Name: 成体のアフリカターコイズメダカの脳組織からの核の穏やかな分離、老化研究のための自然に短命なモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学ぶアフリカターコイズメダカの脳組織から高品質な核を穏やかに分離する手法。単一核RNAシーケンスやATAC-seqに適したこのプロトコルは、自然に短命な老化研究モデルを用いて脳の加齢メカニズムを単細胞レベルで解明するのに役立ちます。

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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

ここで紹介するプロトコルは、メダカの脳から高品質の核を再現性よく生成するために使用できます。このプロトコルは、メダカの脳に適用される典型的な哺乳類ベースの脳核分離プロトコルが一貫して私たちの手の核の質を低下させるため、メダカの脳用に特別に設計する必要がありました。これは、哺乳類の脳細胞溶解に必要な過酷な条件に応じて溶解して凝集するメダカの脳の相対的なミエリン含有量が哺乳類のメダカと比較して低いためであると思われます。このプロトコルは、脊椎動物の脳老化の費用効果と時間効率の高いモデルで、単一細胞レベルでの脳老化の調査を容易にするため、老化およびメダカの分野の進歩です。 
このプロトコルは、新鮮なサンプルや凍結したサンプルに対して堅牢ですが、新鮮な組織や凍結した組織を使用する場合は、下流のアプリケーションを考慮する必要があります。凍結組織は、サンプルが収集されている間、数ヶ月間収集および保存できるため、多くの場合便利です。このようなサンプルは、snRNA-seqなどのアプリケーションに安全に使用できます。しかし、凍結するサンプルは核構造を破壊する可能性があり、したがってATAC-seq21によってクロマチンランドスケープを正確に測定する能力。したがって、バルクATAC-seqやsnATAC-seqなどのダウンストリームアプリケーションでは、凍結した脳の代わりに新たに解剖した脳を使用することをお勧めします。さらに、脳のホモジナイゼーション後のすべてのステップを並行して実行できるため、このプロトコルは妥当な時間枠で複数のサンプルを実行するのに適しているため、氷上での長時間のインキュベーションによって引き起こされるRNA分解を制限します。
さらに、核抽出を行ってから新鮮な(数時間以内に)バッファーを調製することが不可欠です。界面活性剤とBSAは、プロトコルを開始する 直前に バッファーに添加する必要があることがわかりました。塩(PBS、NaClなど)のみを含むバッファーを濃縮液として作成し、フィルター滅菌(0.22 μm)し、室温で無期限に保存することができます。BSAストック溶液は、核抽出から数日以内に調製、滅菌、および4°Cで保存することができますが(粉末から調製する場合)、プロトコルを実施する直前に、このプロトコルで使用されるバッファーに必ず追加する必要があります。ただし、プロトコル当日にBSAソリューションを準備することをお勧めします。サードパーティの既製のBSAソリューションを使用する場合は、新鮮な未開封のボトルを使用することをお勧めします。新鮮なBSAを使用すると、一般的に核調製中の破片含有量が低くなります。
新鮮なサンプルと凍結サンプルのどちらを投入として使用する場合でも、核分離後の核品質を評価することが重要です。このプロトコルは過剰溶解を避けるために特別に設計されていますが、これが核の品質低下の最も一般的な原因です。過剰溶解は、溶解バッファーに費やされた時間が長すぎる、標準ボアピペットチップでの過度のピペッティングなどの核の過度に乱暴な取り扱い、または核の分離と下流アプリケーションの間に費やされる過度の時間(>1時間)に起因する可能性があります。過剰に溶解した核は、しばしば核周辺を損傷し、DNAを漏らして凝集を引き起こします(図2B)。これにより、マルチプレットの数が増加し、ダウンストリームアプリケーション、特にsnRNA-seqを妨害するバックグラウンド核酸に寄与します。両方の品質は、核分離後の顕微鏡検査によって評価することができます。過剰な核凝集が観察された場合は、過剰溶解の可能性を減らすために、溶解ステップのインキュベーションを短くすることをお勧めします。核一重項を増加させるための代替方法として、蛍光支援セルソーティング(FACS)を使用して、このプロトコルの下流の一重項を濃縮することができます。ただし、凍結組織からすでに壊れやすい核を扱う場合、選別中に発生するせん断応力により、核破裂が増加し、周囲のRNA/DNAが増加する可能性があることに注意してください。さらに、複数のサンプルを処理する場合、核のFACS収率選別を実行するのに必要な時間は、他のサンプルが選別されている間、すべての核サンプルが何時間も氷上に留まる必要があることに注意してください。したがって、FACSアプローチで複数のサンプルを並行して処理する場合の待ち時間の増加も、全体的な核品質の低下につながり、RNA分解のリスクを高める可能性があります。したがって、ダブレット率の低下のためにFACSが必要な場合は、収量選別後にデブリ含有量を再度チェックし、潜在的な警告としてシングルセルRNA-seqアプリケーションでRNA品質の低下の可能性を考慮することをお勧めします。 
核数と一重項比率の正確な推定は、ほぼすべてのダウンストリーム「オミクス」アプリケーションにとって不可欠であり、最も重要です。サイズによって核を簡単にゲートしてカウントできるため、フローサイトメトリーは、私たちが評価した核をカウントする最も正確な方法です。あるいは、InvitrogenのCountess 2 FL自動セルカウンターやDeNovix CellDrop自動セルカウンターなどのセルカウンターを使用して核を定量することもできます。Invitrogen の Countess 2 FL 自動セルカウンター、および程度ははるかに低いものの DeNovix は、デブリを核として数えることで核数を過大評価する傾向があり、手動のサイズゲーティングが必要になる可能性があることに注意してください。さらに、フローサイトメーターを使用すると、核の純度を簡単に評価できます。一重項核と多重項核の相対的な比率は、顕微鏡では困難な定量的な方法で識別できます。snRNA-seqおよびsnATAC-seqは、これらのプロトコルがマルチプレットサンプルの過剰に悩まされ、ダウンストリーム分析から除外する必要があるため、これは不可欠です。マルチプレットに加えて、「デブリ」(断片化された核、細胞デブリ)の相対的な割合はフローサイトメトリーで定量することができ、この材料にはバックグラウンドシグナルに寄与し、単一の核「オミクス」データを破壊する可能性のある汚染核酸が含まれていることが多いため、比較的低くなければなりません。 
前述の核分離プロトコルと同様に、元の組織における細胞型の割合は、核調製19において忠実に再現されない可能性があるため、慎重に解釈されるべきである。すべての硬骨魚と同様に、アフリカターコイズメダカには有核赤血球があり、これも核準備で表されると予想されます。これらの核は、ヘモグロビン遺伝子のより高い発現/アクセス可能性によってsnRNA-seqおよびsnATAC-seqデータセットで同定することができ、必要に応じて計算上除外することができる。

脊椎動物の脳の老化のメカニズムを理解することは、アルツハイマー病や認知症などの加齢に伴う神経変性疾患に対処するために重要です1。アフリカターコイズメダカ(Nothobranchus furzeri)は、飼育下で繁殖できる最短寿命の脊椎動物であり、その短い寿命と加齢に伴う認知障害のために、優れた脳老化モデルです2,3,4,5。最近、単一核RNA-seq(snRNA-seq)やトランスポザーゼアクセス可能なシーケンシング付きクロマチンの単一核アッセイ(snATAC-seq)などの単一細胞「オミクス」技術の出現により、研究者は前例のない解像度で老化した脳を調査できるようになりました6,7,8。これらの方法は、ニューロンなどの脳細胞の回収がしばしば単離するには難しすぎるため、核の分離に依存しています6,7,8,9,10。しかしながら、ほとんどの公開された核単離プロトコルは、哺乳動物モデル生物11、12、13、14、15に対して最適化されている。このように、現在、老化研究2の分野において、メダカの脳核を新進気鋭のモデル生物として単離する必要が生じており、凍結した脳メダカ組織から高品質の核を単離する方法を確立することを目標としています。
ここでは、一般的に入手可能な材料を使用してメダカの脳から高品質の核を分離する、合理化された堅牢なワークフローが確立されています。このプロトコルは、アフリカターコイズメダカのミエリン含有量の低い脳、凍結組織の脆弱性、およびシーケンシング関連のアプリケーションのための周囲の破片含有量を減らす必要性に対応するために、マウス脳用の10x Genomicsプロトコルから変更されました16。実際、哺乳類の脳組織用に以前に最適化されたプロトコル17,18は、凍結メダカの脳に使用すると、核の質の低下(すなわち、過剰溶解)および/または高い破片含有量をもたらし、マイクロフルイディクスを使用した単一核RNA-seqの推奨に従ってsnRNA-seqでの使用には適していません(補足図1)。
核の単離に加えて、顕微鏡とフローサイトメトリーによって核の品質と収量を評価する方法を示します。この記事では、最適な結果と最適でない結果の両方の例を示し、トラブルシューティングについて説明します。このプロトコルは、冷凍メダカの脳用に設計および最適化されていますが、解剖したばかりのメダカのサンプルに大きな変更を加えることなく使用することもできます。この方法を使用して単離されたメダカの脳核は、ダウンストリームアプリケーションとして単一核RNA-seq(snRNA-seq)での使用に最適化されていますが、snATAC-seqおよびバルクATAC-seqでの使用にも適しているはずです。

<table><tbody><tr><td>0.4% トリパン ブルー溶液</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Bioland</td><td>PBS01-03</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニクル遠心分離管</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>2 mL ティッシュグラインダー</td><td>Kimble</td><td>885300-0002</td><td>ダウンス ホモジナイザー</td></tr><tr><td>5 mL ポリスチレン丸底チューブ</td><td>ファルコン</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>5M 塩化ナトリウム、分子生物学の等級</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACSの洗浄液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>これは1x PBS pH 7.2、2 mM EDTA(フローサイトメトリーのために使用)</td></tr><tr><td>デブリの取り外しの解決</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-398</td><td></td></tr><tr><td>DNAのLoBIndの管</td><td>Eppendorf</td><td></td>の22431021<td></td></tr><tr><td>エコー回転顕微鏡(60x対物レンズと合う)</td><td>Echo</td><td>NA</td><td>カタログ番号なし。原子核の目視検査に使用します。</td></tr><tr><td>Falcon 丸底ポリスチレンチューブ、5 mL</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td>FACS チューブ</td></tr><tr><td>FLOWMI Cell Strainers、40 &mu;M</td><td>SP Bel-Art</td><td>136800040</td><td>プロトコルでオンチップフィルターと呼ばれる</td></tr> 塩<tr><td>酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258146-500 mL</td><td>TRIS pH を 8.0 から 7.4 に下げるために使用されます</td></tr><tr><td>ライカ NA</td><td></td><td></td><td>カタログ番号なし</td></tr><tr><td>MACS BSA ストックソリューション</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130091376</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (70 &mu;M)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>MACSクアントアナライザー 10 フローサイトメーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>NA</td><td>カタログ番号なし</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム、六水和物、分子生物学グレード (粉末)</td><td>ミリポア</td><td>442611</td><td></td></tr><tr><td>メガフュージ 16R 遠心分離機</td><td>ThermoScientific</td><td>75003629</td><td></td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Micro Slides Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Substitute</td><td>Roche</td><td>(Roche) 11332473001/ カタログ:983739 Pコード:-102368106(Sigma Aldrich)</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water</td><td>HyClone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>NxGen RNase阻害剤 (50,000 U)</td><td>Lucigen</td><td>30281-2</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム溶液</td><td>MBL</td><td>FP00010020</td><td></td></tr><tr><td>PureBlu DAPI 核染色色素</td><td>Biorad</td><td>1351303</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT ピペットチップ (超低保持、ろ過) 10 &micro;L、20 &micro;L、200 &micro;L、および1000 &micro;Lサイズ</td><td>USA Scientific</td><td>#1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S (MS 222)</td><td>Syndel</td><td>Tricaine10G</td><td>Syndelは、医薬品グレードのTricaine</td></tr><tr><td>TRIS、1 M、pH 8.0</td><td>VWR</td><td>E199-500 mL</td><td></td></tr>ワイド<tr><td>ボアピペットチップ</td><td>Axygen</td><td>T-1005-WB-C</td><td></td></tr>のFDA承認プロバイダーです</tbody></table>

成体のアフリカターコイズメダカの脳組織からの核の穏やかな分離、老化研究のための自然に短命なモデル

Gentle Isolation of Nuclei from the Brain Tissue of Adult African Turquoise Killifish, a Naturally Short-Lived Model for Aging Research

脊椎動物システムにおける単一細胞分解能での脳の老化の研究は、コスト、時間、および技術的な制約のために依然として困難です。ここでは、自然に短命の脊椎動物アフリカターコイズメダカ Nothobranchius furzeriの脳から単核RNAシーケンシング(snRNA-seq)ライブラリを生成するプロトコルを示します。アフリカターコイズメダカの寿命は4〜6か月で、費用対効果の高い方法で飼育できるため、脊椎動物の脳の老化を研究するためのコストと時間の障壁が軽減されます。ただし、下流の単一細胞実験に十分な品質の核を若齢魚と高齢魚の脳から単離するには、調整されたプロトコルが必要です。ここでは、高品質の単一核オミックライブラリの生成における重要なステップである、成体のアフリカターコイズメダカの脳から高品質の核を分離するための経験的に最適化されたプロトコルを示します。さらに、細胞型を明確に区別するためには、汚染されたバックグラウンドRNAを減らすためのステップが重要であることを示しています。要約すると、このプロトコルは、非伝統的な脊椎動物モデル生物における脳の老化を研究することの実現可能性を示しています。

ここで説明するメダカの脳核分離プロトコルは、メダカのために特別に最適化されており、図1に要約されています。核抽出に加えて、プロトコルは単離された核の質と量を評価するためのさまざまな方法を詳述しています。図2は、光学顕微鏡によって評価された健康な核(図2A)と不健康な(図2B)核の両方の例を示しています。下流分析に適した健康な核(図2A)は、無傷の膜を有する一重項核として存在する。図2Bに示すように、このプロトコル(および他の核分離プロトコル)の最も一般的な障害モードは、損傷した核膜を特徴とする過剰核の生成です。これはしばしば核の凝集につながり、破裂した核からの核酸の漏れにより、ダウンストリームアプリケーションのバックグラウンドシグナルに寄与する可能性があります。過剰な凝集が観察された場合は、ダウンスステップ中は穏やかに、および/または溶解バッファーでのインキュベーション時間を短縮することをお勧めします。
このプロトコルでは、フローサイトメトリーを使用して単離核の数を定量化し、サンプル中の多重項核の相対的な割合を決定します。さらに、フローサイトメトリーを使用して、汚染された破片、しばしば破裂した核断片、および核サンプルの下流アッセイに悪影響を与える可能性のあるその他の細胞破片の相対的な含有量を評価することができます。代表的なフローデータを 図3に示します。高品質の核分離手順により、1)小さな破片画分、および2)一重項核と多重項核の割合が高い(核画分の&gt;80%)が生成されます。核酸を染色するPI染色を使用すると、一重項核を破片や多重項核から分離することができます。図 3A は破片で汚染された準備の例であり、 図3B は高品質の実験の例です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig01.jpg"> 図1:メダカの脳核分離ワークフロー。 凍結または新鮮なメダカの脳からの核分離のための実験ワークフロー。単離して評価すると、核はさまざまな下流の「オミクス」分析に使用できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig02.jpg"> 図2:顕微鏡による原子核の品質評価。 核を0.4%トリパンブルーの溶液中で1:1で混合し、エコー回転顕微鏡上で60倍の明視野イメージングによって可視化した。 (A)高品質の核の例。核は一重項として存在し、核膜は無傷です。(B)質の悪い原子核の例。核膜が損傷し、核がダブレットに凝集しているのが、これはおそらく最上部の核の上部から漏れているのが見られる粘着性DNAの漏れが原因です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig03.jpg"> 図3:フローサイトメトリーによる核定量と純度評価。 核サンプルを1:100希釈のPIで染色し、フローサイトメーターで実行しました。核は(A,B)の右上の象限に一重項と多重項の形で存在し、一重項がイベントの最低の雲であり、その後にダブレット、トリプレットなどが昇順で続きます。破片は、左端の2つの象限のイベントによってマークされます。(A)デブリ除去ステップが省略され、デブリがイベントの&gt;40%を占める低品質の原子核調製の例。(B)デブリ除去工程を含む高品質の核試料の一例。この例では、破片はフローサイトメーターによって登録されたすべてのイベントの&lt;10%を占めています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>サンプルタイプ(2脳)</td>
			<td>平均収量(4つの独立した準備)</td>
		</tr><tr><td>5週間の男性の脳</td>
			<td>3.59 ± 1.76×105</td>
		</tr><tr><td>10週間の男性の脳</td>
			<td>6.41 ± 1.33×105</td>
		</tr><tr><td>15週間の男性の脳</td>
			<td>14.59 ± 2.05×105</td>
		</tr><tr><td>5週間の女性の脳</td>
			<td>2.54 ± 0.75×105</td>
		</tr><tr><td>10週間の女性の脳</td>
			<td>4.66 ± 1.29×105</td>
		</tr><tr><td>15週間の女性の脳</td>
			<td>7.95 ± 3.51×105</td>
		</tr></tbody></table>表1:アフリカターコイズメダカの2つの脳からの性別と年齢にわたる平均期待収量。 平均収率は、各カテゴリーにおける4つの独立した核調製物にわたる平均の標準誤差±105 核として表した。
補足図1:凍結メダカの脳に対する標準プロトコルと最適化されたプロトコルを使用した核分離品質の比較。 (A)顕微鏡による核品質評価。核を0.4%トリパンブルーの溶液中で1:1で混合し、60倍の明視野イメージングによって顕微鏡上で視覚化した。 (B)フローサイトメトリーによる核および破片負荷の定量化。核サンプルを1:100希釈のPIで染色し、フローサイトメーターで実行しました。(C)異なるベンチマークプロトコルを使用した顕微鏡およびフローサイトメトリーによる品質評価指標の要約。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_FIgure_S1_v3.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:がれき除去ステップの概略図。 (A)遠心分離前のデブリ除去層化のスキーム。(B)遠心分離後の上清除去のスキーム。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_Figure_S2_JOVE_Revision.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、短寿命脊椎動物モデル Nothobranchius furzeri の脳から核を単離するためのプロトコルを提示し、単核RNAシーケンシングやトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンシーケンシング(ATAC-seq)の単核アッセイなどのダウンストリームアプリケーションを提供します。

Studying brain aging at single-cell resolution in vertebrate systems remains challenging due to cost, time, and technical constraints. Here, we ...

これは、老化研究のための新しい脊椎動物モデルであるアフリカターコイズメダカの凍結脳を使用した単一核シーケンシング実験のために高品質の核を分離するための最初の最適化されたプロトコルです。このプロトコルは核を非常に穏やかに分離し、より有髄化した脳を持つ他の生物に最適化されたより厳しいプロトコルとは区別され、メダカで使用すると核が劣化します。この方法は、単一細胞レベルで脳の老化を理解するのに役立ちます。それは、より穏やかな核分離を必要とする他の組織にうまく翻訳されるはずです。このプロトコルはユーザーフレンドリーです。最も要求の厳しい作業は、破片除去のためのグラジエント遠心分離であり、高速で厄介な作業よりも、ゆっくりと正確である方が良いです。手順を実演するのは、アリ・アドラーとブライアン・ティーフィー、研究室の技術者であり、ベナユン研究所のポスドク学者です。メダカを解剖した後、凍結した脳組織を氷上で10分間解凍し、2ミリリットルのダウンスホモジナイザーで1ミリリットルの氷冷核溶解バッファーで脳を浸します。サンプルを溶解している間は、ホモジナイザーを氷の上に保ち、気泡が発生しないようにしてください。原稿に記載されているように組織をダウンスし、サンプルをダウンスホモジナイザーで氷上に2分間置きます。次に、サンプルを70マイクロメートルのセルフィルターを通して、5%BSAでプレコートされた15ミリリットルのコニカルチューブに入れます。洗浄バッファーを70マイクロメートルのセルフィルター上でピペッティングしてサンプルに4ミリリットルの核洗浄バッファーを加え、チューブを5回穏やかに反転させて混合します。スイングバケットローターを使用して、サンプルを500 Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を廃液容器にそっと注いで廃棄します。サンプルを直立させたまま、P1000ピペットを使用して残りの洗浄バッファーを除去します。直ちに、広口径P1000ピペットチップを備えた1ミリリットルの核洗浄バッファーに核を再懸濁します。次に、4ミリリットルの核洗浄バッファーを加えてサンプルを5ミリリットルにし、前述のように混合します。遠心分離によって細胞をペレット化する。上清を廃棄し、広口径ピペットチップを備えた1ミリリットルの核洗浄バッファーに核を再懸濁します。次に、核をフローサイトメトリーチューブに移します。300マイクロリットルの破片除去溶液を細胞懸濁液に加え、混合物が均一になるまで広い口径の先端でピペッティングして完全に混合します。チューブをわずかな角度で持ち、P1000ピペットを使用して核溶液の上に1ミリリットルの核洗浄バッファーを静かに重ねます。サンプルを3000 Gのスイングバケットローターで摂氏4度で10分間遠心分離します。P1000ピペットを使用して、上部の2つのフェーズを完全に廃棄します。最下層を5%BSAでプレコートされた15ミリリットルの円錐管に移します。次に、核洗浄バッファーで容量を15ミリリットルにし、チューブを3回反転させて混合します。チューブを1000Gで、スイングバケットローターで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を注意深く取り除き、広口径ピペットチップを使用してペレットを150マイクロリットルの核洗浄バッファーに直ちに再懸濁します。300マイクロリットルに設定された標準ボアピペットチップに切り替えます。サンプル全体をピペットし、40マイクロメートルのオンチップフィルターをピペットチップの端に取り付けます。サンプルをフィルターを通して低DNA結合の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに強制的に排出することにより、サンプルをろ過します。FACSチューブで、ろ過した核サンプル10マイクロリットルを推奨フローサイトメトリーバッファー90マイクロリットルに再懸濁します。ヨウ化プロピジウムでサンプルを1ミリリットルあたり1マイクログラムの最終濃度で染色します。原稿に記載されているようにワークスペースを設定したら、右下の再生アイコンを押してフローを開始します。HDRTに対する側方散乱領域を使用して、サンプル内の気泡または塊を確認します。また、側方散布図と前方散布図をチェックして、イベントがウィンドウの境界内に蓄積されていることを確認します。拡大表示するには、PerCP-Vio700-Aに対する側方散布図をダブルクリックします。左上のツールバーの垂直線の付いたボタンをクリックして、象限ゲートを選択します。次に、PerCP-Vio700-Aプロットに対する側方散布領域の任意の場所をクリックすると、プロット内に象限が表示されます。象限の分割線上の任意の場所をクリックし、カーソルをスライドして象限の配置を変更します。左上の象限に破片が含まれ、右上の象限に原子核が含まれるように象限を配置します。四角い灰色のIアイコンをクリックして、プロパティウィンドウを開きます。領域関数タブに移動し、プロット全体が選択されていることを示す緑色のチェックマークが一番上の項目の横にあることを確認します。関数リストの下で、マイクロリットルあたりのカウントをクリックして、緑色のチェックマークを生成します。[OK] をクリックすると、各象限にマイクロリットルあたりのメトリック数が表示されます。必要に応じて、領域関数タブからカウントと合計パーセントを選択して、生の数とパーセンテージを表示します。この人口の周囲にポリゴン ゲートを描画するには、左上のツールバーのポリゴン ボタンをクリックします。次に、1 回クリックしてマウスをスライドさせ、ゲートの直線セグメントを描画します。もう一度クリックして終了し、次のゲートを開始し、続いてダブルクリックしてゲートを終了します。ゲートの境界をクリックし、マウスをスライドさせてゲートの位置を変更します。ゲートの頂点をクリックして形状を変更すると、ゲート母集団のマイクロリットルあたりのカウントが表示されます。無傷の膜を持つ一重項核として現れた健康な核は、下流の分析に適しています。しかし、不健康な核は核膜の損傷を特徴としており、核の凝集につながり、下流のアプリケーションでバックグラウンドシグナルに寄与する可能性があります。核は右上の象限で一重項と多重項の形をしており、一重項がイベントの最低の雲であり、昇順でダブレットとトリプレットがそれに続きます。デブリは、デブリ除去ステップが省略された低品質の原子核準備の左端の2つの象限のイベントによってマークされます。破片はイベントの40%以上を占めています。ただし、高品質の実験では、破片はすべてのイベントの15%未満を占めています。このプロトコルを使用して単離された汚染バックグラウンドRNA核を減らすために、デブリ除去遠心分離ステップの後に中間層を完全に除去することが不可欠です。 単一核RNAシーケンシングまたはATACシーケンシングに使用して、シングルセルレベルのトランスクリプトームおよびエピジェネティック情報を取得できます。この技術により、研究者は、老化研究のための自然に短命の脊椎動物モデル生物であるアフリカターコイズメダカの単一細胞レベルで脳遺伝子制御を探索することができます。

gentle-isolation-nuclei-from-brain-tissue-adult-african-turquoise

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、成体のゼブラフィッシュから蛍光標識T細胞急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)腫瘍細胞を単離し、トリパンブルー色素を使用してそれらを定量化する技術について説明しています。...

蛍光標識T-ALL細胞の単離:成体ゼブラフィッシュからT-ALL細胞を単離する方法

このビデオでは、ゼブラフィッシュの幼生の脳からニューロン、マクロファージ、ミクログリアを分離し、脳組織を機械的に破壊する手順を説明しています。精製された細胞集団は、さらにゲノム解析に使用することができます。...

ゼブラフィッシュ幼生からの脳細胞単離:ゼブラフィッシュ脳組織から無傷のニューロン、マクロファージ、およびミクログリアを得る技術

ゼブラフィッシュの成体の神経新生と再生の細胞的および分子的メカニズムを明らかにするために、ゼブラフィッシュの成体終脳に機械的損傷を引き起こす侵襲的手術と、その後の免疫組織化学またはin...

ゼブラフィッシュ成体終脳の刺し傷傷害：脊椎動物の脳神経発生·再生を調査する方法

ここでは、全脳から、または終脳、tectalまたは成人のゼブラフィッシュの脳の小脳領域のいずれかに由来する神経球アッセイを使用して、大人の神経新生を調べるために、再現性のある方法を提供します。さらに、我々はゼブラフィッシュの神経球における遺伝子発現を操作するための手順を説明します。...

大人のゼブラフィッシュ脳由来神経球の単離および培養

このプロトコルは、合成と性質、組織学的解析および検出に続いてアルツハイマー病モデルを確立する大人のゼブラフィッシュでアミロイド毒性を生成する単量体のアミロイド β42...

Β42 アミロイド毒性と大人のゼブラフィッシュ脳の神経変性をモデリング

本研究の主な目的は、針を合わせて全体のゼブラフィッシュ精巣を凍結保存するガラス (NIV) の手順を浸漬でした。さらに、5...

全体の睾丸針によるゼブラフィッシュを精原細胞の凍結保存に超急速冷却浸漬

青緑色のメダカは、家し、標準ゼブラフィッシュ設備と同じインフラストラクチャを採用、一元的な水のろ過システムで個々 の魚の数千を効率的に上げるにスケール アップすることができますの研究室住宅。ここで我々...

研究室住宅のターコイズ メダカ (による furzeri) のためのプロトコル

ニューロン、マクロファージやミクログリア ゼブラフィッシュ稚魚の脳生理学的および病理学的条件の下でからを分離するためのプロトコルを提案します。分離時にこれらの細胞の遺伝子発現プロファイルを分析するから RNA を抽出します。このプロトコルは、qPCR とトランスクリプトミクスのような下流の分析を実行するため高品質の RNA...

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

ここで、トランスジェニック・カエオルハブ炎エレガンス線から緑色蛍光タンパク質を発現する生きている神経細胞の特定の群を単純に単離するためのプロトコルを提示する。この方法は、特定のニューロンに焦点を当てた様々なex...

回虫カエモルハブ炎エレガンスからの特定ニューロン集団の分離

単核単離は、細胞膜の解離および洗剤ベースの透過性、最適化を必要とし、技術的なアーティファクトを導入する傾向があるステップに依存しています。我々は、単核RNA-seq(snRNA-Seq)またはATAC-seqに適した核を得て、組織全体から直接無傷核を迅速に単離するための洗浄剤および酵素フリープロトコルを実証する。...

洗浄剤と酵素を含まない方法を用いた組織全体からの核分離

ここでは、幼虫および若年期までの生体内でゼブラフィッシュ胚性脳を画像化する方法を提示する。この微侵襲的な手順は、電気生理学的アプローチから適応され、成熟したニューロンの細胞および細胞内の詳細へのアクセスを提供し、脳機能および薬物介入を特徴付けるための光遺伝学および神経薬理学的研究と組み合わせることができる。...

目覚めしたゼブラフィッシュ幼虫と頭蓋骨と皮膚除去による若年組織の完全に活性な脳組織のインビボイメージング

学ぶアフリカターコイズメダカの脳組織から高品質な核を穏やかに分離する手法。単一核RNAシーケンスやATAC-seqに適したこのプロトコルは、自然に短命な老化研究モデルを用いて脳の加齢メカニズムを単細胞レベルで解明するのに役立ちます。

成体のアフリカターコイズメダカの脳組織からの核の穏やかな分離、老化研究のための自然に短命なモデル

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