クロマダニの遺伝子編集のための胚注入技術

これは、チェリセラタ種の最初の胚注入プロトコルです。ダニ胚を注入する能力は、多くの研究ライン、特にダニ遺伝子機能とダニ病原体相互作用の研究を開くでしょう。この技術は、ダニ遺伝子の機能研究に関する将来の研究を可能にし、遺伝子駆動システムを用いたダニ集団制御の基礎を提供します。

この方法は、ダニとそれらが抱く病原体との間の相互作用の分子レベルでの理解を容易にするであろう。これにより、ライム病やその他の病原体のワクチン開発に使用できるタンパク質を特定することができます。ダニ病原体の相互作用や摂食中のダニによる宿主への病原体の伝染などのいくつかの研究分野は、この研究の恩恵を受けるでしょう。

ダニが宿主の免疫応答をどのように回避するか、DNA修復メカニズムの違いなど、より根本的な質問も理解できるようになりました。この手順を実行する前に理解する必要があるダニ生物学のいくつかの側面があります。胚の高い内圧は、針に触れると破裂します。

注射用の胚を準備することは非常に重要です。はじめに、注射の1週間前に産卵を開始するために、女性を摂氏4度から摂氏27度のインキュベーターに移します。雌が産卵を開始した3〜4日後、遺伝子の臓器切除のために雌を準備しながら、細い先端の絵筆を使用して卵を取り除きます。

腺を空にするには、顕微鏡下でスライドガラスに妊娠ダニを配置し、口の部分が腹側と背側の両方に見えるようにします。次に、背側の口の部分の後ろの領域を慎重に穿刺し、鉗子を使用して腹側に圧力をかけます。糸くずの出ないワイプの端を置き、穿刺部位から出てくる液体ワックスを取り除きます。

あるいは、解剖によって腺を空にする代わりに、組織接着剤などの糊をダニ口部の周りに使用することができる。雌が再び産卵を開始したら、細かい絵筆を使用して新たに堆積した卵を集め、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。生後200〜18時間の卵を含むチューブに約5%塩化ベンザルコニウム水を追加します。

卵がチューブの底に落ち着かないように、絵筆で卵を5分間静かに回転させ、マイクロピペットを使用して上清を取り除き、卵をチューブに残します。卵の入ったチューブに約200マイクロリットルの蒸留水を加えます。絵筆で渦巻き、マイクロピペットを使用してマイクロ遠心チューブから水を取り除きます。

蒸留水で洗浄した後、約200マイクロリットルの5%塩化ナトリウムを加え、絵筆で5分間静かに回転させます。次に、5分後にチューブから溶液を取り出し、蒸留水で卵を2回洗います。次に、卵を入れたマイクロ遠心チューブに約100マイクロリットルの1%塩化ナトリウム溶液を加えます。

まず、2枚のガラス顕微鏡スライドを接着し、両面テープを使用して卵の位置合わせをサポートするために約0.5センチメートルの隙間を残し、スライド間の隙間にある両面テープに透明フィルムドレッシングを塗布します。次に、絵筆を使用してスライドセットアップで一度に8〜10個の卵を揃えます。次に、卵を揃えたスライドを複合顕微鏡のステージに置き、それらが保存されている糸くずの出ないワイプを使用して1%塩化ナトリウム溶液を取り除きます。

充填された注射針をマイクロマニピュレーターに接続されたマイクロインジェクターに取り付けます。次に、マイクロインジェクターの高圧設定を使用して卵の表面に針をそっとこすりつけて針を開きます。針を開いた後、針の開口部に応じてマイクロインジェクターの圧力を下げます。

次に、スライド上のすべての卵をできるだけ早く10〜15度の角度で注入し、フットペダルをすばやく押し、湿ったペーパータオルでペトリ皿でスライドを高湿度条件にすぐに移動します。湿ったろ紙で裏打ちされた大きなペトリ皿に注入された胚を含むスライドを5〜6時間置いた後、注入された胚を取り付けた透明フィルムドレッシングに蒸留水を少量加えます。次に、絵筆を使用して卵をそっと動かします。

次に、卵を小さなペトリ皿に移し、蒸留水に浸します。卵を水に沈めたまま、ペトリ皿をインキュベーター内の6クォートのプラスチックの箱に入れ、摂氏27度、相対湿度90%以上で入れます。幼虫が注射後21〜25日で注射された胚から孵化し始めたら、毎日それらをチェックし、孵化した幼虫をスクリーンを上にしたガラスバイアルに移します。

結果は、12〜18時間齢の胚発生の初期に卵子を注入し、スライドの端に垂直に卵の長軸を揃えると、注入された卵の生存率が高くなることを実証しました。注射されたすべての卵のうち、最大8.5%が生き残り、幼虫が孵化した。この手順を開始する前に、ステップ2.4、マダニからのワックスの除去、およびステップ3.1から3.4、塩化ベンザルコニウムによる胚の絨毛膜の軟化、および塩化ナトリウム溶液による胚の乾燥を覚えておくことが重要です胚注入を成功させるため。

この方法は主にダニ遺伝子編集のために開発されたものであり、これにより、ダニの遺伝子機能を理解するのに役立つノックアウトとノックインを行うことができます。この技術により、他の多くの生物が利用できる遺伝子編集ツールの使用をダニの研究に適用できるようになります。そして、これはダニ分子生物学研究を加速するでしょう。