Name: 生理的サイズのマイクロ流体培養装置における上皮細胞単層の作製と構造評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学ぶ マイクロ流体動的培養環境における上皮細胞単層の作製とファロイジン染色による構造評価法。共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、細胞層のコンフルエンシーと均一性を定量的に解析する技術です。

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著者らは、マイクロ流体チャネル構築に使用される3M接着剤とマイラーシートの切断パターンを設計し、細胞培養培地の流量とシリンジポンプのプログラミングをテストしたAlan Shepardsonを認めています。資金は、NIH R01 HL0142702、NSF CBET 1706801、およびニューカム-チューレーン大学学部長の助成金によって提供されました。

NCI-H441ヒト上皮性肺細胞株を本研究に使用した( 材料表参照)。
1. マイクロ流体チャネルでの細胞培養
<ol><li>マイクロ流体流路を作製し、以下の手順で前処理を行います。<ol><li>シングルチャネルフローアレイ( 材料表を参照)を取得し、上部をポリカーボネートベースプレートから分離します。</li>
		<li>寸法60 mm x 22 mmの#1.5長方形カバーガラス(厚さ0.17 mm)を入手します。超音波浴でカバーガラスの表面を洗浄し、片面を0.1 mg/mLのPoly-D-リジン溶液で室温で5分間処理してから、60°Cで30分間乾燥させます。</li>
		<li>フローアレイ上部と流路(長さ50mm、幅5mm)の寸法に合わせてレーザーカットした厚さ0.13mmの両面接着剤( 材料表参照)をフローアレイ上部に貼り付け、流路切り欠き17を正確に位置合わせするように注意します。</li>
		<li>チャネルの切り欠きを正確に位置合わせするように注意しながら、フローアレイの上部と流路の寸法に合わせてレーザーカットされた厚さ0.1 mmのマイラースペーサー( 材料表を参照)を粘着ストリップに貼り付けます。</li>
		<li>目的のチャネル高さが得られるまで、手順1.1.3と1.1.4を繰り返します(たとえば、チャネルの高さが0.6 mmの場合、2つのスペーサーと3つの粘着ストリップを使用します)。</li>
		<li>長方形のカバーガラスを一番下の粘着ストリップに貼り付け、ポリ-D-リジン処理された側を接着剤に向けます。組み立てが完了したら、図1に示すように、構造の上部と下部にしっかりと均等な圧力をかけ、 1分間保持します。 注意: カバーガラス、接着剤、スペーサー、フローアレイトップを含むチャネルエンクロージャの構築が完了しました。</li>
		<li>シリンジを使用してチャネルを脱イオン水ですすぎ、同時に漏れをチェックします。</li>
		<li>チャネルエンクロージャを紫外線(UV)滅菌器で30分間滅菌します18.</li>
		<li>滅菌技術を使用して、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の2.0 μg/mLヒトフィブロネクチン( 材料表を参照)でチャネルを処理し、37°Cで少なくとも30分間インキュベートします19。</li>
	</ol></li>
	<li>マイクロ流体流路で以下の手順で細胞培養を行う。<ol><li>滅菌層流フードで、マイクロピペットを使用して、10%ウシ胎児血清(FBS)を含むRPMI 1640培地中のNCI-H441細胞の均一な懸濁液を移し( 材料の表を参照)、それぞれ表面密度が150,000細胞/cm2の細胞を持つ2つのマイクロ流体チャネルを播種します。<ol><li>50 mm x 5 mm x 0.6 mm チャンネルの場合は、0.25 mL の 2.5 x 106 細胞/mL懸濁液を使用して、各チャンネルとポートの一部を満たします。明視野顕微鏡を使用して、細胞がチャネル内に均等に分布していることを確認します。</li>
		</ol></li>
		<li>プログラム可能なシリンジポンプ(材料表を参照)を使用して、2つのチャネルをそれぞれ37°Cで5%CO2で24時間および48時間培養し、使用済み培地をチャネルから引き出し、新鮮な培地をチャネルから引き出し、パラフィンフィルムで覆われたカットオープン20mLシリンジで構成されるチャネル入口に取り付けられた滅菌培地リザーバーからチャネルに新鮮な培地を引き出しました。<ol><li>細胞播種後の10分間の待機期間の後、0.2 μL/minから始まり、4時間10 μL/minまで上昇する可変流量で、リザーバーからチャネルを介して新鮮な培地を導入してポンプで送り、その後その速度を維持します20。 注:この可変流速は、細胞が(1)培養表面に重力的に沈降し、(2)培養表面に接着し、(3)コンフルエントな単層を形成することを可能にする培養条件を提供します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>ホルムアルデヒド溶液を用いてマイクロ流体チャネル内の細胞固定を行います。 注意: ホルムアルデヒドは有毒であり、適切な化学ヒュームフード21で取り扱う必要があります。<ol><li>ケミカルヒュームフードで、PBS(メタノールフリー)中の4%ホルムアルデヒドを使用してホルムアルデヒド溶液を調製し( 材料の表を参照)、2つの4 mL部分を作成し、最初のものを1%ホルムアルデヒドの濃度に希釈し、2番目のホルムアルデヒドを希釈剤としてダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS;Ca2+ およびMg2+を含む)を使用します。ホルムアルデヒド溶液を5 mLシリンジに分離し、それに応じてラベルを付けます。20 mLのDPBSを別の20 mLシリンジに吸い込みます。</li>
		<li>培養装置からマイクロ流体チャネルを取り外し、化学ヒュームフードに入れます。</li>
		<li>固定および染色装置を組み立てます。<ol><li>オスのルアーロックからホースバーブアダプター(材料表を参照)を介して、3方向活栓のサイドポートに10 cmのトランスファーチューブを取り付け、活栓をフローアレイの入口ポートに接続します。</li>
			<li>次に、同じタイプのホースバーブアダプターを使用して、別の10 cmセグメントのトランスファーチューブをフローアレイの出口ポートに取り付けます。</li>
			<li>最後に、両方の移送チューブの自由端を、ラベルの付いた空の50 mL円錐形遠沈管など、化学的およびバイオハザードに適した廃棄物容器に固定します。</li>
		</ol></li>
		<li>活栓を回してフローアレイ入口ポートを遮断し、廃棄物ラインをDPBSで洗い流します。次に、活栓を回して廃棄物ラインを遮断し、2 mLのDPBSで細胞をゆっくりと洗浄します。毎回新しい溶液を使用してフラッシング手順を繰り返します。新しい溶液(または溶液の濃度)がチャネルに導入されます。</li>
		<li>2 mLの1%固定液をチャネルにゆっくりと押し込み、5分間放置します22。</li>
		<li>2 mLの2%固定液をゆっくりとチャネルに押し込み、15分間放置します。</li>
		<li>2 mLの新鮮なDPBSを3つの別々のインスタンス(各5分)でチャネルにゆっくりと導入することにより、細胞を洗浄します。</li>
		<li>両方のマイクロ流体チャネルに対して手順1.3.3-1.3.7を並行して実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>染色、透過処理、およびマイクロ流体チャネル内の細胞への封入剤の添加を行います。<ol><li>DPBS1mLあたり1 mgのサポニン( 材料表を参照)を加えて4 mLの溶液を生成し、穏やかにボルテックスして23を混合することにより、0.1%サポニン溶液を調製します。8 mLのDPBSを20 mLシリンジに吸い込みます。</li>
		<li>F-アクチン染色ファロイジン試薬と核染色ヘキスト試薬( 材料表参照)を0.1%サポニン溶液に、サポニン溶液1mLあたり各試薬を2滴(0.1 mL)加えます。調製した染色・透過処理液をアルミホイル24で覆って光から遠ざけてください。</li>
		<li>少量の染色/透過処理溶液でラインを洗い流し(ステップ1.3.4で説明)、次に2 mLの溶液をマイクロ流体チャネルに導入し、チャネルをアルミホイルで覆ってから、室温で30分間放置します。</li>
		<li>染色/透過処理溶液を2 mLのDPBSで2回、フラッシュごとに5分間洗い流します。</li>
		<li>画質を向上させるには、適切な封入メディア(顕微鏡の対物レンズオイルとカバーガラスに屈折率が近い、 材料表を参照)をチャンネルに追加します。<ol><li>マイクロピペットを使用して、マイクロ流体チャネルの各ポートに最小量のソフトセット退色防止封入剤を導入し、底面が完全に覆われ、所望のイメージング領域25内に気泡がトラップされないようにする。チャネルの端をシールし、明視野顕微鏡で観察して細胞層の完全性を確認します。</li>
		</ol></li>
		<li>両方のマイクロ流体チャネルに対して手順1.4.3〜1.4.5を並行して実行します。 注:最高の画質を得るために、染色後できるだけ早く細胞をイメージしてください。光退色が発生した場合、または長期保存が必要な場合は、退色防止またはサンプル保存特性を備えた他の封入剤を使用できます。硬化しにくい封入剤は、細胞の3D構造、ひいてはセル層を歪めることに注意してください。このため、ソフトセット封入メディア26が好ましい。</li>
	</ol></li>
	<li>マイクロ流体チャネル内の細胞を以下の手順に従って画像化する。<ol><li>レーザー出力、ゲイン、オフセット、スキャン速度、スキャン領域、スキャンフォーマット、解像度、ピンホール直径27などのスキャンパラメータを含む共焦点顕微鏡(材料表を参照)の設定を調整します。</li>
		<li>目的の画像パラメータと条件が満たされるまで、リファレンススキャンとZスタックを使用して、イメージング位置をテストします。40倍の油浸対物レンズに到達して最適化されるまで、順次高倍率の対物レンズでのダイヤルインパラメータ28.</li>
		<li>フローアレイベースプレートを基準として、入口側の第1電極の予定位置、中心と前の位置の中間、中心、中心と最後の電極の位置(出口側)の中間、および最後の電極の5つの位置にZスタックを構築し、 図 2 に示すように。</li>
	</ol></li>
	<li>画像処理とデータ分析を実行します。<ol><li>共焦点顕微鏡ソフトウェアパッケージを使用してXZおよびYZ断面をエクスポートします( 材料表を参照)。</li>
		<li>エッジ検出機能(閾値15.0)を備えた画像処理ソフトウェア(材料表参照)を使用して、画像の外側のマジックワンドツールを使用してピクセル単位の総画像領域を測定し、次にセル層29の画像外側の部分でマジックワンドツールを使用してセル層の総断面積をピクセル単位で除いた領域を測定します。</li>
		<li>データ処理ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、総面積ピクセル値から外部面積ピクセル値を減算し、断面積ピクセル値を求めます。</li>
		<li>特定の画像の顕微鏡ソフトウェアに示されているように、ピクセル値にμm/ピクセル値の2乗を掛けて、断面積ピクセル値をμm2 値に変換します(40倍油浸レンズでズームなしで1024p解像度で撮影されたZスタックの場合は0.31 μm/ピクセル)。</li>
		<li>データと結果のグラフの平均と標準偏差を計算します。</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64148/64148fig01.jpg"> 図1:マイクロ流体チャネル構造の分解図。上部の要素はフローアレイの上部、薄い灰色の要素は粘着ストリップ、薄い青色の要素はマイラースペーサー、下部の要素は長方形のカバーガラスです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64148/64148fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64148/64148fig02.jpg"> 図2:マイクロ流体培養チャネルの一貫して層を生成する領域に沿った5つのイメージング位置。 イメージング位置は以下の通りである:入口側、第1電極が無傷のフローアレイ上に位置する場所の近く。入口側の位置とチャネルの中心の中間。チャネルの中心。中心側と出口側の位置の中間、および出口側、最後の電極が無傷のフローアレイ上にある場所の近く。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64148/64148fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
2. 8ウェルチャンバーカバーガラスでの細胞培養
<ol><li>8ウェルチャンバーカバーガラスの前処理を行います。<ol><li>#1.5カバーガラスと細胞接着性を高める表面処理で製造された滅菌8ウェルチャンバーカバーガラスを入手します(図3、 材料表を参照)。</li>
		<li>滅菌技術を用いて、培養ウェルの表面をPBS中の2.0 μg/mLヒトフィブロネクチンで処理し、37°Cで少なくとも30分間インキュベートします19。</li>
	</ol></li>
	<li>チャンバー付きカバーガラス内で、以下の手順で細胞培養を行います。<ol><li></li><li></li></ol></li><li> <ol><li></li><li><li><li></li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li><li><li><ol><li> </li></ol></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></ol></li><li><ol><li><li></li><li><li></li><li></ol></li></ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64148/64148fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64148/64148fig03large.jpg" target="_blank"></a>

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著者は利益相反を宣言しません。

提示されたプロトコルは、シングルチャンネルマイクロ流体フローアレイの動的環境、および従来の8ウェルチャンバーカバーガラスの静的環境におけるNCI-H441ヒト肺上皮細胞の培養、架橋固定、染色、透過処理、および共焦点顕微鏡可視化について説明しています。マイクロ流体細胞培養プロトコルでは、高速フローが細胞を洗い流したり、細胞単層の正常な組み立てを妨げたりする可能性があるため、細胞培養培地のフロー条件が最も重要です。一方、低速流は、マイクロ流体チャネルの不透過性の性質ならびに流動特性によって課せられる拡散制限のために、細胞層を「飢餓」または「窒息させる」(それぞれ不十分な栄養および酸素の利用可能性)可能性がある30。10分間の待機期間(その間、細胞は元々チャネルを満たしたのと同じ培地に懸濁されたままになります)から始めて、0.2 μL/minの流速に進み、最終的に4時間かけて10 μL/minまで上昇することで、これらの競合するニーズはバランスが取れており、細胞の接着と生存の両方を促進します。
プロトコルのもう一つの重要なステップは、構築と...

急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は、肺実質の損傷に対する侮辱および損傷の伝播から生じる急性状態であり、肺胞の肺水腫、不十分なガス交換、およびその後の低酸素血症をもたらします1。これにより、炎症誘発性サイトカイン放出、好中球動員、毒性メディエーター放出、および組織損傷のサイクルが開始され、それ自体がさらなる炎症反応を引き起こします2。さらに、気道を安定させ、反復的な動員/脱動員(R / D)によって引き起こされる損傷を防ぐ肺サーファクタントは、ARDS中に発生する化学プロセスによって不活性化されるか、そうでなければ機能不全になり、周囲の実質にさらなるストレスと損傷をもたらす可能性があります3。十分な損傷が続く場合は、適切な全身酸素化を確保するために機械的換気が必要になる場合があります4。しかし、人工呼吸器は、過膨張中に課せられる機械的ストレス(体積外傷)および/または流体閉塞気道の気液界面のR / D(無テレトラウマ)によって引き起こされる肺実質の損傷として特徴付けられる人工呼吸器誘発性肺損傷(VILI)の可能性を含む、独自の課題と外傷を課します5.無遠外傷モデルにおいて(流体閉塞細気管支のように)気液界面に曝露された上皮細胞が経験する圧力勾配は、透過性に起因する閉塞反応(POOR)をもたらし、損傷のPOOR-get-POORerの好循環につながる可能性があります6,7,8。
in vitro 実験は、これらの現象に対するマイクロスケールの洞察を提供することができますが、生理学的に関連する次元を持つマイクロ流体チャネル環境での現在の研究は、いくつかの課題に直面しています9。一つには、細胞培養条件の最適化は、培地フローパラメータ、培養期間、およびその他の培養条件が最適な細胞層形成を可能にする狭い交差点が存在するため、マイクロ流体環境での細胞培養研究への参入に大きな障壁をもたらします。これには、マイクロ流体培養チャネルエンクロージャの酸素不透過性によって課せられる拡散制限が含まれます。低流速は細胞、特に入口から最も遠い細胞から酸素を奪う可能性があるため、これには媒体流量パラメータを慎重に検討する必要があります。一方、流速が高いと、細胞が培養チャネルから押し出されたり、不適切または不均一な層発達が生じたりする可能性があります。拡散の制限は、気液界面(ALI)培養装置でポリジメチルシロキサン(PDMS)などの酸素透過性材料を使用することで対処できます。しかしながら、電気セル−基質インピーダンスセンシング(ECIS)システムのもののような多くの従来のマイクロ流体培養チャネルは、製造されたエンクロージャ10の性質を考えると、本質的に酸素不透過性である。このプロトコルは、酸素不透過性のエンクロージャーで培養された細胞層を分析するための技術を提供することを目的としています。
培養条件の生存率を比較する場合、単層の存在、表面トポロジー、コンフルエンシー、層厚の均一性などの特定の層特性の観察は、特定の一連の培養条件によって生成された細胞層が所望の仕様を満たし、実際に実験計画に関連しているかどうかを判断するために必要です。フローアレイ内の金電極上で培養した細胞の電気絶縁膜によって課される高周波交流(AC)に対する抵抗(インピーダンス)によって生じる電位(電圧)の測定を利用するECISなどの方法で限定的な評価を行うこともできます。細胞に印加されるACの周波数を調節することにより、表面接着強度、タイトジャンクション形成、細胞増殖またはコンフルエンシーなど、細胞および細胞層の特定の周波数依存性を標的とし、調べることができます11。ただし、これらの間接的な形式の測定値は、実験の開始時に解釈するのがやや困難であり、細胞層の関連するすべての側面を定量化するとは限りません。位相差顕微鏡で細胞層を観察するだけで、コンフルエンシーなどの特定の性質の性質が明らかになる場合があります。しかしながら、単層の存在および層厚の均一性などの多くの関連する特性は、明視野、位相コントラスト、または蛍光顕微鏡イメージングでは不可能な3次元(3D)評価を必要とする12。
本研究の目的は、単分子膜のイメージングによる検証と共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を用いた細胞層の均一性の評価を可能にする糸状アクチン染色技術を開発することでした。糸状アクチン(F-アクチン)は、F-アクチンが細胞膜にしっかりと追従し、細胞体積全体の視覚的近似を可能にする方法もあって、蛍光色素複合体の適切な標的であると考えられました13。F-アクチンを標的とするもう一つの重要な利点は、F-アクチンの染色が、細胞が受けるストレスや株によって課せられる細胞骨格の破壊や変化を視覚的に解明する方法です。メタノールなどの脱水固定剤は細胞を平らにし、細胞層を大きく歪め、その特性を変化させる傾向があるため、メタノールを含まないホルムアルデヒドによる架橋固定は、細胞と細胞層の形態を維持するために使用されました14,15。
これらの課題を軽減する層評価技術の能力を判断するために、細胞を従来の8ウェル培養チャンバーおよびマイクロ流体チャネルで培養し、産生された細胞層の違いがある場合はそれを評価しました。固定培養ウェルには、8ウェルチャンバーカバーガラスユニットを使用した。マイクロ流体培養の場合、フローアレイ(チャネル長50 mm、幅5 mm、深さ0.6 mm)を最適化して、ヒト肺の呼吸ゾーンに存在する末端細気管支に生理学的に関連する寸法の環境で不死化ヒト肺上皮(NCI-H441)細胞を培養しました16。このプロトコルは、ECISフローアレイの培養環境を念頭に置いて開発されましたが、培養細胞層の特性や培養条件の評価が必要な酸素不透過性の動的培養環境に適用できます。

<table><tbody><tr><td>A1R HD25 共焦点顕微鏡システム</td><td>Nikon</td><td>A1R HD25</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications</td></tr><tr><td>ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin)</td><td>Invitrogen</td><td>R37110</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110</td></tr><tr><td>Adhesive Transfer Tape Double Linered</td><td>3M</td><td>468MP</td><td>https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/</td></tr> <tr><td>エアタイト&nbsp;HSWソフトジェクト使い捨てシリンジ</td><td>エアタイトRL5</td><td>14-817-53</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml</td></tr><tr><td>BAISDY 4ミル(0.1 mm)厚マイラーシート</td><td>BAISDY</td><td>AS022</td><td></td></tr><tr><td>https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC Branson Ultrasonics&nbsp;Mシリーズ超音波洗浄バス</td><td>ブランソン超音波</td><td>15-336-100</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100</td></tr><tr><td>コーニング&nbsp;フィブロネクチン、ヒト</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>CB-40008</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true</td></tr><tr><td>DPBS、カルシウム、マグネシウム</td><td>ギブコ</td><td>14040133</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133</td></tr><tr><td>ECIS Cultureware 使い捨て電極アレイ 8 x 10 ECIS フローアレイ</td><td>Applied BioPhysics</td><td>1F8x10E PC</td><td>https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E</td></tr><tr><td>Enterprise Technology Solutions UV 滅菌キャビネット、ホワイト</td><td>エンタープライズ テクノロジー ソリューション</td><td>50-211-1163</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079</td></tr><tr><td>Finnpipette F2 可変容量ピペット</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642090</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090</td></tr><tr><td>Fisherbrand 50mL Easy Reader プラスチック遠心チューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-21</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;カバーグラス:長方形(#1.5)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-GP</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド&nbsp;Sterile Syringes for Single Use</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458</td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093</td></tr><tr><td>Image-iT Fixative Solution (4% Formaldehyde, methanol-free)</td><td>Invitrogen</td><td>FB002</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002</td></tr><tr><td>ImageJ Fiji</td><td>ImageJ ImageJ</td><td>Fiji</td><td>https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>イマージョンオイル F 30 cc</td><td>ニコン</td><td>MXA22168</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/accessories/immersion-oil/specifications</td></tr><tr><td>大容量リーチイン CO2&nbsp;インキュベーター、821 L、ポリッシュステンレススチール</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950</td></tr><tr><td>Laxco LMC-3000 シリーズ明視野複合顕微鏡システム</td><td>Laxco</td><td>LMC3BF1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1</td></tr><tr><td>Masterflex フィッティング、ナイロン、ストレート、ホースバーブアダプターへのオスルアーロック、1/16" ID;25/PK</td><td>Masterflex</td><td>ZY-45505-31</td><td>https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&amp; gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 udmwaAuDHEALw_wcB</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>0016</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547</td></tr><tr><td>National Target All-Plastic Disposable Syringes</td><td>Thermo Scientific</td><td>03-377-24</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8</td></tr><tr><td>NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>HTB-174</td><td>https://www.atcc.org/products/htb-174</td></tr><tr><td>NE-1600 6チャンネルプログラマブルシリンジポンプ</td><td>新時代ポンプシステム</td><td>NE-1600</td><td>https://www.syringepump.com/NE-16001800.php</td></tr><tr><td>NIS Elements AR Nikon</td><td></td><td>NIS Elements AR</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research</td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek チャンバーカバーガラス</td><td>Thermo Scientific</td><td>155411</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361</td></tr><tr><td>パラフィルム M ラッピングフィルム</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37441</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441</td></tr><tr><td>PendoTech 3ウェイストップコック ポリスルホン オス/メス ルアー インレット x メス ルアー ブランチ</td><td>PendoTech</td><td>ZY-19406-49</td><td>https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649</td></tr><tr><td>リン酸緩衝液 (PBS)、pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Gibco</td><td>A3890401</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401</td></tr><tr><td>レイノルズ アルミラップホイル</td><td>レイノルズ</td><td>458742928317</td><td></td></tr><tr><td>https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M サポニン</td><td>ミリポア シグマ (Sigma Aldrich)</td><td>47036</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036</td></tr><tr><td>SlowFade ガラス ソフトセット 退色防止剤 封入剤</td><td>Invitrogen</td><td>S36917-5X2ML</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML</td></tr><tr><td>Thermo Scientific 1300 シリーズ クラス II、タイプ A2 生物学的安全キャビネットパッケージ</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-100-752PM</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood Tygon Transfer Tubing、BioPharm Platinum-Cured Silicone、1/16「ID x 1/8」外径;50フィート</td><td>コールパー</td><td>マーEW-95702-01</td><td>https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01</td></tr></tbody></table>

生理的サイズのマイクロ流体培養装置における上皮細胞単層の作製と構造評価

Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device

in vitro マイクロ流体実験は、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)や人工呼吸器誘発性肺損傷(VILI)などの状態で発生する微小生理学的現象に関する多くの洞察を明らかにする大きな可能性を秘めています。しかし、ヒト肺の細気管支末に生理学的に関連する寸法を有するマイクロ流体チャネルの研究は、特に所与の培養環境内で培地流量を含む適切な細胞培養条件を確立することが困難であるため、現在いくつかの課題に直面している。提示されたプロトコルは、ヒト肺の末端細気管支に生理学的に関連する寸法を有する酸素不透過性マイクロ流体チャネルで培養されたNCI-H441ヒト肺上皮細胞の構造を評価するための画像ベースのアプローチを説明している。ファロイジンベースの糸状アクチン染色を使用して、細胞の細胞骨格構造が共焦点レーザー走査顕微鏡によって明らかにされ、個々の細胞および層状の細胞の視覚化が可能になります。その後の定量は、採用されている細胞培養条件が、さらなる実験に適した均一な単層を産生しているかどうかを判断します。このプロトコルは、マイクロ流体チャネルおよび従来の固定ウェル環境における細胞培養および層評価方法について説明しています。これには、チャネル構築、細胞培養と必要な条件、固定、透過処理と染色、共焦点顕微鏡イメージング、画像処理、およびデータ分析が含まれます。

提示された方法は、マイクロ流体培養チャネルで培養された上皮細胞層の可視化を可能にし、検証として従来の固定ウェル細胞培養環境でのデモンストレーションを使用します。取得した画像は、品質、シグナル強度、および細胞ターゲット特異性のスペクトル上に存在します。成功した画像は高コントラストを示し、その後の統計的評価のための画像分析とデータの定量化を可能にします。失敗した画像は、薄暗い、ぼやけた、ぼやけた、または主観的または定量的な評価に使用できなくなります。一部の画像は、主観的な層特性の決定に適しているが、定量分析には品質が不十分な場合があります。したがって、プロトコルが従う程度と注意は、統計分析のデータソースとして機能する特定の画像の適合性に直接影響します。
図4は、マイクロ流体動的培養環境のコンテキストでのこの技術の使用の成功を表しており、2つのマイクロ流体デバイスの入口と出口での画像取得を示しています。図4A、Bは24時間培養された層の例を示し、図4C<...

提示されたプロトコルは、マイクロ流体動的培養チャネルおよび従来の固定ウェル静的培養チャンバーにおける接着細胞層構造を視覚化するための共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を用いたファロイジンベースの糸状アクチン染色技術の開発と使用について説明しています。このアプローチは、細胞層のコンフルエント性、単層形成、および層厚の均一性を評価するのに役立ちます。

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as ...

このプロトコルは、細胞培養実験への参入障壁を低くし、研究者が動的なマイクロ流体環境で培養された接着細胞単層を評価および特性評価することを可能にします。この技術の主な利点は、細胞単層特性の定性的および定量的評価の両方が、さらなる単層依存性実験の基礎として役立つことです。この方法は、in vitroで肺胞上皮の再現を可能にし、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)および人工呼吸器誘発性肺損傷(VILI)中の動的応答の探索を可能にします。まず、単一のチャネルフローアレイを取得します。カバーガラスの表面を超音波浴で清掃します。カバーガラスをポリ-d-リジンに室温で5分間浸します。その後、摂氏60度で30分間乾燥させます。次に、マイラースペーサーに両面接着剤を貼り付けます。原稿に記載されているようにカバーガラスにレーザーカットし、チャネルカットアウトが正確に位置合わせされていることを確認します。長方形のカバーガラスを一番下の粘着ストリップに貼り付けます。剥がした粘着紙を使用して、まだ露出している接着剤の部分を覆います。組み立てが完了したら、構造にしっかりと均等な圧力をかけます。脱イオン水で満たされた注射器を使用して、チャネルをすすぎます。チャネルエンクロージャを紫外線滅菌器で30分間滅菌します。滅菌技術を使用して、PBSで調製したヒトフィブロネクチン溶液でチャネルを処理し、摂氏37度で少なくとも30分間インキュベートします。滅菌層流フードで、10%FBSを含むRPMI 1640培地を使用してNCI H441細胞懸濁液を調製します。この細胞懸濁液の0.25ミリリットルを使用して、チャネルとポートの一部を満たします。明視野顕微鏡を使用して、細胞がチャネル内に均等に分布していることを確認します。メディアリザーバーと活栓をチャネルに追加します。5%二酸化炭素で摂氏37度でチャネルの培養を開始します。プログラム可能なシリンジポンプを使用して、使用済み培地をチャネルから引き出し、新しい培地をチャネル入口に取り付けられた滅菌培地リザーバーからチャネルに引き込みます。化学ヒュームフードで、4%ホルムアルデヒド溶液をDPBSに希釈して1%溶液を作成し、適切にラベル付けされたチューブに保管します。同様の方法で2%ホルムアルデヒド溶液を調製します。ホルムアルデヒド溶液を適切にラベル付けされた5ミリリットルのシリンジに移します。20ミリリットルのDPBSを別の20ミリリットルのシリンジに吸い込み、洗浄ステップに使用します。次に、培養装置からマイクロ流体チャネルを取り外し、化学薬品のドラフトに固定します。固定および染色装置を組み立てるには、オスのルアーロックを介してホースバーブアダプターにトランスファーチューブのセグメントを三方活栓のサイドポートに取り付けます。次に、活栓をフローアレイの入口ポートに接続します。同じタイプのホースバーブアダプターを使用して、既存の活栓の出口ポートに移送チューブの別のセグメントを取り付けます。最後に、現在廃棄物ラインとして指定されている両方の移送チューブの自由端を、化学的およびバイオハザードに適した廃棄物容器に固定します。活栓がフローアレイ入口ポートを塞いでいることを確認し、廃棄物ラインをDPBSで洗い流します。次に、活栓を回して廃棄物ラインを遮断し、2ミリリットルのDPBSでセルをゆっくりと洗浄します。2ミリリットルの1%固定液をゆっくりとチャネルに押し込みます。5分間放置し、2%固定剤で繰り返します。次に、前述のように、新しいDPBSで細胞を3回洗浄します。原稿に記載されているように0.1%サポニン溶液を調製します。洗浄ステップで使用するために、追加のDPBSを20ミリリットルのシリンジに入れます。チューブをアルミホイルで覆います。0.1%サポニン溶液に糸状アクチン染色ファロイジン試薬と核染色ヘキスト試薬を加える。次に、溶液をホイルで覆われたシリンジに移します。少量の透過処理および染色溶液で廃棄物ラインを洗い流します。次に、2ミリリットルの溶液をマイクロ流体チャネルに導入します。チャネルをアルミホイルで覆い、光を遮断します。30分後、透過処理溶液を2ミリリットルのDPBSでそれぞれ5分間2回洗い流してから、チャネルを穏やかに乾燥させます。マイクロピペットを使用して、マイクロ流体チャネルに最小限の量のソフトセット退色防止封入剤を導入し、底面を完全に覆うようにします。次に、端をチャネルにシールします。明視野顕微鏡を使用して、チャネルを容器に保管して光から保護する前に、細胞層の完全性をすばやく確認します。目的の画像パラメータと条件が満たされるまで、参照スキャンとzスタックを実行して、イメージング位置をテストします。フローアレイベースプレートを基準として使用して、チャネルの長さに沿ったさまざまな位置にzスタックを構築します。最後に、断面データ、深度マップデータ、およびその他の関連する特性を分析して、細胞層の特性を評価します。この技術の使用の成功は、入口と出口から少なくとも1センチメートル離れた画像取得を通じて、マイクロ流体動的培養環境で実証されています。代表的な培養期間の実験において、細胞を24時間培養した場合に単層産生の成功が観察された。しかし、48時間培養すると、好ましくない多層形成が見られた。5つのマイクロ流体チャネルイメージング位置のそれぞれから収集されたデータは、培養時間の増加と断面積の増加との関係も明らかにしており、培養後48時間以内に不均一な層の形成または異常増殖が発生したことを示唆しています。24時間培養したマイクロ流体流路内の中心位置のデプスマップが得られ、層特性の定性評価に有用である。このプロトコルの3つの最も重要な側面は、適切なチャネル構築、正確な培養および培地の流れ条件、および固定および染色装置の慎重な使用です。この手順に続いて、他の方法を並行して使用して、電気セル-基板インピーダンスセンシング、ECIS、または経上皮電気抵抗、TEERなどの生成されたセル単層の実験的実行可能性を検証することができます。

preparation-structural-evaluation-epithelial-cell-monolayers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、細胞の捕獲と文化を可能にすることができるマイクロ流体デバイスの作製のためのプロトコルについて説明します。このアプローチではこのようなマイクロ流体チャネル内の溝のようなパターン化された微細構造は、セルがドッキングすることができる内に低せん断応力領域を作成するために使用されています。...

細胞挙動を研究するための溝パターンを用いたマイクロ流体デバイス

このプロトコルは、上皮細胞や細菌の同時およびローカライズされた文化のためのマイクロ流体の共培養モデルを説明します。このモデルは、推定されるプロバイオティクス菌株の有効性を病因の異なる水溶性分子シグナルの役割を調べるだけでなく、画面に使用することができます。...

マイクロ流体可溶性シグナルを介した相互作用を調査するために上皮細胞や細菌の共培養

このプロトコルでは、我々は技術がベースとなっている垂直方向に変位の記事のマイクロアクチュエータアレイの製作、そしてどのようにこの基盤技術は2次元と3次元の両方の文化の中でハイスループット機械的にダイナミックな細胞培養を実施するように変更することができますを示していますパラダイム。...

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この原稿は、細胞外マトリックスに囲まれた定義された幾何学的形状の3次元（3D）上皮組織の均一な配​​列を操作するソフトリソグラフィーベースの技術が記載されています。この方法は、細胞の種類および実験の文脈の多種多様に適していると同一の​​複製のハイスループットスクリーニングを可能にします。...

細胞外マトリックス内に埋め込まれたエンジニアリング三次元上皮組織

3次元(3D)細胞系は、有機生成を調査するための関連モデルです。胆嚢の生成とその特性評価のためのヒドロゲルベースの方法が提案されている。このプロトコルは、嚢胞形成効率、サイズを評価し、その機能をテストするための簡単で信頼性の高い方法で、3D特性評価の障壁を解明します。...

機能性および偏極性胆道上皮嚢胞の生成と定量的特徴付け

ここでは、腸管バリア機能、透過性、および輸送を研究するためのヒトオルガノイド由来腸上皮単層の調製について述べる。オルガノイドは外部刺激に対する元の上皮組織応答を表すので、これらのモデルは細胞株の拡張性の利点と初代組織の関連性と複雑さを兼ね備えています。...

オルガノイド由来の上皮単分子膜:腸管バリア機能のための臨床的に関連するインビトロモデル

本プロトコルは、初代組織(皮膚、肺胞、気道、および腸)の全層臓器チップ培養の確立と成熟を成功させるためのOpen-Top Organ-Chipの機能と本質的な培養モダリティを説明し、ヒトの上皮/間葉系および血管ニッチ界面のさまざまな機能的側面をin...

オープントップ臓器チップ上でのヒト上皮組織の細胞構造と機能の再構成

このレポートでは、血液脳関門モデルを構築するための μSiM...

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

このプロトコルは、オープンウェルフォーマットと流体フロー機能を統合する再構成可能なメンブレンベースの細胞培養プラットフォームについて説明しています。このプラットフォームは標準プロトコルと互換性があり、オープンウェル培養モードとマイクロ流体培養モード間の可逆的な移行を可能にし、工学とバイオサイエンスの両方のラボのニーズに対応します。...

静的バリア組織モデルを動的微生理学的システムに変換する

ここでは、ナノファイバー膜ベースの2層システムで線維芽細胞を培養した上皮細胞が、膜に安定して付着して増殖する様子を示します。...

ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

ここでは、上皮組織恒常性の電気機械的調節を研究するために、独自の2層マイクロ流体デバイスを製造するためのプロトコルを提示します。この装置は、組織面に垂直な静的な生理学的電流を印加し、細胞間の接着、増殖、および押し出しに影響を与えます。生細胞イメージングと機械的ストレス測定により、これらのプロセスのメカニズムが明らかになります。...

2層マイクロ流体デバイスを用いた組織恒常性の電気機械制御の解明

学ぶ マイクロ流体動的培養環境における上皮細胞単層の作製とファロイジン染色による構造評価法。共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、細胞層のコンフルエンシーと均一性を定量的に解析する技術です。

生理的サイズのマイクロ流体培養装置における上皮細胞単層の作製と構造評価

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