピンで頭を固定します。ピンの内側の最初の複眼を横切って切り込みを入れ、唇に続き、次に2番目の複眼を横切って反対側に別の切り込みを入れます。アンテナを切り取ります。マスクを持ち上げて、まだ取り付けられている場所で切ります。鉗子を取り、脳と複眼の一部と一緒に腺を慎重に取り除きます。ヘマトキシリンおよびエオジン染色の場合は、脱ワックス、再水和した切片をヘマトキシリンに5分間入れます。次に、水道水の下に2分間注意深く置きます。次に、蒸留水に1分間、エオシンに4分間入れます。スライドを96%エタノールで1分間、次に2-プロパノールを2分間、最後に透明化剤に2分間入れます。封入剤とカバーガラスを加え、乾燥させます。光学顕微鏡で観察する。コプリンジャーを準備します。プロテイナーゼ-Kを準備します。セクションを脱ろうして水分補給した後、スライドをPBSに5分間入れます。スライドを容器に平らに置き、プロテイナーゼ-Kを加えます。スライドを蒸留水で洗います。室温で内因性ペルオキシダーゼでクエンチします。スライドをPBSまたは水ですすいでください。スライドを容器に平らに置き、室温で10秒間平衡化バッファーを適用します。組織の周りを拭いた後、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を各切片に加え、加湿チャンバー内で摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーションの前に、湿らせたペーパータオルをスライドの周りのトレイの内側に入れ、ラップで覆います。インキュベーション後、検体をラックに置き、ストップウォッシュバッファーに入れます。スライドをPBSで洗浄し、組織の周りを拭いた後、2滴の温かい抗ジゴキシゲニンペルオキシダーゼコンジュゲートを切片に加え、加湿容器中で30分間インキュベートする。PBSで洗浄した後、作業強度-ペルオキシダーゼ基質を準備し、切片をペルオキシダーゼ基質で覆い、5分間染色します。スライドを顕微鏡の下に置き、最適な染色時間を決定します。染色ラックと蒸留水でスライドを洗浄した後、スライドを蒸留水で5分間インキュベートします。ヘマトキシリンを2分間使用して対比染色します。スライドを水道水の下に3分間置き、次に蒸留水に入れて洗ってください。スライドをガラスカバースリップと封入剤の下に取り付け、平らにして乾かします。光学顕微鏡で観察する。罹患細胞の割合は、光学顕微鏡を用いて計算した。結果は、シュウ酸による処理が中腸の細胞に有意に影響を与えることを示しました。免疫染色は、下咽頭腺のアポトーシス核に陽性の赤色または褐色の反応生成物を示した。イミダクロプリドまたはクマフォス処理後の陽性反応生成物は、大多数の腺細胞において決定された。蜂の頭のマスクを持ち上げるときは、下咽頭腺の部分を傷つけたり引き剥がしたりしないように注意してください。この技術は、ミツバチの無症状の変化を検出し、ミツバチや他の生物に対する他の環境影響の検出にも適しています。

histology-basics-and-cell-death-detection-in-honeybee-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ミツバチは、食欲の嗅覚学習のパラダイム（PER...

ハニービーの嗅覚学習中のキノコ体の神経細胞のイメージング- 生体内のCa 2 + の

我々は、マウス胚とLysoTrackerと呼ばれる非常に水溶性染料を使用して差別化胚性幹（ES）細胞培養でプログラムされた細胞死（PCD）の領域を可視化するための単純なプロトコルを提示。...

胚におけるプログラム細胞死を検出するためのLysoTrackerの使用は、胚性幹細胞を分化

ミツバチの労働者では、高齢化が社会的行動ではなく生活年齢に依存します。ここでは、非常に異なる加齢パターンを持つ労働者のタイプが取得され、細胞の老化を分析する方法を示しています。...

ハニービーモデルの老化、減速し加速し、逆に試験片を得た

細胞膜小屋微粒子（MPS）を単離し、それらの病態生理学的効果は、様々なモデルで研究することができるアクティブな生物学的な小胞である。ここでは、Tリンパ球（のLMP）由来のMPを生成する気道上皮細胞に対するアポトーシス促進効果を実証するための方法を記載する。...

気道上皮細胞上でのアポトーシス促進効果のリンパ球微粒子および検出の生成

脂肪組織(AT)は全身の恒常性に影響を与える可能性があるため、脂肪細胞の分化と機能の分子メカニズムを理解することは重要です。私たちは、誘導された脂肪細胞のアポトーシスのモデルとして、脂肪細胞の恒常性、分化、および低酸素曝露を分析することにより、これらのプロセスに関する新しい洞察を得るためのプロトコルを提供します。...

分化およびアポトーシス恒常性を通じアダルト生物における脂肪細胞の数の調節のメカニズム

ショウジョウバエは広く神経変性を研究するためのモデル系として使用されます。このプロトコルは、脳内の空胞の形成によって決定されるように、定量化可能な変性方法を記載しています。それはまた、一つのサンプルとして処理し、切片化対照および実験ハエによる実験手順に影響を最小限に抑えることができます。...

に神経変性を定量化するために、マス組織学<em&gt;ショウジョウバエ</em

ミツバチや他の昆虫の腹部背側血管は、哺乳類の心臓と同等の機能として機能し、栄養素の輸送、老廃物の除去、免疫機能などにおいて重要な役割を果たしています。ここでは、ミツバチの心拍数の視覚化と薬理学的操作のためのプロトコルについて説明します。...

心機能の研究のための解剖と観察ハニービー背側の船

ミツバチの脳の異なる領域におけるホスホリパーゼ C (PLC) 薬理学的薬剤の抑制効果をテストするためこれらの地域で PLC 活性を測定する生化学的アッセイを提案する.この試金は PLC...

ミツバチから脳ホモジネート ホスホリパーゼ C 活性の検出

ミツバチ (セイヨウミツバチ) 労働者の下咽頭腺 Acinus サイズを測定

ここでは、成人ミツバチの脳におけるタンパク質の産生を減らして抗体特異性をテストするためにCRISPR-Cas9システムを使用するプロトコルです。...

CRISPR-Cas9を用いたミツバチ脳部における抗RDLおよび抗mGlutR1受容体抗体検査

学ぼう　免疫組織化学法を用いたミツバチ組織のアポトーシスと壊死の検出方法。中腸と咽頭下腺を対象に農薬処理による細胞応答を評価し、ミツバチの健康影響を理解する上で重要な技術です。

ミツバチ組織における組織学の基礎と細胞死検出

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