Name: 鳥類の内耳の発達を研究するためのOvoおよびEx Ovoの方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学ぶ鳥類の内耳発達と毛細胞再生の分子メカニズムを、ヒヨコ胚を用いたovoおよびex ovo電気穿孔法と組織培養技術で解明する方法。聴覚障害治療への応用可能性を探る。

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NCBS、TIFR、Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant、DST-SERB、および王立国立ろう研究所からの支援に感謝します。バンガロールのヘサラガッタにある中央家禽開発機構および訓練研究所に感謝します。NCBSのCIFFおよびEM施設およびラボのサポートに感謝しています。Tol2-eGFPおよびT2TPコンストラクトを提供してくれた高橋佳子と川上浩一、HCAとG19 Pcdh15抗体についてGuy Richardsonに感謝します。プロトコルに関する絶え間ないサポートと貴重なフィードバックを提供してくれたEarlabメンバーに感謝します。

受精鶏卵と孵化していない胚の調達、培養、使用を含むプロトコルは、カルナータカ州バンガロールの国立生物科学センターの制度的動物倫理委員会によって承認されました。
1. ニワトリ聴覚前駆体の ovo エレクトロポレーション
<ol><li>CRISPR/Cas9遺伝子ノックアウトのためのsgRNA設計とクローニング<ol><li>遺伝子ノックアウトを作成するために、遺伝子のエクソン領域を破壊するようにガイドRNAを設計し、好ましくはコード領域の5'末端に近い。</li>
		<li>ウェブツールCRISPOR23を使用して潜在的なガイドRNAを選択します。ブラウザデータを ガルスガルス に設定し、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列を5'-NGG -3'に設定します。プログラムは、入力配列からガイドRNAを決定し、オンターゲットおよびオフターゲット活性に基づいて異なるスコアを割り当てます。さらなる研究のために上位4つのガイドを選択してください。</li>
		<li>ガイド(g)RNA生産用のテンプレート特異的オリゴを設計するには、gRNA設計ツールの出力からPAM配列(5'-NGG -3')を削除します。これはターゲティングには必要ありませんが、Cas9切断認識シーケンスが含まれています。各潜在的なgRNAについて、両端にBsmBI制限部位を有する2つのHPLC精製相補的オリゴを合成します。</li>
		<li>選択したベクターのtracrRNAスキャフォールドを用いてガイド配列をフレーム内にクローニングする(ここでは、ベクター pcU6_1sgRNA24を用いた)。</li>
		<li>sgRNAオリゴヌクレオチドを100 μMの濃度でDNase/RNaseフリーの水に溶解します。サーモサイクラーを使用して、2つのセンスオリゴガイドとアンチセンスオリゴガイドのアニーリングを次のパラメータで実行します:95°Cで3分間、次に37°Cで15分間、次に4°Cに下げます。</li>
		<li>25に記載の標準的な分子生物学的手法を用いて、アニールされたオリゴの制限消化をセットアップし、BsmBI酵素でクローニングベクター pcU6_1sgRNA一晩セットアップした。ゲル精製した直鎖状BsmBI消化pcU6_1sgRNAベクターおよび消化sgRNAオリゴによるライゲーションのセットアップ。DH5-αコンピテントセルに形質転換し、得られたクローンを配列確認する。</li>
	</ol></li>
	<li>卵の取り扱いとウィンドウ<ol><li>産みたての卵を調達し、汚染を防ぐために70%エタノールで拭いてきれいにします。37〜38°C、湿度45%で3.5〜4日間インキュベートします。</li>
		<li>孵卵後、開く前に少なくとも5分間卵を横に置きます。これにより、胚は卵黄の上部に再配置できます。鉗子を使用して、21Gの針が通過できるように、卵の上部と鈍い端に小さな穴を開けます。</li>
		<li>ウィンドウイング中の損傷を防ぐために、アルブミンを除去して胚を殻から遠ざけます。これを行うには、5 mLシリンジと21G針を使用して、卵の鈍い端にある穴から2 mLのアルブミンを注意深く引き出します。透明なテープを使用して、鈍端の穴を覆います。</li>
		<li>卵窓を作るには、卵殻の上部に透明なテープを貼り付けます。スプリングボウハサミを使用して、長さ約2 cm、幅1.5 cmの窓を切り開き、胚を露出させます。鉗子を使用して胚の上にある絨毛膜を開き、胚へのアクセスを可能にします。</li>
	</ol></li>
	<li>マイクロインジェクションプラスミド<ol><li>遺伝子ノックアウト実験のために、SpCas9タンパク質とガイドプラスミド-pcU6_1sgRNAを含むノックダウンミックスと、T2K-eGFP(これはTol2のトランスポゾン部位に囲まれたGFPカセットを駆動するニワトリβ-アクチンプロモーター)とT2TP(Tol2構築物26,27でクローニングされたTol2トランスポザーゼ)のトレーサープラスミドミックスの2つの溶液を調製します。トレーサーは、エレクトロポレーション効率を追跡するために使用されます。</li>
		<li>複数のプラスミドをエレクトロポレーションする場合は、DNAの最終濃度が少なくとも4 μg/μLであることを確認してください。 ガイドプラスミド pcU6_1sgRNA、T2K-eGFP、T2TP の 3 つのコンストラクトを、1 μg の SpCas9 タンパク質、30% スクロース、および 0.1% Fast Green 色素と 1:1:1 の比率で最終容量 10 μL で混合します。</li>
		<li>垂直ピペットプーラーを使用して、標準的なガラスキャピラリー(長さ3インチ、外径1.0 mm)からマイクロインジェクション用の針を引きます。引っ張った後、細かい鉗子を使用して毛細管先端を切り離し、先細りの端で約50μmの先端直径を得ます。</li>
		<li>胚を左側のE3.5に置き、頭を右に向けています。このようにして、マイクロインジェクションのために右耳小胞のみがアクセス可能である。ノックダウンミックスを耳小胞にマイクロインジェクションします。約200 nLのDNA溶液混合物を注入して、耳小胞を満たします。</li>
		<li>T7エンドヌクレアーゼアッセイ28を用いてガイド効率を決定する。</li>
	</ol></li>
	<li>エレクトロポレーション<ol><li>エレクトロポレーションの前に胚の上に0.719%生理食塩水を数滴加えて、電気抵抗を下げ、胚の過熱を防ぎます。</li>
		<li>アルブミンを除去したときに卵の鈍い側に作られた穴に正極を通します。電極が卵黄の下になるように操作します。満たされた耳嚢胞の上に負極を置きます。</li>
		<li>エレクトロポレーションを使用して、プラスミドを胚の細胞にトランスフェクトします。方形パルス発生器を使用して、それぞれ25Vと100msの持続時間の5つのパルスを50ms間隔で印加します。個々のエレクトロポレーション設定に基づいて経験的に条件を決定します。</li>
		<li>エレクトロポレーション後に0.719%生理食塩水を数滴加えて胚を水和させる。電極の表面から変性アルブミンをきれいにするには、蒸留水で十分にすすいでください。卵を透明なテープで再密封し、さらにインキュベーションするために37〜38°Cで加湿インキュベーターに戻します。 注:胚はエレクトロポレーション後に孵化するまで培養できますが、生存率は急激に低下します。</li>
	</ol></li>
</ol>2.脳底乳頭解剖
<ol><li>70%エタノールを使用して、手術台、顕微鏡ステージ、およびその周辺を消毒します。熱またはアルコールは、最小限のスプリングボウハサミ、マイクロキュレット、および2組の細かい鉗子を含むマイクロダイセクション装置を滅菌します。</li>
	<li>次の解剖プレートを準備します:黒いシリコンベースのガラスペトリ皿、90 mmのプラスチック製のペトリ皿、および60 mmのペトリ皿。解剖のためにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはハンクス平衡塩溶液(HBSS)のいずれかを冷やします。</li>
	<li>卵を90mmのペトリ皿にそっと割る。ひよこの外耳を特定します。ハサミを使用して下顎の高さのすぐ下で首を切って胚を斬首します。氷冷PBSで満たされた60mmのペトリ皿に頭を移します。</li>
	<li>くちばしの上部を実験者の方に向け、#5鉗子の1つを使用してくちばしを保持します。2番目の#5鉗子を使用して目をすくい取ります。吻側から尾側に移動し、正中線に沿って頭蓋骨を切ります。脳をすくい取ります。</li>
	<li>氷のように冷たいPBSまたはHBSSを追加し、耳介のレベルに近い2つの光沢のある構造を見つけます。これらは蝸牛管の端にあるラゲナの耳石であり、正中線の近くに見られます。</li>
	<li>2つのラゲナの間を大まかに切り、この領域の上下をかなり上回って、2つの内耳を分離します。斜めの照明の下で、内耳の輪郭を視覚化します。無関係な組織と前庭を取り除きます。</li>
	<li>単離した蝸牛を、氷冷PBSを備えた黒色のシリコンベースプレートに移します。#5鉗子を使用して、軟骨性蝸牛嚢を剥がして蝸牛管を取得します。蝸牛管の起伏のある層(被蓋)を見つけ、#55鉗子を使用してBPを露出させます。 #55鉗子を使用して、構造膜を除去してHCとSCを露出させます。</li>
</ol>3.脳底乳頭外植片の培養
<ol><li>BPの膜培養<ol><li>6ウェルの組織培養プレートを取り、1ウェルにつき1つの培養膜インサートを配置します。</li>
		<li>解剖した脳底乳頭(外植片)を1x HBSSバッファーを含む200 μLピペットに集め、メンブレンに移します。組織がピペットの壁に付着するのを防ぐために、組織を吸引する前にいくつかの媒体を作成します。</li>
		<li>脳底乳頭が上を向くように外植体を向け、毛髪と支持細胞が上部29から見えるようにします。外植片を配置したら、培養膜表面からHBSSバッファーをゆっくりと吸引します。このプロセスでは、外植片は培養膜に付着します。</li>
		<li>メンブレンインサートとウェル壁の間に1.2 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)培養液を加え、6ウェルプレートのウェルを満たします。1つの30 mm培養膜で最大6つの外植片を培養できます。</li>
	</ol></li>
	<li>蝸牛管のコラーゲン培養<ol><li>組織培養フードに400 μLの3 mg/mLラットテールコラーゲン、50 μLの10x DMEM、30 μLの7.5%NaHCO3、および5 μLのHEPESを加えて、コラーゲン混合物を調製します。</li>
		<li>4ウェルプレートを取り、各ウェルにコラーゲン混合物を3滴加えます。解剖した蝸牛管を各コラーゲン滴に移します。プレートを37°Cで10分間インキュベートし、5%CO2 でコラーゲンマトリックスを硬化させた。</li>
	</ol></li>
	<li>培養物の低分子処理<ol><li>薬理学的調節剤またはその溶媒のみ(対照として使用するため)のいずれかで培養培地(DMEM、N-2サプリメント、ペニシリン)を調製します。培養液を、阻害剤を添加した700 μLの培地と交換します。外植体をインキュベーター内で37°C、5%CO2で培養する。</li>
		<li>培地の50%を毎日交換してください。適切なインキュベーション時間の後、培地を取り出し、下流アッセイに外植片を使用します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. イメージングと解析
<ol><li>免疫蛍光分析<ol><li>ウェルから培地を取り出し、1x HBSSで外植片を2回洗浄します。ピペットを使用して、1 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)をウェルに加え、室温で20分間インキュベートします。</li>
		<li>PFAを除去し、室温で1x PBSで外植体を3回洗浄します。培養膜から外植体を採取するには、小さなスプリングボウハサミを使用して組織片を含む膜の周りに小さな切り込みを入れ、鉗子を使用して膜と一緒に組織を48ウェル培養プレートに移します。 注:固定後に組織が浮遊している場合は、200 μLのピペットで吸引し、さらに処理するために48ウェルプレートに移します。膜からの組織の強制的な剥離を避けてください。</li>
		<li>コラーゲン液滴培養では、鉗子を使用してコラーゲン滴全体をシリコンプレートに移します。200 μLの1x PBSを加え、鉗子を使用してコラーゲンを除去してから、組織を48ウェル培養プレートに移します。</li>
		<li>0.3%Tween-20(PBST)を添加した1 mLの1x PBSを室温で30分間移植片に透過処理します。外植体を200 μLのブロッキングバッファー(10%ヤギ血清+ 1%ウシ血清アルブミンPBST溶液)で室温で1時間インキュベートします。</li>
		<li>外植体を200 μLの一次抗体溶液(1:300、ブロッキングバッファー中)で4°Cで一晩インキュベートします。 一次抗体溶液を除去し、外植片をPBSTで5 x 20分徹底的に洗浄します。</li>
		<li>外植体を200 μLのファロイジンおよび二次抗体溶液(ブロッキングバッファー中)とともに、室温、暗所で1時間インキュベートします。ファロイジンと二次抗体溶液を除去し、外植片をPBSTで5 x 20分徹底的に洗浄します。 注:二次抗体の濃度と洗浄時間は、個々のイメージングアプリケーションごとに決定する必要があります。超解像顕微鏡を用いたイメージングでは、通常、二次抗体の濃度を1:500から1:200に増やし、ファロイジンの濃度を1:400から1:200に上げます。</li>
		<li>外植片をDAPI溶液(PBSTで1:1000)で室温で15分間インキュベートします。DAPI溶液を取り出し、外植片をPBSTで3 x 5分洗浄します。</li>
		<li>封入剤を使用して、BPが上向き(カバーガラスに対して)を向いたスライドに外植片を取り付けます。共焦点イメージングには、退色防止マウントメディアを使用します。封入剤を室温の暗所で一晩乾燥させます。直接画像化するか、画像化までスライドを4°Cで保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>SEM分析のためのオトト固定<ol><li>すべての溶液を新鮮に準備し、地域の安全ガイドラインに従って取り扱います。膜培養外植片(ステップ4.1.4から)を、3 mM CaCl 2を含む0.1 Mカコジル酸ナトリウムバッファー(pH 7.3)中の2.5%グルタルアルデヒドに固定します。4°Cで24〜72時間固定を行い、24時間ごとに固定液を交換します。</li>
		<li>固定液を取り出し、0.1 Mカコジル酸ナトリウムで組織を室温で3 x 5分洗浄します。1%OsO 4(0.1 Mカコジル酸ナトリウムバッファーを使用して4%OsO4ストックから希釈)で室温で1時間二次固定します。ドラフトで脱水するまで、これと後続の手順を実行します。</li>
		<li>0.1 Mカコジル酸ナトリウムバッファーを使用して、室温で3 x 5分間すすぎます。その後、室温で3 x 5分間二重蒸留水または超純水ですすいでください。</li>
		<li>チオカルボヒドラジド(TCH)の超純水に0.5%溶液を調製します。75°Cで10分間攪拌し、室温に冷却されたら溶液をろ過します。 注:TCHは非常に危険です。使用は地域の安全委員会の承認が必要であり、取り扱いには注意が必要です。</li>
		<li>サンプルから超純水を除去し、0.5%TCHを滴ずつ添加します。溶液が褐色に変わったら、サンプルを停止して超純水ですすぎ、0.5%TCH溶液を慎重に添加してください。溶液が明らかになったら、0.5%TCHに置き換えます。室温で20分間インキュベートします 30,31.</li>
		<li>室温で3 x 5分間超純水でサンプルをすすぎます。手順4.2.2、4.2.3、および4.2.5をさらに4回繰り返し、OsO4 インキュベーションとそれに続くすすぎで終了します。</li>
		<li>エタノールシリーズのサンプルを100%無水エタノール(EtOH)に脱水します。最初に25%ETOHで10分間インキュベートし、次に50%ETOHで10分間、75%EtOHで10分間、95%ETOHで10分間インキュベートした後、100%ETOHでそれぞれ合計3倍で10分間インキュベートします。</li>
		<li>液体CO2を用いて臨界点乾燥を行う。すぐにサンプルを両面カーボン粘着テープでSEMスタブに取り付けます。スパッタコートに進み、5〜10nmのコーティングを提供します。すぐにイメージングしない場合は、真空下でサンプルをデシケーターに保管してください。</li>
	</ol></li>
</ol>

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著者は、開示する競合する利益を持っていません。

ひよこは、実験室が内耳の研究に使用できるモデル生物への費用効果が高く便利な追加です。ここで説明されている方法は、私たちの研究室で日常的に使用されており、哺乳類の内耳で進行中の研究を補完します。ovoでは、エレクトロポレーションは、ニワトリゲノムに遺伝子操作を導入するために使用されます。エレクトロポレーションはまた、特定の細胞小器官または細胞内構造を標的とする蛍光タンパク質をコードする構築物を導入するためにも使用することができる35,36。これは簡単な手順ですが、卵子の胚の操作は生存率に影響を与えます。効率的なエレクトロポレーションのためには、卵は新鮮に調達する必要があります(産卵後すぐに)。死亡率の上昇および/または異常な発育は、5日以上保存された卵で頻繁に観察されます。滅菌技術の使用、卵が水分を失わないように卵が適切に密封されていることを確認し、胚に対して行われる操作を最小限に抑えることで、生存能力が向上します。
E3.5からE...

すべての脊椎動物の内耳は、耳のプラコード1,2として知られる単純な上皮に由来します。これにより、聴覚とバランスの知覚に関連する機械感覚情報を伝達するために必要なすべての構造要素と細胞型が生じます。内耳の繊毛センサーである有毛細胞(HC)は、支持細胞(SC)に囲まれています。HCは、第8脳神経のニューロンを介して聴覚後脳に情報を中継します。これらも耳プラコード3から生成される。音の一次伝達は、機械的に敏感な毛束4を介して、聴覚HCの頂端表面で達成される。これは、立体繊毛と呼ばれる修飾されたアクチンベースの突起を介して媒介され、それらは傾斜した階段パターン5に配置されています。さらに、キノシリウムと呼ばれる修飾一次繊毛は、毛束形成を組織し、ステレオ繊毛の最も高い列に隣接しています6,7,8。ステレオ繊毛の構造は、音響エネルギーに由来する機械的刺激を電気的神経信号に変換するこの役割にとって重要です9。加齢、感染、耳音響外傷、または耳毒性ショックによる聴覚HCの損傷は、哺乳類では不可逆的な部分的または完全な難聴を引き起こす可能性があります10。
そのような損傷を修復する可能性のある細胞補充療法が提案されている11,12。この研究のアプローチは、哺乳類の有毛細胞の正常な発達を理解し、内耳13内に存在する可能性のある前駆細胞で発生プログラムを再開できるかどうかを尋ねることでした。第2のアプローチは、哺乳類の外側、鳥類などの聴覚有毛細胞の強力な再生が起こる非哺乳類の脊椎動物に目を向けることでした14,15。鳥類では、有毛細胞の再生は、主に支持細胞の前駆細胞様状態への脱分化、続いて非対称有糸分裂によって有毛細胞および支持細胞16を生成することによって起こる。また、有毛細胞を生成する支持細胞の直接分化も認められている17。
鳥類の聴覚発達のメカニズムは哺乳類のそれと有意な類似性を示していますが、違いがあります18。ニワトリBPにおけるHCおよびSC分化は、胚期(E)7日目から明らかになり、時間とともにより明瞭になる。E12によって、よくパターン化され、よく分極された脳底乳頭(BP)を視覚化することができ、E17によって、よく発達した有毛細胞を見ることができます19。これらの時点は、分化、パターン形成、極性、および有毛細胞の成熟のメカニズムへの窓を提供します。このようなメカニズムが保存されているか分岐しているかを理解することは、機械感覚有毛細胞の起源の深い相同性への洞察を提供するため、重要です。
ここでは、内耳器官の発達全体にわたる増殖、運命の特定、分化、パターン形成、維持などの細胞プロセスを研究するために、初期および後期の胚期に実行される一連の技術を示します。これは、外植片培養における内耳の発達を理解するための他のプロトコルを補完するものです20,21,22。まず、Ovoエレクトロポレーションを用いてE3.5耳嚢胞内のBP前駆体に外因性DNAまたはRNAを導入する方法について説明します。遺伝子操作は貴重な洞察を提供することができますが、このようにして生成された表現型は多面的であり、その結果、交絡する可能性があります。これは、細胞骨格リモデリングなどの基本的なプロセスが細胞分裂、組織形態形成、および細胞の特殊化において複数の役割を果たす後期の内耳発達に特に当てはまります。本研究では、外植体培養における薬理阻害のプロトコールを提示し、投与量や治療のタイミングや期間の制御に利点をもたらし、発生機構の正確な時空間操作を提供します。
小さな阻害剤の処理期間に応じて、さまざまな臓器培養方法を利用できます。ここでは、上皮の形態形成と細胞の特殊化に関する洞察を可能にする2つの臓器培養方法を示します。コラーゲンをマトリックスとして蝸牛管を培養する3D培養法は、発達中のBPの堅牢な培養とライブ可視化を可能にします。ステレオ繊毛の形成を理解するために、硬いマトリックス上で上皮組織を培養し、アクチン突起を自由に成長させる膜培養法を紹介します。どちらの方法でも、ライブセルイメージング、免疫組織化学、走査型電子顕微鏡(SEM)、細胞記録などのダウンストリーム処理が可能です。これらの技術は、鳥類の聴覚上皮の発生、成熟、再生を理解および操作するためのモデルシステムとしてひよこを効果的に使用するためのロードマップを提供します。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081061</td><td>High fidelity Cas9 protein</td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td>Rabbit polyclonal to GFP</td></tr><tr><td>Bovine Serumアルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Q12135</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン I、ラットテール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>クリティカルポイントドライヤー ライカ EM CPD300</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CUY-21 エレクトロポレーター</td><td>ネパジェンジメチル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DM5000B広視野顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、GlutaMAX サプリメント、ピルビン酸</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #55 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>ファスト グリーン FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>FLUOVIEW 3000 レーザー走査型顕微鏡</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド (25 %)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG 二次抗体、Alexa Fluor 488</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG 二次抗体抗体、Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11032</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG二次抗体、Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清 滅菌済み</td><td>HiMedia</td><td>RM10701</td><td>熱不活性化</td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液(HBSS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>LSM980 Airyscan顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミリセル細胞培養インサート、30 mm、親水性 PTFE、0.4 & マイクロ;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>MVX10 実体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MYO7A 抗体</td><td>DSHB</td><td>138-1</td><td>マウスモノクローナル - 型破りなミオシン-VIIa</td></tr><tr><td>MZ16 解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 サプリメント (100X)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>ノイズハサミ, 14cm (5.5'')</td><td>World Precision Instruments</td><td>501237</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム (4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PC-10 プーラー</td><td>成重</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcU6_1sgRNA</td><td>Addgene</td><td>92395</td><td>ミニベクター 改変鶏 U6 プロモーター</td></tr><tr><td>ペニシリン G ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934 SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム緩衝液、0.2M</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム塩化物</td><td>HiMedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>スプッタ コーター K550X</td><td>Emitech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>標準ガラス キャピラリー 3 インチ、外径 1.0 mm、フィラメントなし</td><td>世界の精密機器</td><td>1B100-3</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>MERLIN コンパクト VP</td><td>ツァイ</td><td></td><td></td></tr>ス <tr><td>チオカルボヒドラジド</td><td>アルファ エーザー</td><td>L01205</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P1379</td><td></td></tr></tbody></table>

鳥類の内耳の発達を研究するためのovoおよびex ovoの方法

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

内耳は音を知覚し、蝸牛と前庭を使用してバランスを維持します。これは、有毛細胞として知られる専用の機械感覚細胞タイプを使用して行われます。内耳の基礎研究は、有毛細胞がどのように機能するか、そして調節不全がどのように難聴やめまいにつながるかについての深い理解につながりました。この研究では、マウスが卓越したモデルシステムとなっています。しかし、マウスは、すべての哺乳類と同様に、有毛細胞を置き換える能力を失っています。したがって、内耳機能を回復するための細胞療法を理解しようとするとき、他の脊椎動物種での補完的な研究はさらなる洞察を提供する可能性があります。鳥の聴覚上皮である脳底乳頭(BP)は、支持細胞(SC)によって挿入された機械感覚有毛細胞(HC)で構成される上皮のシートです。脳底乳頭と哺乳類の蝸牛の解剖学的構造は異なりますが、内耳の発達と聴覚の分子メカニズムは似ています。これにより、脳底乳頭は比較研究だけでなく、再生を理解するための有用なシステムになります。ここでは、鶏内耳の解剖・操作技術について述べる。この手法は、遺伝的および低分子阻害法を示しており、内耳発生の分子メカニズムを研究するための強力なツールを提供します。本稿では、CRIPSR-Cas9欠失を用いて脳底乳頭を遺伝的に摂動させ、その後脳底乳頭を解剖する ovo エレクトロポレーション技術について議論する。また、BP臓器培養と培養マトリックスの最適な使用を実証し、上皮と有毛細胞の発達を観察します。

エレクトロポレーションのセットアップでは、電極の位置決めがトランスフェクションの領域で役割を果たすことができます。正極は卵黄の下に、負極は胚の上に配置されます(図1A)。これにより、内耳の大部分と両前庭器官(図1B)、および聴覚脳底乳頭(図1C、D)でGFP発現が高くなり、トランスフェクションが確認されます。
CRISPRノックダウンの表現型を評価する際に、有毛細胞転写因子Atonalホモログ1(Atoh1)へのガイドRNAを設計しました。Atoh1のマウス変異体は有毛細胞を形成することができない32;Atoh1ガイドRNAのエレクトロポレーションとE10までのインキュベーション後、コントロール、空のプラスミドコントロールと比較するとHC発生が損なわれることがわかりました(図2</s...

ひよこは、さまざまな研究のために費用効果が高く、アクセスしやすく、広く利用可能なモデル生物です。ここでは、鳥類の内耳の発達と再生の根底にある分子メカニズムを理解するための一連のプロトコルが詳述されています。

鳥類の内耳の発達を研究するためのOvoおよびEx Ovoの方法

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

年齢、感染症、耳毒性薬は内耳の有毛細胞の変性を引き起こす可能性があり、それは私たちの中で難聴につながります。ひよこなどの非哺乳類脊椎動物では、有毛細胞を再生することができます。ここで説明する技術は、ニワトリ胚に取り組むことの費用対効果、胚の入手の容易さ、および組織外植片の良好な外出発達を利用している。鳥類の内耳毛の発達と再生を理解することは、難聴と潜在的な治療法に関する重要な洞察を提供することができ、外植片培養は、さまざまな薬物の耳毒性効果を評価するために重要になる可能性があります。実験を開始する前に、産みたての卵を調達し、汚染を防ぐために70%エタノールで洗浄してください。卵を摂氏37〜48度、湿度45%で3.5〜4日間インキュベートします。孵卵後、卵を横に5分間置き、胚を卵黄の上に再配置します。次に、鉗子を使用して卵の上部に小さな穴を開け、21ゲージの針が通過するように卵の端を鈍くします。5ミリリットルの注射器と21ゲージの針を使用して、卵の鈍い端の穴から2ミリリットルのアルブミンを取り除きます。透明なテープを使用して鈍い端の穴を覆います。卵窓を作るには、卵殻の上部に透明なテープを貼り付けます。垂直ピペットプーラーを使用して、標準的なガラス毛細血管からのマイクロインジェクションから針を保持します。引っ張った後、細い鉗子を使用して毛細管先端を切り離し、先細りの端を持つ約50マイクロメートルの先端直径を得る。遺伝子ノックアウト実験では、ガイドプラスミドpcU6.1sgRNA、T2KeGFP、T2TPの3つのコンストラクトを1対1の比率で、1マイクログラムのSP Cas9タンパク質、30%スクロース、0.1%ファストグリーン色素と混合し、最終容量は10マイクロリットルです。複数のプラスミドをエレクトロポレーションする際に、DNAの最終濃度がマイクロリットルあたり少なくとも4マイクログラムであることを確認してください。スプリングボウハサミの助けを借りて、長さ2センチ、幅1.5センチの窓の周りを切り開き、胚を露出させます。次に、鉗子を使用して胚の上にある絨毛膜を開き、胚にアクセスできるようにします。約200ナノリットルのDNA溶液混合物を注入して、耳小胞を満たします。ガイドRNA効率を決定するために、T7エンドヌクレアーゼアッセイを行う。胚に0.719%生理食塩水滴を加えて電気抵抗を下げ、過熱を防ぎます。次に、卵の鈍い側に作られた穴に正極を通し、卵黄の下になるように電極を操作します。満たされた耳嚢胞の上に負極を置きます。エレクトロポレーションでプラスミドを耳小胞にトランスフェクトするには、方形パルス発生器を使用し、25ボルトの5つのパルスをそれぞれ100ミリ秒、50ミリ秒間隔で印加します。個々のエレクトロポレーション設定に基づいて経験的に条件を決定します。エレクトロポレーション後、0.719%生理食塩水を数滴加えて胚を水和させます。卵を透明なテープで再密封し、さらに孵卵するために摂氏37〜38度で加湿インキュベーターに戻します。手術台、顕微鏡ステージ、およびその周辺を70%エタノールと熱、またはアルコールを使用して消毒し、最小限のスプリングボウハサミ、マイクロキュレット、および2組の細かい鉗子を含むマイクロ解剖装置を滅菌します。黒いシリコンベースのガラスペトリ皿、90ミリメートルのプラスチック製のペトリ皿、および60ミリメートルのペトリ皿を含む解剖プレートを準備します。冷やしたPBSまたはHBSSとしても知られるハンクスのバランスの取れた塩溶液を解剖の準備をしてください。卵を90ミリメートルのペトリ皿にそっと割る。次に、ひよこの外耳を特定し、氷のように冷たいPBSで満たされた60ミリメートルのペトリ皿に頭を移します。次に、くちばしの上部を内側に向けて胚の向きを変え、5番の鉗子の1つを使用してくちばしを保持します。2番目の5番目の鉗子を使用して目をすくい取ります。次に、吻側から尾側まで、正中線に沿って頭蓋骨に沿って切り、脳をすくい取ります。氷のように冷たいPBS(HBSS)を追加し、ラゲナの2つの耳石を光沢のある構造として蝸牛管の端と正中線の近くに配置します。2つの内耳を隔離するには、2つのラゲナの間、および領域の上下を切ります。次に、斜めの照明の下で内耳の輪郭を視覚化し、無関係な組織と前庭を取り除きます。単離した蝸牛を、氷冷PBSを備えた黒色のシリコンベースプレートに移します。5番鉗子を使用して軟骨性蝸牛カプセルを剥がし、蝸牛管を取得します。次に、蝸牛管の起伏のある層または被蓋を見つけ、55番の鉗子を使用してそれを取り除き、脳底乳頭またはBPを露出させます。次に、55番の鉗子を使用して有毛細胞と支持細胞を露出させるために構造膜を取り外します。脳底乳頭の膜培養には、6ウェル組織培養プレートを取り、1ウェルにつき1つの培養膜インサートを配置します。200マイクロリットルのピペットで培地を作成し、解剖した脳底乳頭外植片を1つのX HBSSバッファーで吸引します。外植体を膜に移し、脳底乳頭が上を向くように向きを変え、毛髪と支持細胞が上から見えるようにします。外植体が配置されたら、HBSS緩衝液を培養膜表面からゆっくりと吸引する。このプロセスでは、外植片は培養膜に付着します。メンブレンインサートとウェル壁の間に1.2ミリリットルのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM培養培地)を加えて、6ウェルプレートのウェルを満たします。蝸牛管のコラーゲン培養物を調製するために、新たに調製したコラーゲン混合物を4ウェルプレートの各ウェルに3滴加え、解剖した蝸牛管を各コラーゲン滴に移す。プレートを摂氏37度で10分間インキュベートし、5%二酸化炭素でコラーゲンマトリックスを硬化させます。培養物の低分子処理では、培養培地をペニシリンなどの薬理学的モジュレーターを添加した700マイクロリットルの培地に交換し、前述のようにプレートをインキュベートします。培養液の50%を毎日交換してください。適切なインキュベーション時間の後、培地を除去し、下流アッセイに外植片を使用します。エレクトロポレーションのセットアップでは、正しい電極の位置により、両方の前庭器官の内耳でより高いGFP発現が得られ、聴覚脳底乳頭がトランスフェクションを確認しました。CRISPR Cas9は、内耳におけるAtoh1遺伝子ノックアウトを媒介し、有毛細胞の喪失をもたらした。OvoエレクトロポレーションによるAtoh1遺伝子ノックアウトとそれに続くE10までのインキュベーションは、空のプラスミドコントロールと比較して有毛細胞の発達の減少を示しました。エレクトロポレーションはモザイクであるが、コントロールのエレクトロポレーション細胞は有毛細胞を形成することができた。Atoh1 gRNAエレクトロポレーションサンプルでは、緑色蛍光タンパク質陽性細胞は有毛細胞発生のマーカーを示さなかった。コラーゲンなどの3Dマトリックス中の脳底乳頭の臓器培養は、有毛細胞抗原に対する抗体による染色剤により、最大5日間組織形態の優れた保存を提供しました。有毛細胞および支持細胞の組織は、これらの培養条件において維持された。膜上の臓器培養は、毛束の完全性を維持しながら最大5日間維持することができます。これは、先端リンクタンパク質であるプロトカドヘリン15の局在化によって代表像に見ることができる。毛束の発達を調査するために、超解像顕微鏡や走査型電子顕微鏡などの高解像度イメージングは、より多くの情報を提供することができます。無菌状態は処置を通して維持されるべきです。エレクトロポレーション中は、胚が乾いていないことを確認してください。薬理学的阻害剤を滴定する場合、致死性を克服するために濃度を下げることができます。胚と外植片の両方をイメージング実験のために採取することができます。プロトコルに示されているように、リアルタイムのビデオ顕微鏡、または静的光共焦点電子顕微鏡を実行するかのいずれか。ニワトリ内耳外植片の使用の容易さとアクセスのしやすさを考えると、プルーフスクリーニングを通じて培地を使用して、有毛細胞の再生に不可欠な新しい分子を特定することができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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異所性発現は、脳の発達におけるマイクロRNAの役割を解明する一つの技術である。しかし、OVOエレクトロポレーションに使用して特定の領域を標的とすることは困難である。ここでは、選択的に腹側と背側中脳領域を電気穿孔するための効率的な方法を示しています。...

腹チック中脳マイクロRNAの発現OVO中

ここでは、神経と後脳における聴覚軸索線維の選択的なトレースのための初期のニワトリ胚の音響神経節への蛍光色素を注入し顕微解剖法を説明します。...

鳥類胚性内耳神経における聴覚繊維の選択的なトレース

発生中にニワトリの胚を見てアクセスすることは困難な場合があります。私たちは、シンプルで費用対効果が高く、教室や研究現場で簡単に使用できるex ovo法を開発しました。この方法は、胚発生の後期段階(HH...

最適化された元OVO開発の進んだ段階にニワトリ胚の培養

聴覚器官は聴覚を媒介します。ここでは、発育中のニワトリ聴覚器官における聴覚前駆細胞の増殖と分化を研究するために最適化された、修正されたin...

チキン聴覚器官への遺伝子導入によって、<em&gt;卵内</em&gt;マイクロエレクト​​ロポレーション

鳥類および哺乳動物の聴覚脳幹ニューロンは、正常な聴覚機能のための基本的なプロセスである高速神経エンコーディングに特化しています。これらのニューロンは、胚後脳の別個の前駆細胞から生じる。我々は、聴覚発達中の遺伝子機能を研究するために、ニワトリ胚の後脳における遺伝子を発現させるためにエレクトロポレーションを利用する技術を提示する。...

鶏の聴覚脳幹における卵の電気穿孔

今回、切片培養ニワトリ胚の器官を成長するプロトコル体外。このメソッドを使用すると、ニワトリ胚のティッシュの開発を学べる、文化環境の制御の高度を維持しながら。...

ニワトリ胚組織の開発培養法

ここでは、1つの脳幹スライス内のトノトピック特性と発生軌跡を調べるために、ニワトリ胚の非冠状聴覚脳幹スライスを取得するためのプロトコルを提示します。これらのスライスは、矢状、水平、および水平/横セクションを含み、従来の冠状セクションよりも個々のスライス平面内のより大きなトノトピック領域を包含する。...

胚性ニワトリ聴覚脳幹をスライスしてトノトピック勾配とマイクロ回路を評価する

私たちは標準的な聴覚脳幹応答(ABR)技術を使用し、聴覚機能のための早熟な鳥類モデルである孵化鶏に適用しました。このプロトコルは、動物の準備とABRの獲得技術を詳細に概説し、他の鳥類またはげっ歯類のモデルに翻訳できる手順を示しています。...

ニワトリ孵化子の聴覚脳幹応答の評価

このプロトコルは、マウス内耳組織の初心者ユーザーを対象としており、切片免疫染色のためのさまざまな発生段階でマウス内耳を処理する手順を包括的に詳しく説明しています。...

マウス内耳組織の凍結切片および免疫染色:胚期から成虫期まで

学ぶ鳥類の内耳発達と毛細胞再生の分子メカニズムを、ヒヨコ胚を用いたovoおよびex ovo電気穿孔法と組織培養技術で解明する方法。聴覚障害治療への応用可能性を探る。

鳥類の内耳の発達を研究するためのOvoおよびEx Ovoの方法

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