Name: 温水洗浄のウイルス消毒効果の決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 学ぶ温水洗浄によるウイルス消毒効果の評価法。布製フェイスカバー、スクラブ、デニムのPhi6バクテリオファージ除染を検証し、感染制御とPPE管理に有用なデータを提供します。

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米国環境保護庁(EPA)は、研究開発局を通じて、EP-C-15-008の下でJacobs Technology Inc.と本書に記載されている研究を指揮しました。IAEAによってレビューされていますが、必ずしもIAEAの見解を反映しているわけではありません。公式の承認を推測するべきではありません。EPAは、商用製品またはサービスの購入または販売を推奨するものではありません。著者らは、EPA RTP微生物学の監督についてEPA請負業者のデニス・アスレット、EPA RTP微生物学ラボでこのプロジェクトに取り組んでくれたブライアン・フォード、レイチェル・バートマンズ、レスリー・メンデス・サンドバル、EPA品質保証レビューを提供してくれたラモーナ・シャーマン、EPA技術レビューを提供してくれたワース・カルフィーとシャノン・セールに感謝したい。

Phi6は、共同研究者研究室から~1 mLの凍結アリコートとして受け取り、使用するまで-80°Cで保存しました。当初はより多くのウイルスストックを増殖させるために使用され、その後、使用されるまで-80°Cで保存されました。Phi6が実証ウイルスとして選択されたのは、モデルエンベロープウイルスとして一般的に使用され、高力価に増殖することができ、試験を実施するために低いバイオセーフティレベルの実験室を必要とするためです22,23,24。
1.ウイルスストック溶液を準備する
<ol><li>細菌宿主 シュードモナス・シリンガエ 中のバクテリオファージPhi6を、以下に述べるような改変されたトリプシン大豆寒天培地調製物および軟寒天オーバーレイ法を用いて増殖させる。<ol><li>表1の成分を秤量し、イオン交換水中で混合することにより、改質トリプシン大豆寒天培地を調製する。</li>
		<li>光学密度(OD600)が0.9〜1.5のP. syringaeのアリコート1 mLを100 mLの修飾トリプシン大豆ブロス(表1)に加え、室温(20-26°C)で~260 rpmで振とうインキュベーター内でインキュベートすることにより、P. syringaeの一晩培養を準備します。 </li>
		<li>修飾トリプシン大豆寒天培地(~6 mL)を試験管に入れ、オートクレーブ可能なキャップで覆って、柔らかい寒天チューブを準備します。使用するまで4°Cで保存してください。軟寒天チューブを121°Cで15分間オートクレーブし、寒天を溶かした。めっきするまで48°Cで保持する。48°Cでの平衡化が重要であり、そうでなければウイルスはアッセイで不活化される可能性があります。</li>
		<li>1 mLの希釈されていない濃縮ウイルスアリコートを軟寒天培地に加え、100 μLの対数相(OD600 0.9〜1.5の間) P.シリンガエ 培養液を加えます。凝固した直径100mmの改質トリプシン大豆寒天プレートの表面に軟寒天を注ぎます。気泡やこぼれを防ぐために、プレートを穏やかに回転させて軟寒天を固体寒天表面に均一に分散させ、室温で一晩インキュベートします。</li>
		<li>滅菌セルスプレッダーで3枚のプレートの内容物を25個を、15 mLのSMバッファーを含む滅菌済みの50 mLコニカルチューブに静かにこすり落とします。ボルテックスチューブを最大設定で1〜2分間、寒天を分解し、7,000 x g で15分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を除去し、0.2μmシリンジフィルターでろ過します。1 mLアリコートをクライオバイアルに入れて、使用するまで-80°Cで保存してください。</li>
	</ol></li>
</ol>2.PPEアイテムのテスト前の視覚的評価を実行します
<ol><li>各PPEアイテムを清潔で滑らかな表面(使い捨ての紙ライナーで覆われた実験台など)に置きます。各PPEアイテムを3回に分けて評価します。</li>
	<li>PPE検査中は適切な照明を確認してください。さまざまな場所で未洗浄のアイテムの長さと幅を測定して記録します(図1)。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64164/64164fig1v2.jpg"> 図 1.PPEテスト前の評価測定場所。 洗濯プロセスからの材料の変化を追跡するために長さが記録されたデニム、スクラブ、および顔を覆う場所。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64164/64164fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
3.クーポンを準備する
<ol><li>PPEをカットして2 cm x 4 cmのテストクーポンを作成し、フェイスカバーごとに2つのクーポン(3つのフェイスカバーがテストされました)、デニムパンツごとに5つのクーポン(3つのデニムパンツがテストされました)、およびスクラブシャツごとに3つのクーポンを準備します(3つのスクラブがテストされました)。</li>
	<li>接種しないが洗濯する素材の種類ごとに、2cm×4cmの手続き用ブランククーポンのセット(フルサイズのPPEアイテム1点分のセット)を用意します。顔の覆いの実験は毎日2枚、デニムの実験は毎日5枚、スクラブ実験は毎日3枚用意します。</li>
	<li>接種されるが洗濯されない2cm×4cmのポジティブコントロールクーポンのセットを用意します。フェイスカバー実験の毎日に2枚のクーポン(フェイスカバーを3枚テスト)、デニム実験の毎日に5枚(デニムパンツ3枚テスト)、スクラブ実験の毎日に3枚(スクラブを3枚テスト)、ステンレスクーポンを3枚用意する。 注: 項目のサイズに基づいて異なる反復数が選択されました。たとえば、フェイスカバーに5枚のクーポンを貼り付けることは物理的に困難であり、2枚のクーポンはデニムパンツの限られた領域を表します。場所は、カバレッジを最大化するために選択され、洗濯中に折りたたまれ、清掃がより困難になる可能性のあるゾーンに配置されました。</li>
</ol>4.接種を行う
<ol><li>1xリン酸緩衝生理食塩水の総量10mLに1gの牛肉抽出物を溶解することにより、10%牛肉抽出物溶液を調製する。フィルターは、0.2μmシリンジフィルターを使用して全体を滅菌します。</li>
	<li>セクション1で調製したウイルスストック溶液を室温で解凍する。使用当日、10%牛エキス溶液900μLに解凍したPhi6ストック100μLを加えます。</li>
	<li>10 μLの溶液滴をPPEアイテムにピペッティングし、ピペットの先端を使用して液滴を広げることにより、テストクーポンとポジティブコントロールクーポンに~107 PFU/サンプルを接種します。PPE材料に応じて、液滴は異なる方法で分離および再凝集します。</li>
	<li>接種されたクーポンをバイオセーフティキャビネットで乾燥させます。特定の材料の観察 によって 乾燥時間を決定しました。ここに提示された結果については、次の時間が使用されました:スクラブ= 30分の乾燥時間;フェイスカバー= 60分の乾燥時間。デニム= 30分の乾燥時間。ステンレス鋼= 120分の乾燥時間。</li>
	<li>安全ピンと無菌技術を使用して、 図2 に従って接種されたクーポンをフルサイズのPPEアイテムに取り付けます。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64164/64164fig2v2.jpg"> 図 2.デニム、スクラブ、フェイスカバーのクーポンの場所をテストします。 文字A〜Dは、すべてのロンダリング実験の一意のクーポン識別子に対応します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64164/64164fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
5.洗濯を行う
<ol><li>次のように洗濯洗剤を準備します。<ol><li>洗濯機で使用する水道水を滅菌し、オートクレーブ処理した水10mLを採取して無菌チェックを行います。このプロトコルでは、60分の液体サイクルで7 Lの水道水をオートクレーブします。</li>
		<li>メーカーの希釈方向に従って洗濯液を調製してください。このプロトコルでは、1.54 mLの洗剤を3.5 Lの滅菌水道水に溶かします。ホットプレートと攪拌子を使用して洗濯液を50°Cに温めます。洗濯液のpHと温度を測定して記録します。無菌チェックのために10 mLの溶液を採取します。</li>
	</ol></li>
	<li>洗濯液を滅菌洗浄機(3.25 L)に注ぎます。テストの間に過酸化水素蒸気を250ppm-4時間サイクル使用してワッシャーを滅菌します。</li>
	<li>PPEアイテムを滅菌済みの洗濯機に入れます。ワッシャーごとにデニムパンツとスクラブシャツを1枚追加します。ワッシャーごとに1つの接種されたフェイスカバーと4つの汚染されていないフィルマスクを追加します。フィルマスクにはクーポンが添付されていませんでした。</li>
	<li>PPEアイテムを18分間洗浄します(通常の攪拌で9分間の洗浄サイクルを2回行います)。 洗濯機を排水し、室温の水道水(毎回5 L)で三度すすぎ、泡を取り除きます。室温で滅菌した水道水を洗濯機(3.25 L)に加え、9分間のすすぎサイクルを実行します。</li>
	<li>PPEアイテムをワッシャーのスピン側に移動し、5分間回転させます。PPEアイテムを乾燥機に移動し、強熱設定(80°C)で93分間乾燥させます。</li>
	<li></ol><ol><li><li><ol><li></li><li><li></li><li></ol></li></ol><ol><li></ol>

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</ol>

開示すべき既知の利益相反はありません。

このプロトコルは、フルサイズのPPE /衣料品からのウイルス消毒の洗濯効果を評価するための体系的な実験室試験を実行するために開発されました。この手順では、ウイルスの準備、試験材料の接種、洗濯プロセスによるアイテムの変更の評価、および洗濯(洗濯機の洗浄と乾燥)プロセスの結果としてのウイルス量の減少の定量化のための重要なステップの概要を説明します。さらに、プロトコルは、実験が汚染によって偏っていないことを確認するために必要な品質管理サンプルと、複数の洗濯サイクル後のPPEアイテムの材料の完全性を追跡するために記録する必要がある測定/観察について概説しています。Phi6を使用した結果は、このプロトコルで使用された温水洗浄プロセスが、すべてのサンプル(フェイスカバー、スクラブ、デニムパンツ)のウイルス量の3ログを超える減少を達成したことを示しています。ウイルス量の減少はまた、PPE /衣料品のさまざまな場所で均一でした。3対数の削減を実証するために、このプロトコルでは、すべての状況で土壌負荷を代表するとは限らない、高いウイルス量と安定化剤(牛肉抽出物)を使用する必要があります。
ミニ洗濯機とコンパクトドライヤーは、スペースに制約のある環境で実施できる反復実験の数を最適化し、実験中に使用する機器の滅菌と水量を実験室スタッフが管理できるようにするために選択されました。ミニワッシャーを使用した結果、すすぎ手順は、完全に自動化されたほとんどのホームロンダリングアプリケーションと比較して手動で行われました。先進国では洗濯機が主流であることを覚えておくことも重要ですが、手洗いは依然として世界中で実践されています15。さらに、洗濯用のお湯を利用できない人もいれば、機械乾燥ではなく手動で風乾する人もいます。洗濯慣行におけるこれらの違いは、この現在のプロトコルでは対処されていませんが、バケツとクローズラインを使用して洗浄と乾燥のステップを置き換えるなどの小さな変更で簡単に調査できます。
科学文献では、ウイルスで汚染されたフェイスカバーやストリートウェアの洗浄/消毒に本格的に焦点が当てられていません。より一般的には、研究は洗浄と乾燥を繰り返した後のフェイスカバーのろ過性能を評価しますが、ウイルス消毒の有効性は評価しません27,28。例えば、Clappらは、布製マスクと修正された手順マスクのフィットろ過効率を評価し、パフォーマンスに大きなばらつきがあり、簡単な変更でフィット感とろ過効率が向上したことを発見しました29。別の研究では、異なる材料の4つの布マスクのろ過効率を調べました30、ここでもソース管理または個人保護に焦点を当てました。これは、同じ実験室での微生物部分と機械的試験の両方の専門性の欠如が原因である可能性があります。ここで紹介するプロトコルは、消毒効果と材料の劣化の評価を提供します。
使い捨て呼吸用保護具(主にN95)のための多くの除染/消毒方法が最近科学文献31,32,33に発表されました。FFR(N95など)の主な焦点は、医療従事者やその他の最前線の職業に提供する重要な呼吸保護によるものです。呼吸器除染の主な技術には、過酸化水素蒸気(VHP)、紫外線殺菌放射線(UVGI)、およびウイルス不活性化のための湿熱(蒸気)が含まれていました。Viscusiらは、FFRとUVGIの5つの除染方法を評価しました。エチレンオキシドとVHPが最も有望な除染方法であることがわかった31。Fischerらは、SARS-CoV-2による汚染を減らす能力とN95呼吸器機能への影響について、UV光、乾熱、70%エタノール、VHPの4つの異なる除染方法を評価しました32。FFRの効果的な除染技術に関する多くの追加の研究があり、2020年に要約および公開されました33。ただし、これらの特殊な方法は、平均的な家庭や中小企業の所有者が安全に使用するようにアクセスまたは設計されていません。
このプロトコルは、SARS-CoV-2に類似し、スパイクタンパク質を持ち、すべてのテストで同様のサイズ(80-100 nm)34であるエンベロープバクテリオファージであるPhi6を使用して開発されました。Phi6は既知の病原体ではないため、一般的な微生物学的バイオセーフティレベル1(BSL-1)の実験室で操作できます。Phi6に対する有効性は、他のエンベロープウイルスの有効性を示す可能性があるが、関心のある各ウイルスについての経験的検証が必要である35。同様の非病原性ウイルス剤を使用することにより、このプロトコルを他の場所で繰り返し、将来のウイルスの流行/パンデミックの研究に使用できることが期待されています。将来の研究には、洗剤に加えて消毒剤(漂白剤など)の使用、および手洗いとライン乾燥のための標準化されたプロトコルが含まれる可能性があります。

コロナウイルス病2019(COVID-19)のパンデミックは、前例のない世界的なサプライチェーンの混乱を引き起こし、必須の個人用保護具(PPE)を含む多くのアイテムの重大な不足につながりました1,2,3。リスクの高い職業の人々は、推奨される危機能力戦略を使用して適応する必要があり、一般の人々は、主にソース管理のためだけでなく、着用者に呼吸保護を提供するために、布素材のフェイスカバーなどの非専門アイテムの使用を採用しました。米国では、特殊な呼吸用保護具(すなわち、N95などのフィルタリング式フェースピース呼吸器(FFR))は、供給不足時にこれらのリスクの高い職業(ヘルスケアなど)の一部のために予約されていました4。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-Cov-2)の感染についてほとんど知られていなかったとき、パンデミック5の初期には、他のさまざまな種類の衣類材料もバリア保護と見なされていました。着用者保護に使用される生地の多様性に伴い、これらのアイテムの使用、再利用、および消毒/除染について疑問が生じました。米国では、フェイスカバーやその他の衣料品の定期的な家庭用機械洗浄により、これらの表面のウイルスが非感染性になることが一般に認められていましたが、この主張を検証するデータはほとんど存在せず、テスト用の公開された実験室プロトコルが不足していました。ここで紹介する研究プロトコルの目的は、ウイルス消毒に関するデータを生成する洗濯研究を実施するための実験室プロセスの例を提供することです。このプロトコルはCOVID-19パンデミック時の研究のために開発されましたが、他のウイルス消毒研究に適応できるフレームワークとなることを目的としています。
病気の伝染における衣服の役割は、定量化するのが難しい概念です。家庭衛生に関する国際科学フォーラムは、感染症の蔓延における衣服の役割のレビューと家庭衛生慣行のリスク評価を実施することにより、この困難な課題を試みました6。この研究には、ウールや綿などのさまざまな種類の布地でのさまざまなウイルス株の生存を調べたいくつかの科学的研究のレビューが含まれていました7,8,9,10,11。各研究は、ワクシニア、ポリオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルスなど、さまざまな種類のウイルスに焦点を当てていました。布地上のさまざまなウイルスの生存時間は、ウイルスと材料の組み合わせに応じて30分から5か月の範囲でした。いくつかの研究はまた、材料から手へのウイルス汚染の移動を示しました。出版物の一部として、効果的な洗濯は感染を減らすための重要な管理技術として議論されましたが、病気の負担を減らすための洗濯の影響の大きさは特定のウイルス汚染物質に依存し、定量化が困難であると認識しました7,8,9,10,11。
洗濯プロセスは、化学的、物理的、および熱処理プロセスを使用して微生物を破壊します。たとえば、石鹸と洗剤は土壌を分離し、化学的に媒介された抗菌作用を与える可能性があります。物理的には、希釈と攪拌はウイルス量の減少に役立つ可能性があります。温度と洗剤の有無にかかわらず、工業用および家庭用の洗浄サイクルを使用して綿見本に対するヒトコロナウイルスHCoV-OC43の持続性を調べた研究では、洗剤なしで非加熱水で洗浄した場合、検出可能なウイルスは見つかりませんでしたが、土壌負荷(人工唾液)の存在下では、家庭用洗浄サイクルでは、サンプルの洗剤が検出されないウイルス負荷が必要です12。熱水自体もまた、いくつかの微生物を破壊する効果的な手段を提供することができる13、14。
現在の洗濯慣行の状態を要約した最近の出版物では、布地の構成、保管条件、汚れの負荷、洗濯の温度と時間、乾燥温度などの多くの要因が、洗濯の世界的な慣行で異なることが特定されました15。洗濯は人口の大部分にとって一般的な洗浄方法ですが、既存の慣行のこの大きな違いにより、アイテムがウイルスによって汚染されている可能性がある場合に、これを安全かつ効果的に行う方法についての詳細なガイダンスを発行することは困難でまばらです。COVID-19のパンデミックの間、米国疾病予防管理センター(CDC)は、住宅所有者のためにアイテムを洗浄する方法に関するガイダンスを発行しました16,17。この洗濯ガイダンスの多くは、細菌消毒に関するいくつかの古い研究18,19に基づいており、エンベロープウイルスが洗剤を含む水中で不活化されていることを発見したいくつかのベンチトップ研究によって裏付けられています20,21。ガイダンスは、1)洗剤の製造元の指示に従って、2)最も暖かい適切な水設定を使用し、3)アイテムを完全に乾燥させることに要約できます。これらの推奨事項の理論的根拠は、洗剤で可能な限り暖かいサイクルで洗浄し、完全に(可能であれば熱で)乾燥させると、SARS-CoV-2ウイルスが殺されるというものでした。
洗濯プロセスにおける膨大な数の可能なバリエーションは、変数を分離し、特定のプロセスのウイルス消毒効果をテストできるようにするために、ここに示されているような統一されたプロトコルを必要とします。このプロトコルと説明ビデオの組み合わせの目的は、他の調査研究で複製するための実験室ベースの温水洗浄プロセスを実証することです。さらに、このウイルス消毒効果試験の結果は、ウイルスベースのパンデミック時のホームロンダリングの有効性に対する消費者の信頼を高めるはずです。

<table><tbody><tr><td>&nbsp;冷凍庫(-80°C;C)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>FDE30086FA</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;ホットプレート</td><td>VWR</td><td>97042-714</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;安全ピン(スチール)</td><td>シンガー</td><td>319921</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;シェーカー</td><td>ラボラインインスツルメンツ株式会社</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;SMバッファ</td><td>Teknova,&nbsp;ホリスター、CA</td><td>S0249</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;シリンジフィルター(0.2 &mu;m)</td><td>コーニング、コーニング、NY</td><td>PESシリンジフィルター、431229</td><td></td></tr><tr><td>1Xリン酸緩衝生理食塩水</td><td>Teknova、Hollister、CA</td><td>P0196、10X PBS溶液</td><td></td></tr><tr><td>寒天ベ</td><td>クトンディキンソン</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブキャップ</td><td>DWKライフサイエンス、ミルビル、ニュージャージー</td><td>州KIM-KAPキャップ、73663-18</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>Steris</td><td>AMSCO 250LS蒸気滅菌器モデル20VS</td><td></td></tr><tr><td>牛肉抽出物</td><td>Sigma-Aldrich, Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P/N B4888-100g</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td></td></tr><tr><td>細胞スプレッダー</td><td>ブッセ 病院 使い捨て</td><td>23600894</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>75004271</td><td>ヘレウス メガフュージ 16R 遠心分離</td></tr><tr><td>機認定タイマー</td><td>https://nist.time.gov/</td> <td>適用</td><td></td>されない</tr><tr><td>コニカルチューブ(50mL)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352098</td><td>Falcon 50-mL 高透明度ポリプロピレンコニカル遠心チューブ</td></tr><tr><td>クライオバイアル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ</td>州 <td>AY509X33</td><td></td></tr><tr><td>デニム</td><td>ラングラー</td> ラ<td>ストラー レギュラーフィット ストレートレッグジーンズ フォーポケット スクープフロントポケット付きジーンズ、PN:87619PW</td><td></td></tr><tr><td>洗剤</td><td>プロクターとギャンブル</td><td>タイドオリジナル香り液体洗濯洗剤製品番号(PN):003700023068</td><td></td></tr><tr><td>デキストロー</td><td>スフィ</td><td>ッシャーBP350</td><td></td></tr><tr><td>デイエングリー中和ブロス</td><td>ベクトンディキンソン</td><td>DF0819172</td><td></td></tr><tr><td>ドライヤー</td><td>マジックシェフ</td><td>MCSDRY15W</td><td></td></tr><tr><td>フェイスカバーフェリー</td><td>ナ</td><td>再利用可能なオーガニックコットンフェイスマスク、PN:990121P4</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター(上寒天)</td><td>Symphony</td><td>414004-596</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Notebook</td><td>Scientific Notebook</td><td>Company 2001</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>培地滅菌および分配システム</td><td>Integra</td><td>Media Clave/Media Jet</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes (100 mm)</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>オリオン/オークトン</td><td>STARA1110/EW-35634-35</td><td></td></tr><tr><td>pH プローブ</td><td>オリオン</td><td>8157BNUMD</td><td></td></tr><tr><td>pH スタンダード</td><td>オークトン</td><td>00654-(00/04/08)</td><td></td></tr><tr><td>Phi 6 and Pseudomonas syringae</td><td>バテル記念研究所、オハイオ州コロンバス</td><td>該当</td><td></td>なし</tr><tr><td>ピペット &ヒント</td><td>レイニン</td><td>(ピペット)17014391、17002921;(ピペットチップ)30389239、17014382</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵庫</td><td>株式会社トゥルーマニュファクチャリング</td><td>GDM-33</td><td></td></tr><tr><td>スクラブGogreen</td><td>クール</td><td>PN:WS19100PT</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57656</td><td></td></tr><tr><td>攪拌棒</td><td>フィッシャーブランド</td><td>16-800-512</td><td></td></tr><tr><td>巻尺</td><td>ラフキン</td><td>PS3425</td><td></td></tr><tr><td>軟寒天用試験管(14 mL)</td><td>コーニング、コーニング、ニューヨーク</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>温度計</td><td>フィッシャーブランド</td><td>14-983-19B</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T9410</td><td></td></tr><tr><td>蒸気過酸化水素滅菌バッグ</td><td>STERIS</td><td>62020TW</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス (メッキ加工中)</td><td>Daigger Scientific, Inc</td><td>3030A</td><td>ボルテックス ジーニー 2</td></tr><tr><td>ボルテックス (サンプル抽出用)</td><td>ブランソン超音波</td><td>58816-115</td><td>マルチチューブボルテックス</td></tr><tr><td>ワ</td><td>ッシャーKuppet</td><td>KP1040600A</td><td></td></tr><tr><td>ワッシャー滅菌</td><td>ステリス</td><td>STERIS VHP ED1000 発電機</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>Gibco</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

温水洗浄のウイルス消毒効果の決定

Determining Viral Disinfection Efficacy of Hot Water Laundering

このプロトコルは、ウイルス消毒に関するデータを生成する洗濯研究を実施するための実験室プロセスの例を提供します。このプロトコルは、コロナウイルス病2019(COVID-19)のパンデミック時の研究用に開発されましたが、他のウイルス消毒研究に適応できるフレームワークとなることを目的としています。これは、試験ウイルスの調製、試験材料の接種、洗濯プロセスによる洗浄されたアイテムの視覚的および完全性の変化の評価、およびウイルス量の減少の定量化の手順を示しています。さらに、プロトコルは、実験が汚染によって偏っていないことを確認するために必要な品質管理サンプルと、複数の洗濯サイクル後の個人用保護具(PPE)アイテムの物質的完全性を追跡するために記録する必要がある測定/観察について概説しています。プロトコルで提示された代表的な結果は、綿のスクラブ、デニム、および綿のフェイスカバー材料に接種されたPhi6バクテリオファージを使用し、温水洗浄および乾燥プロセスがすべてのサンプルのウイルス量の3ログ(99.9%)の減少で達成されたことを示しています(3ログの削減は、米国環境保護庁の製品性能試験ガイドライン810.2200の消毒剤性能指標です)。ウイルス量の減少は、PPEアイテムのさまざまな場所で均一でした。このウイルス消毒有効性試験プロトコルの結果は、科学界が他の種類の試験ウイルスおよび洗浄手順に対するホームロンダリングの有効性を調査するのに役立つはずです。

このプロトコルの完了後、いくつかの異なるタイプの品質管理データと結果が生成されます。プラーク形成ユニット(PFU)プレートカウントと抽出されたサンプル量により、テストクーポンあたりのPFU数の計算が可能になります。 表2 は、段階希釈/めっき結果のデータ記録シートの例です。表 1の希釈係数、サンプル量、およびプレート数を使用して、 表3 は、顔を覆うテストの代表的なウイルス回収結果を示しています。これらのデータには、接種材料、クーポン、および洗浄水(洗剤の有無にかかわらず)のテストクーポンと品質管理サンプルが含まれることに注意してください。手順ブランクおよび無菌品質管理サンプルは、水溶液およびPPE材料がPhi6で汚染されていないことを確認するために重要です。汚染の兆候は、消毒効果の誤った計算を引き起こし、テストを繰り返す必要があります。ポジティブコントロールサンプルは、ウイルスストック溶液が実験中に環境的/自然に分解しなかったことを検証することを目的としており、それによってウイルス量の減少における洗濯プロセスの効果を膨らませます。これらのサンプルは、テストクーポンの結果を受け入れるために、接種コントロールの1ログPFU内にとどまる必要があります。陽性対照サンプルのPFUの大幅な減少は、クーポン接種のすべてのステップを注意深く見直して、分析者が適切なピペッティングおよび拡散技術でプロトコルを実行していることを確認する必要があることも示しています。
このプロトコルは、プロトコルに関連する洗濯および品質管理情報による衣料品の材料特性の変化を評価するための情報も提供します(表4および図3)。これらのデータは、いくつかの理由で役立ちます。PPEアイテムの測定の傾向を記録することで、製造上の欠陥のあるアイテムを特定できます。この同定は、外れ値の微生物データを説明し、製品挙動の変動を文脈化するのに役立つ可能性があります。臭いや損傷を記録することで、実験中に洗濯機または乾燥機が最適ではない動作をしていたかどうか、およびテストを繰り返す必要があるかどうか、または機器を修理する必要があるかどうかを示すこともできます。さらに、テスト計画で同じPPEアイテムの複数の洗濯サイクルが必要な場合、データは、PPEアイテムが洗濯時に使用するために完全性を維持する期間を決定するのに役立つ場合があります。洗剤溶液のpHを記録することで、水源または洗剤製品の変化を警告します。洗濯ステップのタイムログを維持することで、洗濯機と乾燥機のタイマーが実験プロトコルに変動を引き起こさないことが保証されます。
最終的に、これらのデータは、ウイルス病原体の代理に対する温水洗浄手順の消毒効果を報告するために使用されます。洗浄消毒の有効性(式1)は、PPE陽性対照結果から平均ログ10ウイルス回収からPPEテストクーポンから平均ログ10ウイルス回収率を差し引くことによって計算されます(図4)。検出されないテストクーポン結果の場合、検出限界のログ10が消毒有効性の計算に使用されます。他のウイルス消毒技術や基準と比較するために、消毒効果をログ値として報告するのが一般的です。
消毒効果=平均ログ10(陽性対照)-平均ログ10(テストクーポン)(式1)
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64164/64164fig3v2.jpg"> 図 3.場所によるPPE寸法の変化。 Δ = 試験前測定 - 試験後測定。負のΔ値は指定された位置でのアイテムのストレッチに対応し、正の値は収縮に対応します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64164/64164fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64164/64164fig04.jpg"> 図 4.Phi6のフェイスカバー、デニム、スクラブPPE素材の消毒における温水洗浄の有効性。 星印は、完全な消毒が行われたことを示します(テストクーポンで検出されません)。エラーバーは標準偏差を示します(n = 3)。ロケーション文字は、 図 2 に示されている配置に対応しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64164/64164fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表 1.ソリューションレシピ。 トリプシン大豆寒天培地、トリプシン大豆ブロス、および牛肉エキス溶液を調製するために必要な成分と量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64164/Table1_Solutions.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表 2.連続希釈/めっき結果シートの一例。 生の微生物データを報告するためのテンプレート。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64164/Table2_PlatingResultsSheet_RE.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表 3.顔を覆う微生物の結果。 処理済みプラーク形成単位(PFU)データの概要シートの例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64164/Table%203%20Viral%20Recovery%20Results_Re.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表 4.品質管理と材料評価ログをスクラブします。 pHプローブの校正、洗剤溶液のpH、洗浄前後の測定、洗濯サイクルタイムを報告するためのテンプレート。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64164/Table%204_scrubs%20log.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)のパンデミックに対応して、布製のフェイスカバー、綿のスクラブ、デニムパンツの温水洗浄のウイルス消毒効果をテストするための実験室プロトコルが開発されました。Phi6ウイルス(バクテリオファージ)は、消毒効果をテストするための生物として使用されました。

This protocol provides an example of a laboratory process for conducting laundering studies that generate data on viral disinfection. While the protocol ...

このプロトコルは、温水洗浄の消毒効果をテストします。これは、洗濯機と乾燥機がウイルスで汚染された衣類の洗浄に適しているかどうかを評価するのに役立ちます。このロンダリング技術の主な利点は、品質保証プロセスを経た手順を使用して、他のラボで小規模に複製できることです。手順を実演するのは、微生物学者のアーメド・アブデル・ハディ、研究科学者のマリエラ・モンジュとジョナサン・ソーヤー、および私たちの研究室の他の人々です。はじめに、本文に記載されているように脱イオン水中で成分を計量して混合することにより、改質トリプシン大豆寒天を調製します。次に、1ミリリットルの希釈されていない濃縮Phi6アリコートを軟寒天培地に加え、100マイクロリットルの対数相シュードモナス・シリンガエ培養液を加えます。次に、直径100ミリの固化した変性トリプシン大豆寒天プレートの表面に軟寒天を注ぐ。プレートを穏やかに回転させ、柔らかい寒天を固体寒天表面に均等に分配することにより、気泡やこぼれを防ぎます。室温で一晩インキュベートした後、滅菌セルスプレッダーで3枚のプレートの内容物を、15ミリリットルのSMバッファーを含む滅菌50ミリリットルのクロニクルチューブに静かにこすり落とします。チューブを最大設定で 1 〜 2 分間ボルテックスして寒天を破り、7 、 000 回 G で 15 分間遠心分離し、上清を収集し、0.2 ミクロンのシリンジフィルターでろ過します。ろ過した上清を、さらに使用するまで、摂氏80度のクライオバイアルに1ミリリットルのアリコートとして保管します。さまざまな場所で、洗っていない個人用保護具またはPPEアイテムの長さと幅を測定および記録することにより、テスト前の視覚的評価を実行します。接種は、1X PBSの総量10ミリリットルに牛肉エキス1グラムを溶解して10%牛肉エキス溶液を調製します。フィルターは、0.2ミクロンのシリンジフィルターを使用して溶液の全量を滅菌します。次に、バイオ安全キャビネット内で、10マイクロリットルの溶液を複数の液滴としてPPEアイテムにピペッティングし、ピペットの先端を使用して液滴を広げることにより、サンプルあたり約10〜7番目のプラーク形成単位をテストおよびポジティブコントロールクーポンに接種します。ホットプレートと攪拌子を使用して、洗濯液を摂氏50度に温めます。次に、洗濯液のpHと温度を測定および記録し、無菌チェックのために10ミリリットルの溶液を収集します。次に、3.25リットルの洗濯液を滅菌洗浄機に注ぎます。PPEアイテム、接種されたフェイスカバー1枚、およびクーポンなしの汚染されていないフィルムマスク4枚を洗濯機に入れます。PPEアイテムを18分間洗浄した後、洗濯機を排水し、毎回5リットルの室温の水道水で三度すすぎ、泡を取り除きます。3.25リットルの室温滅菌水道水を洗濯機に加え、9分間のすすぎサイクルを実行します。次に、PPEアイテムをワッシャースピン側に移動して5分間回転させます。PPEアイテムを乾燥機で摂氏80度の高熱設定で93分間乾燥させます。次に、PPEアイテムを乾燥機から滅菌ワークスペースに移動します。接種したアイテムからクーポンを無菌的に取り出し、円錐形のチューブに入れます。次に、装置の最大設定で2分間ボルテックスすることにより、10ミリリットルの10%Dey-Engley中和ブロスにクーポンを抽出します。従来のソフトトップ寒天オーバーレイ法を使用して抽出物をプレーティングするには、6ミリリットルのソフト寒天と100マイクロリットルの対数相Pシリンガを含むソフト寒天チューブに試験サンプルアリコートを追加します。次に、固化した変性トリプシン大豆寒天プレートの表面に軟寒天を注ぎ、プレートを旋回させて軟寒天を固体寒天表面に均一に分配する。室温で一晩インキュベートした後、各プレート上のプラットフォームユニットを手動で列挙します。フルサイズのPPEまたは衣類からのウイルス消毒の洗濯効果を評価するための体系的な実験室試験では、プラットホームユニットまたはPFUプレート数と抽出されたサンプル量により、テストクーポンあたりのプラットフォームユニットの数を計算できることが示されました。代表的なウイルス回収の結果を顔面被覆試験について得た。洗濯テストでは、衣料品の伸縮などの材料特性に関する情報と、プロトコルの品質管理データが提供されました。Phi6のフェイスカバー、デニム、スクラブPPE材料の消毒における温水洗浄の有効性は、星が完全な消毒を示すこのグラフで実証されました。クロスコンタミネーションを防ぐために、この手順全体で無菌技術を使用することが重要です。また、クーポンの接種材料の乾燥時間は材料ごとに異なり、テスト前に設定されます。その他の補完的な方法には、材料の劣化を調査するための顕微鏡検査や液体浸透テスト、またはバリア保護が着用者にフィットすることを確認するためのさらなるサイズ評価が含まれます。この技術は、本格的な衣料品およびPPEアイテムの洗濯効果と材料テストを拡大するための基礎を提供しました。また、別の伝染イベントやパンデミックの際に効果的なロンダリング手順を確立するのにも役立ちます。

determining-viral-disinfection-efficacy-of-hot-water-laundering

Research

JoVE Journal

Engineering

工学

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

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温水洗浄のウイルス消毒効果の決定

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