腫瘍微小環境のマイクロスケールプロテオミクス分析のための工業化された人工知能誘導レーザーマイクロダイセクション

このプロトコルは、組織セグメンテーションのためのAI駆動の画像解析を統合します。レーザーマイクロダイセクションによる組織学選択的収穫により、パトミクスの現実に私たちを近づけます。AIを使用して組織ROIを事前に定義し、周囲温度での組織スライドの滞留時間を制限し、これらの収穫を実行するための人的労力を削減し、オペレータの変動性を低減します。

この技術は、組織標本からの特定の細胞集団の収集または濃縮を含むあらゆる疾患または病理学ベースの研究に広く適用可能である。この方法は、基本的な組織病理学の知識とLMDの経験を持つユーザーにとって簡単です。重要なのは、細胞用のきれいなキャリブレータを切断し、分類器をうまく訓練することです。

まず、基準校正基準を切断する前に、スライドが完全に乾いていることを確認してください。レーザーマイクロダイセクションソフトウェアを開き、形状のインポートオプションでデフォルトのキャリブレーションドットsldファイルを開きます。ティッシュを下向きにし、ラベル側をオペレータに近づけるようにスライドをロードします。

レーザー微小解剖ステージのスライドホルダーに、切断前にオートフォーカスオプションを選択します。レーザー顕微鏡とデフォルトのキャリブレーションドットsldファイルを使用して、キャリブレーション基準をPEN膜にカットします。レーザーマイクロダイセクション濃縮コレクションの場合のみ、画像解析ソフトウェアを開きます。

開いている画像を選択し、ポップアップウィンドウから、スライドのスキャンから生成されたドットsvs画像ファイルを選択します。「アノテーション」(Annotations) タブに移動し、長方形アノテーションツールを選択して使用し、ティッシュの周囲にボックスを描画します。ボックスの注釈を選択し、画像を右クリックします。

詳細ドロップダウンメニューを選択し、パーティション分割オプションをクリックします。タイルのサイズとスペースをそれぞれ 500 ~ 40 に設定し、[OK] を選択してタイルを生成します。タイルの生成に使用する境界ボックスの注釈を選択して削除します。

レイヤーアクションドロップダウンメニューを選択し、「書き出し」をクリックしてタイルアノテーションをドットアノテーションファイルとして保存します。AI 分類アノテーションレイヤーをマージするために開発された Python dapa アルゴリズムの保存済みコピーを、タイルアノテーションファイルと同じフォルダーに配置します。タイルアノテーションファイルの名前をコピーします。

アイドル状態の統合開発環境を使用して Python プログラムを開き、プログラムの下部にある引用符の間にタイル状の注釈ファイルの名前を貼り付けます。「実行」ドロップダウンメニューを選択し、「モジュールの実行」をクリックします。すべてのタイルアノテーションが単一のレイヤーの下にマージされるいくつかのファイルが生成されるのを待ちます。

画像解析ソフトウェアを開き、[注釈] タブに移動します。レイヤーアクションドロップダウンメニューを選択し、「すべてのレイヤーを削除」をクリックして、画像からすべての注釈を削除します。レイヤーアクションドロップダウンメニューを選択し、「ローカルアノテーションファイルのインポート」をクリックします。

ポップアップウィンドウで、スクリプトによって生成されたマージされたドットアノテーションファイルを選択します。読み込まれたすべてのタイルが同じアノテーション レイヤーの下にあることを確認します。分類器タブから、製造元の指示に従って、腫瘍、間質、および空白のスライドガラスの背景ROIの代表的な領域を強調表示します。

分類子を実行する前に、高度な分類子オプションをクリックし、ROI ボックスまたは注釈タブのボックスをオンにして目的の注釈レイヤーを選択します。分類子アクションメニューのアノテーションレイヤーオプションを使用して、分類子を実行します。分類子解析が完了したら、[アノテーション] タブに移動し、解析から生成されたアノテーション レイヤーを選択します。

レイヤーアクションドロップダウンメニューを選択し、「現在のレイヤーを除くすべてのレイヤーを削除」をクリックして、画像から他のすべてのアノテーションレイヤーを削除します。次に、レイヤーアクションドロップダウンメニューを選択し、「エクスポート」をクリックしてアノテーションをドットアノテーションファイルとして保存します。セッションまたはプロジェクト用のフォルダを作成し、ドットアノテーションファイルをサブフォルダ内に保存します。

スライドの一意の識別子でラベル付けされます。「アノテーション」タブに移動し、「レイヤーアクション」ドロップダウンを選択してから、「すべてのレイヤーを削除」をクリックして、画像からすべてのアノテーションを削除します。ペンツールを選択し、各キャリブレーション基準から短い線を引きます。

マークから次の順序で線を引きます。左上、右上、右下。レイヤーアクションドロップダウンメニューを選択し、「エクスポート」をクリックしてタイルアノテーションを do アノテーションファイルとして保存します。

ファイル名にアンダースコア calib を追加し、タイル図形の座標を含むサブフォルダーにファイルを配置します。主プロジェクトのアドレスをコピーします。アイドル状態の統合開発環境を使用して XML インポート生成スクリプト malliator を開き、スクリプトの下部にある引用符の間にプロジェクト フォルダーのアドレスを貼り付けます。

実行ドロップダウンメニューを選択し、「モジュールの実行」をクリックしてスクリプトを実行します。組織を下向きにし、ラベル側をオペレータに近づけてマークされたメンブレンスライドをレーザー顕微鏡ステージのスライドホルダーにロードします。[ファイルのドロップダウン メニューから図形のインポート] を選択します。

スライド用に生成されたドット XML、LMD インポート ファイルを選択します。ファイルから参照点が読み込まれないようにするにはポップアップウィンドウで「いいえ」を選択し、2 番目のポップアップウィンドウで「いいえ」を選択すると、以前に保存した参照点がキャリブレーションに使用されなくなります。レーザーマイクロ解剖アプリケーションのプロンプトに従って、キャリブレーションクロスをスライド上の3つのキャリブレーション基準のそれぞれに合わせます。

スライド画像の左上、右上、右下に表示されるキャリブレーション基準を探します。顕微鏡ステージ上の倒立レーザー微小解剖スライドの基準点に対応することになる画像解析ソフトウェアにおいて。5倍の主観レンズを使用して位置を特定し、63倍の主観レンズを使用して各キャリブレーション基準を整列させるのを切り替えます。

参照ポイントをファイルに保存しないようにポップアップウィンドウで[いいえ]を選択し、2番目のポップアップウィンドウで[OK]を選択してスライドが挿入されていることを確認します。5倍の主観レンズを所定の位置に移動し、ポップアップウィンドウで「はい」を選択して実際の倍率を使用します。読み込んだ図形が表示されたら、カメラをティッシュに合わせます。

図形リスト ウィンドウですべての図形を強調表示して選択します。視野内の 1 つまたは 2 つの注釈を参照として使用して所定の位置にドラッグし、レーザーで切断するために垂直 Z 軸を揃えます。PCTマイクロチューブ用に設計されたユニバーサルチューブホルダーにチューブをロードします。

読み込まれた図形を確認し、コレクションの適切なチューブ位置に割り当てます。カット開始を押してレーザーを開始します。LMD ティッシュでサンプルチューブを降ろして閉じ、ドライアイスを塗ります。

熱サイクルおよび遠心分離後、LMDは組織サンプルを採取し、PCTマイクロチューブからマイクロキャップを取り出して廃棄する。トリプシンを加え、30ミリメートル四方の組織あたり1マイクログラムの比率を加える。そして、マイクロキャップツールを使用してマイクロチューブにマイクロ乳棒を挿入します。

マイクロチューブをバレルサイクルカートリッジに移し、カートリッジ全体を組み立てます。カートリッジをバレルサイクル圧力チャンバーに入れ、蓋を固定します。バレルサイクルは45,000 PSIで50秒間、大気圧は50°Cで10秒間、60サイクルです。

LC-MS MS 分析の場合は、適切な位置にあるオートサンプラーバイアルを液体クロマトグラフィーオートサンプラーにロードします。オートサンプラーを閉じ、適切な勾配および質量分析法で個々のフラクションを分析します。最も可変的な100のタンパク質を使用した教師なし階層クラスタリング。

レーザーマイクロダイセクション富化および全腫瘍サンプルからの高悪性度漿液性卵巣癌および卵巣明細胞癌ヒストタイプの分離をもたらした。対照的に、レーザーマイクロダイセクションは、高悪性度漿液性卵巣癌および卵巣明細胞癌の両方からの間質サンプルを富化した。レーザーマイクロダイセクションから独立してクラスター化された腫瘍および腫瘍全体のサンプルを濃縮した。

5,971の定量タンパク質のうち、215は、高悪性度漿液性卵巣癌および卵巣明細胞癌標本からの腫瘍コレクション全体の間で有意に変化した。Hughesによって定量された76のシグネチャタンパク質のうち、57は、このデータセットで共定量され、高度に相関していた 分類器のトレーニングは、最も困難な部分です。インディカラボのソフトウェアの指示に従い、分類器を洗練させることは、最も正確な結果を再現しました。

他のすべては標準化されています。このAI駆動LMDワークフローを使用して採取された組織は、ここで説明する質量分析ベースのプロテオミクス、またはゲノミ、トランスクリプト、またはその他のオミック分析を含む、さまざまな下流分析アプリケーションと互換性があります。