Name: クロマダニの遺伝子編集のための胚注入技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 学ぶクロマダニの胚注入技術による遺伝子編集手法。Chelicerata種として初めて確立されたこの方法は、ダニの遺伝子機能と病原体相互作用の研究を促進し、ライム病などのワクチン開発や防除戦略の基盤となる。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、プロトコル開発の初期段階における洞察と支援について、チャンナ・アルビヘアとヨヌス・ゲベルミカレ(ITF、UMD)を認めている。タングステン針は、ITF、UMDのデビッドオブロチタからの寛大な贈り物でした。I . ricinus でこのプロトコルをテストし、洞察に満ちた議論をしてくれたLadislav Simo博士に感謝します。このプロジェクトは、NIH-NIAID R21AI128393とニューヨーク州プリマスヒル財団からMG-N、ネバダ大学からANへのスタートアップ資金、MG-NとANへの国立科学財団助成金番号2019609、IGTRCNからASへのピアツーピア助成金によって資金提供されました。

Ixodes scapularis の成虫は、オクラホマ州立大学(OSU)から購入するか、ネバダ大学リノ校(UNR)で飼育されました(IACUCプロトコル#21-001-1118)。
1.胚採取のための雌ダニの準備
注: 適切な年齢の卵を集めるためには、産卵を同期させることが重要です。マダニの産卵の手がかりは不明であるが、標準的な昆虫条件(温度27°C、相対湿度>90%RH)では、 肩甲骨の雌は 宿主剥離後約8日で産卵を開始する。このタイムラインは、4°Cで十分なメスを保存することで長くすることができます。 採血された雌は、産卵に悪影響を及ぼさずに4°Cで最大8週間保存しました。これらの条件は、昆虫ごとに変更する必要があるかもしれません。
<ol><li>マイクロインジェクションに使用されるまで、湿ったろ紙で裏打ちされた6クォートのプラスチックボックスに、4°Cで>90%RHで6°Cですべての雌を保管します。</li>
	<li>注射の1週間前に、産卵の開始のために雌を4°Cから27°Cのインキュベーターに移します。</li>
	<li>雌が産卵を開始したら(27°Cに移してから3〜4日後)、先端の細い絵筆を使用して卵を取り除き、ジェネの臓器(ワックス腺)の切除のために雌を準備します。 注:ジェネの器官は、胚盤と頭蓋骨の間の領域(口器の背側基部)から伸びており、口の部分は腹側の体表面(表面に平行)上で曲がり、拡張された遺伝子の器官は卵が産むとすぐに卵を覆います(図1)。ジェネの臓器除去またはワックスを空にする前に産まれた卵は、ワックスコーティングが施されており、注射には適していないため、廃棄する必要があります。</li>
	<li>ジェネの臓器を除去または空にするには、粘土を使用して、口の部分が腹側と背側の両方に見えるように向けられた顕微鏡下で、充血した女性をスライドガラスに配置します(図1B、C)。<ol><li>以前に公開されたプロトコル16 に従って、タングステンワイヤーを使用して実験室で作られた細い鉗子とタングステン針を使用して、胚盤と口の部分の間の領域を正確に慎重に突く(針は市販品を購入し、マイクロ解剖プローブに取り付けることもできます、 材料の表を参照)。</li>
		<li>タングステン針で内側に向かって作業し、ワックス腺を引き出します(図1D、E)。腺を取り除くのに数分かかることがあります。ラボワイプを使用して、液体ワックスの分泌物を拭き取ります。 注:腺は、口の部分のすぐ下の腹側から取り外すこともできます。針と鉗子でスクトゥムに向かって後ろに手を伸ばすことによって。口の部分にシリコン接着剤を塗布すると、ジーンの臓器外転もブロックされ、ワックスを除去または空にする代わりに使用できます(フランス、INRAEのLadislav Simo博士との個人的なコミュニケーション)。充血したダニは両面テープにとどまりません。粘土を使用してダニを「くるむ」と、操作中にダニを所定の位置に保つのに役立ちます。鉗子を使用して、解剖のためにダニとタングステン針を保持します。腹側部分は針で穴を開けるのが簡単で、著者によって好まれています。</li>
	</ol></li>
	<li>腺を空にするには、ステップ1.4で述べたように妊娠ダニを配置します。背側のマウスパーツの後ろの領域を慎重に穿刺し、鉗子を使用して腹側に圧力をかけます。 注意: あるいは、ワックス腺を取り外す必要はありません。ワックスの腺を空にすることは数日間続くでしょう。産卵雌は、ワックス腺の位置を示す口の部分の周りに白い領域があり、参照として使用できます。<ol><li>糸くずの出ないラボワイプの端を置き、穿刺部位から出てくる液体ワックスを取り除きます。わずかに黄色がかった粘性ワックスと比較して透明な液体である血リンパ分泌を避けるようにしてください。ほとんどのワックスが除去されるまで5〜10分かかる場合があります。</li>
	</ol></li>
	<li>操作後、雌を27°C(>90%RH)のインキュベーターに入れ、1〜2日間回復させます。 注:治療を受けた女性は通常、回復して産卵を再開するのに1〜2日かかります。</li>
	<li>雌が再び産卵を開始したら、細かい絵筆を使用して新たに産卵した卵(産卵後0〜18時間)を収集し、1.5mLの微量遠心チューブに入れます。 注:同じ女性の卵を長期間使用する場合、腺が除去されていない場合は、産卵の4〜5日後にこの手順を繰り返す必要があります。</li>
</ol>2.マイクロインジェクションの胚治療
<ol><li>0〜18時間齢の卵が入ったチューブに、~200μL(または卵の数に応じて卵を覆うのに十分な量)の5%(重量/体積)塩化ベンザルコニウム/水( 材料の表を参照)を追加します。.卵がチューブの底に落ち着かないように、絵筆で卵を5分間静かに回転させます(詳細については、Sharmaら4を参照)。マイクロピペットを使用して上清を取り除き、卵をチューブに残します。 注意: 塩化ベンザルコニウムは皮膚や目に腐食性があり、手袋と目の保護具を着用してください。</li>
	<li>卵の入ったチューブに蒸留(DI)水を~200μL加え、絵筆で渦巻き、マイクロピペットを使用してマイクロ遠心チューブから水を取り除きます。DI水でもう一度洗浄を繰り返します。</li>
	<li>純水で洗浄した後、5%(w/v)塩化ナトリウム(NaCl)を~200μL加え、絵筆で5分間静かに旋回させます。5分後にチューブから溶液を取り出し、卵をDI水で2回洗浄します。</li>
	<li>卵の入った微量遠心チューブに~100 μLの1%(w/v)NaCl溶液を加えます。卵が注射に使用されるまで、卵を1%(w / v)NaCl溶液に入れてください。</li>
	<li>約1時間後にマイクロインジェクションを開始します。このタイムラインは、卵の適切な乾燥に役立ち、卵が破裂するのを防ぎます。 注:卵は、生存に大きな影響を与えることなく、1%(w / v)NaCl溶液に7〜8時間保持できます。卵が注入または破裂するのが難しい場合、卵は十分に乾燥されておらず、さらに5%(w / v)NaClでさらに5分間処理できます。</li>
</ol>3.注射針の準備
<ol><li>アルミノケイ酸塩キャピラリーガラス(フィラメント付き、 材料表を参照)を製造元の指示に従ってニードルプラーに挿入します。</li>
	<li>ニードルプラーを次の設定に調整します:熱:575、プル:20、速度:50、時間:200、および圧力:700。</li>
	<li>ニードルプラーのプル機能をアクティブにし、追加の針に対してこのプロセスを繰り返します。</li>
	<li>引っ張った針は、きれいなペトリ皿にモデラーの粘土の線に刺して保管します。</li>
	<li>マイクロローダーチップを使用して注射混合物を針にロードします(材料の表を参照)。 注:ダニと蚊の胚注射に使用される針の比較を 図2に示します。</li>
</ol>4. マイクロインジェクションのスライドセットアップ
<ol><li>両面テープを使用して、2つのガラス顕微鏡スライドを接着し、約0.5 cmの隙間を残して卵を整列させ、注射中に卵が横転するのを防ぎます(図3A)。</li>
	<li>スライド間の隙間にある両面テープに透明フィルムドレッシング( 材料表を参照)を貼ります。フィルムドレッシングを隙間に完全に合わせるようにしてください。</li>
</ol>5.胚マイクロインジェクション
<ol><li>片毛の絵筆を使用して、スライドセットアップ(上)に一度に8〜10個の卵を揃えます。 注:スライドエッジに垂直な長軸(図3B)に整列した卵は、縦軸がエッジに平行に配置されている卵(図3C)よりも注入が容易です。垂直方向の卵(図3B)は注射に耐えることができ、生存率が向上します。</li>
	<li>卵を揃えたスライドを複合顕微鏡のステージに置きます。糸くずの出ないワイプを使用して、それらが保存されている1%NaCl溶液を取り除きます。</li>
	<li>充填された注射針をマイクロマニピュレーターに接続されたマイクロインジェクターに取り付けます( 材料表を参照)。</li>
	<li>マイクロインジェクターの高圧設定(>5,000hPa)を使用して、卵の表面に針をそっとこすりつけて針を開きます。</li>
	<li>針を開いた後、針の開口部に応じてマイクロインジェクターの圧力(1,000〜2,500hPa)を下げます。 注意: 開口部が小さいほど比較的高い圧力が必要になり、開口部が大きいほど圧力が低くなります。これは、注入されるコンストラクトの体積を制御するためである。針の開口部のサイズに応じて、注入量は1〜5 pLの範囲で変化します。</li>
	<li>スライド上のすべての卵をできるだけ早く10°〜15°の角度で注入し、湿った紙で裏打ちされたペトリ皿でスライドをすぐに高湿度条件に移動します。卵が注入されるとすぐに、それらは乾燥し始めます。 注:一度に少数の卵を注入すると、注射の成功と生存確率が高まります。針は胚の逆流によって詰まります。先端がまだ鋭い場合は、詰まった針を取り除くために、スライドの端に追加された1%NaClの小さな液滴に針を移動します。毛細管現象は小さな詰まりを取り除きます。針がすでに鈍い場合は、交換してください。</li>
</ol>6.胚の注射後のケア
<ol><li>注入された胚を含むスライドを、湿ったろ紙で裏打ちされた大きなペトリ皿に入れます。 注:少なくとも5〜6時間は卵を乱さないことが重要です。これにより、注射創を適切に密閉することができます。攪拌すると注射創が開き、細胞質がにじみ出て卵子が死亡することがあります。</li>
	<li>5〜6時間後、注入された胚を付着させた透明フィルムドレッシングに少量のDI水を加える。絵筆を使用して、卵をそっと動かします。卵を小さなペトリ皿(10 cm)に移し、DI水に浸します。 注:フィルムドレッシングにより、注射後の卵子を簡単に除去できます。フィルムドレッシングに水滴を加えると、卵は水と一緒に動き始めます。</li>
	<li>卵を水に沈めたまま、ペトリ皿を27°C、>90%RHのインキュベーター内の6クォートのプラスチック箱に入れます。</li>
	<li>卵を定期的に、最初の数日間は毎日、その後幼虫が孵化し始めるまで3〜4日ごとにチェックします。 注意: マイクロインジェクション中に多数の卵が損傷した場合は、1週間後にDI水をそっと排水すると、死んだ卵の真菌の成長を防ぐことができます。</li>
	<li>幼虫が注入された胚から孵化し始めたら(現在の実験室のセットアップでは注射後21〜25日)、それらを毎日チェックし、孵化した幼虫を上部にスクリーンを備えたガラスバイアルに移します。幼虫は水中で孵化し、~1〜2週間生存することができます。</li>
	<li>卵に目に見える表現型をもたらす可能性のある構築物を注入した場合、幼虫4 をスクリーニングします。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).</li>
	<li>Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).</li>
	<li>Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).</li>
	<li>Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).</li>
	<li>Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).</li>
	<li>Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).</li>
	<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
	<li>Criscione, F., O&#39;Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).</li>
	<li>Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).</li>
	<li>Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).</li>
	<li>Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).</li>
	<li>Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).</li>
	<li>Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene&#39;s organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).</li>
	<li>Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).</li>
	<li>Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gen&#233;&#39;s) organ in ixodid ticks. Tissue &#38; Cell. 21 (1), 113-122 (1989).</li>
	<li>Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental &#38; Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).</li>
	<li>Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

これは、初期のダニ胚をうまく注入するために開発された最初のプロトコルです。生存率は~4%-8%で、これは他の確立された昆虫モデルの胚注入に匹敵します5。
これは最初のプロトコルであるため、このプロトコルはさらに洗練され、個々のダニ種に特化することが期待されます。特に、注入のタイミングは、胚形成、特に細胞化のタイミングに応じて、種ごとに異なります。予備データは、 I. scapularis の卵が産卵後の最初の24時間で急速な核分裂を経ず、数日後に細胞化が起こることを示唆しています(未発表データ)。このプロトコルは、プラスミド送達4、CRISPRを介した遺伝子ノックアウト4、および細菌(ボルバキア)の送達にすでに使用されています(表1)。この胚注入プロトコルは、トランスジェニックダニを生成する機会を提供し、遺伝子ノックアウトおよびノックイン研究をあらゆる研究室で実行可能にすることが期待されて...

ダニは医学的および獣医学的に重要なベクターであり、さまざまなウイルス性、細菌性、原生動物病原体および線虫を感染させることができます1,2。米国東部では、黒脚ダニ、Ixodes scapularisは、ライム病(LD)病原体であるスピロヘータボレリアブルグドルフェリの重要なベクターです。米国では毎年40万人以上のLDが報告されており、米国で最大のベクター媒介感染症となっています1。B. burgdorferiに加えて、4つの細菌(アナプラズマ食サイトフィルム、B. mayonii、B. miyamotoi、およびEhrlichia muris eauclarensis)、1つの原虫寄生虫(Babesia microti)、および1つのウイルス(Powassanウイルス)を含む6つの他の微生物がI.肩甲骨によって伝染し、このダニ種を主要な公衆衛生上の懸念事項にしています3。.ダニ媒介性疾患は近年より蔓延していますが、ダニの研究は、ダニの独特の生物学と遺伝的および機能的ゲノムツールの適用に関連する課題のために、蚊などの他の節足動物ベクターに遅れをとっています4,5。
遺伝子編集技術、特にCRISPR/Cas9により、非モデル生物での機能ゲノミクス研究が可能になりました。生物において遺伝性突然変異を作り出すために、胚注入は、生殖系列6、7、8、9を改変するための構築物を送達するための好ましい方法であり続ける。しかし、最近まで4、ダニの卵は胚を殺さずに注射することは難しすぎるか不可能でさえあると考えられていました10,11。卵の厚いワックス層、硬い絨毛膜、および高い楕円形内圧は、ダニへの胚注入を妨げる主な障害のいくつかでした。成体の、血液を与えられたI. scapularisは、3〜4週間で最大2,000個の卵12個の単一のクラッチを堆積させます(約100個の卵/日)。卵は単独で産まれ、各卵は母親の腺ジェネの器官13,14,15の突起または「角」によって分泌されるワックスでコーティングされています。このワックスは卵を乾燥から保護し、抗菌化合物を含んでいます15。ダニの卵をうまく注入するには、ワックス層を取り除き、絨毛膜を柔らかくし、卵を乾燥させて卵内圧を下げて、注射が卵を不可逆的に損傷しないようにすることが重要です。生殖系列の形質転換を成功させるための胚注射の決定的な重要性を理解し、肩甲骨菌のプロトコルが開発され、CRISPR/Cas9コンストラクトを送達し、安定した生殖系列変異を生成するために使用できます4。I. scapularis研究への貢献に加えて、このプロトコルは他のダニ種にも最適化される可能性があります。

<table><tbody><tr><td>ケイ酸アルミニウム毛細血管、フィラメント付き</td><td>サッター器具</td><td>AF100-64-10</td><td>胚注射</td></tr><tr><td>塩化ベンザルコニウム 50% 水、25g</td><td>TCI-America</td><td>B0414</td><td>胚処理、25 g 約 25 mL</td></tr><tr><td>濾紙</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>注射後ケア</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>300-101</td><td>遺伝子の臓器操作</td></tr><tr><td>ラボワイプ</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>88-115</td><td></td></tr><tr><td>マイクロローダーチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>930001007</td><td>引っ張られた針の装填</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>サッター機器</td><td>ROE-200</td><td>胚注入</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド-プレーン、グランドエッジ</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>29-100</td><td>胚のアライメント、グランドエッジが好ましく、斜めのエッジが可能視界から卵を隠す</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>研究製品インターナショナル</td><td>S23020-500.0</td><td>胚治療</td></tr><tr><td>ニードルプラー</td><td>サッター器具</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>永久両面テープ</td><td>スコッチ</td><td>34-8716-3417-5</td><td>胚アライメント</td></tr><tr><td>ペトリプレート</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>32-107G</td><td>ポストインジェクションケア</td></tr><tr><td>テガダーム/透明フィルムドレッシング</td><td>3M ヘルスケア</td><td>1628</td><td>胚のアライメント</td></tr><tr><td>タングステン針</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10130-10</td><td>遺伝子の臓器操作</td></tr><tr><td>タングステンワイヤー</td><td>アマゾン</td><td>B08DNT7ZK3</td><td>遺伝子の臓器操作</td></tr><tr><td>XenoWorksデジタルマイクロインジェクター</td><td>サッター機器</td><td>MPC-200</td><td>胚注射</td></tr></tbody></table>

クロマダニの遺伝子編集のための胚注入技術

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

ダニは、さまざまなウイルス性、細菌性、および原生動物の病原体を感染させる可能性があるため、医学的および獣医学的に重要なベクターと見なされます。ダニ媒介性疾患の負担が増大しているにもかかわらず、機能研究のための遺伝子形質転換ツールをダニのユニークな生物学に適用する際の課題のために、ダニに関する研究は昆虫病媒介動物に遅れをとっています。蚊が媒介する病気を減らすために遺伝的介入が注目を集めています。しかしながら、そのような介入の開発は、胚を注入することによる安定した生殖系列形質転換を必要とする。そのような胚注入技術は、ダニを含むキリセレートには欠けている。ダニ胚の外部の厚いワックス層、硬い絨毛膜、高い楕円形内圧などのいくつかの要因は、以前はダニの胚注入プロトコルの発達を妨げていたいくつかの障害です。本研究ではこれらの障害を克服し、クロマダニ Ixodes scapularis の胚注入技術について述べる。この手法は、安定した生殖細胞系列形質転換のためのCRISPR/Cas9などの成分を送達するために使用できます。

I. scapularisの成功した胚注入プロトコルは、この記事で説明されています。産卵雌は、部分的にワックスをかけた卵の乾燥を避けるために高湿度に保たれました。ワックス層を除去し、妊娠した雌の遺伝子器官(ワックス腺)を切除することによりダニ胚を注入した(図1A-E)。首の短いアルミノケイ酸塩ガラス針を使用しました(図2)。この形状は、昆虫卵注射に使用される長首(テーパー)針よりも圧力に耐えることができるため、ダニの卵の注入に理想的でした。ダニの卵の球形は、針の挿入中にスライドから卵が転がらないようにするために、舞台裏にスライドプラットフォーム(図3A)を必要とします。肩甲骨I.の初期の胚発生は不明であるため、生殖細胞形成のタイミングと場所も不明です。したがって、発育の早い段階(12〜18時間齢)に卵を注入することを選択し、卵の長軸をスライドの端に垂直に揃え...

本プロトコルは、ダニ胚を注入するための方法を記載する。胚注入は、トランスジェニック株を生成するための遺伝子操作のための好ましい技術である。

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

これは、チェリセラタ種の最初の胚注入プロトコルです。ダニ胚を注入する能力は、多くの研究ライン、特にダニ遺伝子機能とダニ病原体相互作用の研究を開くでしょう。この技術は、ダニ遺伝子の機能研究に関する将来の研究を可能にし、遺伝子駆動システムを用いたダニ集団制御の基礎を提供します。この方法は、ダニとそれらが抱く病原体との間の相互作用の分子レベルでの理解を容易にするであろう。これにより、ライム病やその他の病原体のワクチン開発に使用できるタンパク質を特定することができます。ダニ病原体の相互作用や摂食中のダニによる宿主への病原体の伝染などのいくつかの研究分野は、この研究の恩恵を受けるでしょう。ダニが宿主の免疫応答をどのように回避するか、DNA修復メカニズムの違いなど、より根本的な質問も理解できるようになりました。この手順を実行する前に理解する必要があるダニ生物学のいくつかの側面があります。胚の高い内圧は、針に触れると破裂します。注射用の胚を準備することは非常に重要です。はじめに、注射の1週間前に産卵を開始するために、女性を摂氏4度から摂氏27度のインキュベーターに移します。雌が産卵を開始した3〜4日後、遺伝子の臓器切除のために雌を準備しながら、細い先端の絵筆を使用して卵を取り除きます。腺を空にするには、顕微鏡下でスライドガラスに妊娠ダニを配置し、口の部分が腹側と背側の両方に見えるようにします。次に、背側の口の部分の後ろの領域を慎重に穿刺し、鉗子を使用して腹側に圧力をかけます。糸くずの出ないワイプの端を置き、穿刺部位から出てくる液体ワックスを取り除きます。あるいは、解剖によって腺を空にする代わりに、組織接着剤などの糊をダニ口部の周りに使用することができる。雌が再び産卵を開始したら、細かい絵筆を使用して新たに堆積した卵を集め、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。生後200〜18時間の卵を含むチューブに約5%塩化ベンザルコニウム水を追加します。卵がチューブの底に落ち着かないように、絵筆で卵を5分間静かに回転させ、マイクロピペットを使用して上清を取り除き、卵をチューブに残します。卵の入ったチューブに約200マイクロリットルの蒸留水を加えます。絵筆で渦巻き、マイクロピペットを使用してマイクロ遠心チューブから水を取り除きます。蒸留水で洗浄した後、約200マイクロリットルの5%塩化ナトリウムを加え、絵筆で5分間静かに回転させます。次に、5分後にチューブから溶液を取り出し、蒸留水で卵を2回洗います。次に、卵を入れたマイクロ遠心チューブに約100マイクロリットルの1%塩化ナトリウム溶液を加えます。まず、2枚のガラス顕微鏡スライドを接着し、両面テープを使用して卵の位置合わせをサポートするために約0.5センチメートルの隙間を残し、スライド間の隙間にある両面テープに透明フィルムドレッシングを塗布します。次に、絵筆を使用してスライドセットアップで一度に8〜10個の卵を揃えます。次に、卵を揃えたスライドを複合顕微鏡のステージに置き、それらが保存されている糸くずの出ないワイプを使用して1%塩化ナトリウム溶液を取り除きます。充填された注射針をマイクロマニピュレーターに接続されたマイクロインジェクターに取り付けます。次に、マイクロインジェクターの高圧設定を使用して卵の表面に針をそっとこすりつけて針を開きます。針を開いた後、針の開口部に応じてマイクロインジェクターの圧力を下げます。次に、スライド上のすべての卵をできるだけ早く10〜15度の角度で注入し、フットペダルをすばやく押し、湿ったペーパータオルでペトリ皿でスライドを高湿度条件にすぐに移動します。湿ったろ紙で裏打ちされた大きなペトリ皿に注入された胚を含むスライドを5〜6時間置いた後、注入された胚を取り付けた透明フィルムドレッシングに蒸留水を少量加えます。次に、絵筆を使用して卵をそっと動かします。次に、卵を小さなペトリ皿に移し、蒸留水に浸します。卵を水に沈めたまま、ペトリ皿をインキュベーター内の6クォートのプラスチックの箱に入れ、摂氏27度、相対湿度90%以上で入れます。幼虫が注射後21〜25日で注射された胚から孵化し始めたら、毎日それらをチェックし、孵化した幼虫をスクリーンを上にしたガラスバイアルに移します。結果は、12〜18時間齢の胚発生の初期に卵子を注入し、スライドの端に垂直に卵の長軸を揃えると、注入された卵の生存率が高くなることを実証しました。注射されたすべての卵のうち、最大8.5%が生き残り、幼虫が孵化した。この手順を開始する前に、ステップ2.4、マダニからのワックスの除去、およびステップ3.1から3.4、塩化ベンザルコニウムによる胚の絨毛膜の軟化、および塩化ナトリウム溶液による胚の乾燥を覚えておくことが重要です胚注入を成功させるため。この方法は主にダニ遺伝子編集のために開発されたものであり、これにより、ダニの遺伝子機能を理解するのに役立つノックアウトとノックインを行うことができます。この技術により、他の多くの生物が利用できる遺伝子編集ツールの使用をダニの研究に適用できるようになります。そして、これはダニ分子生物学研究を加速するでしょう。

embryo-injection-technique-for-gene-editing-black-legged-tick-ixodes

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

トランスジェニック蚊を取得するA.ネッタイシマカの胚のマイクロインジェクション

このビデオでは、胚マイクロインジェクション技術を通じて、ハマダラカの蚊の胚への遺伝子ドライブ構築物の送達を実演します。この手順により、相同組換えを通じて送達されたDNAコンストラクトを生殖細胞に統合し、形質転換された蚊の集団を生成することができます。...

蚊胚マイクロインジェクション:ハマダラカの胚卵黄に外因性DNAを送達して生殖細胞変異を生成する技術

地中海のショウジョウバエ(メドフライ)Ceratitis...

世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、<em&gt;チチュウカイミバエ</em

健康的な実験室飼育の生産は、ダニの生物学の研究、およびダニ病原体相互作用に不可欠であるダニ。ここでは、費用対効果およびマウスにストレスの少ないです未熟ダニ供給のための単純なプロトコルを示しています。...

飼育<em&gt; Ixodes肩甲骨、</em&gt;ブラック・ティック・ティック：未熟期をマウスに与える

キョウソヤドリコバチ胚のマイクロインジェクションは、ゲノムの遺伝の変更を生成するため不可欠な方法です。マイクロインジェクションと大幅にこの生物の将来ゲノム操作を容易にするキョウソヤドリコバチ胚移植の手順の詳細については、ここで説明しました。...

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

ここでは、クリケットの卵を注入するプロトコルを提示します, を含むが、これらに限定されないクリケットの多くの実験で基礎的な方法として機能する技術, RNA干渉とゲノム操作.

グリルス・ビマキュラトゥス・エッグを注入する

このプロトコルは、CRISPR/Cas9遺伝子編集ツールで動作するように最適化された Culex quinquefasciatus...

キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術

我々は、卵の飼育、マイクロインジェクション、およびゲノム編集後に変異株を生成し維持するために、ファイヤーブラット サーモビア家電...

ファクトブラトサーモビア家電におけるゲノム編集のための卵マイクロインジェクションと効率的な交配

昆虫の真社会性の多くの特徴は、コロニー内のコミュニケーションと分業に依存しています。マイクロインジェクションとCRISPRを介した突然変異誘発によるアリ胚の主要な調節遺伝子の遺伝子操作は、真社会性昆虫の利他的行動の性質に関する洞察を提供します。...

アリハルペグナトス塩析装置におけるCRISPRを介した突然変異誘発のための胚注射

この論文の全体的な目標は、ニワトリ胚への外因性物質の卵管細胞内注入 において...

オヴォで ニワトリ胚における血管内注射

学ぶクロマダニの胚注入技術による遺伝子編集手法。Chelicerata種として初めて確立されたこの方法は、ダニの遺伝子機能と病原体相互作用の研究を促進し、ライム病などのワクチン開発や防除戦略の基盤となる。

クロマダニの遺伝子編集のための胚注入技術

さらに動画を探す