Name: マウスアストロサイトの単離と直接ニューロンリプログラミング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学ぶマウスアストロサイトの単離と直接ニューロンリプログラミング法。高純度培養と転写因子発現による機能的神経細胞への変換プロトコルを解説し、神経可塑性研究と神経変性疾患治療への応用可能性を示します。

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リプログラミングのためにコンストラクトをクローンしてくれたInes Mühlhahn、バイラル制作のためにPaulina Chlebik、原稿に対するコメントをしてくれたMagdalena GötzとJudith Fischer-Sternjakに感謝します。

<ol><li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+cell+type+composition+in+normal+and+Alzheimers+human+brains+is+revealed+using+integrated+mouse+and+human+single+cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18014(2020).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
<li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li>
<li>Nowakowski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+gene+expression+trajectories+reveal+developmental+hierarchies+of+the+human+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex.</a> Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).</li>
<li>Sagner, A., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+neuronal+diversity+in+the+spinal+cord%3A+a+time+and+a+place%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place.</a> Development. 146 (22), (2019).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+mouse+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the mouse nervous system.</a> Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).</li>
<li>Iismaa, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+regenerative+mechanisms+across+different+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues.</a> NPJ Regenerative Medicine. 3, 6(2018).</li>
<li>Lange, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+brain+regeneration+-+a+community+effort+of+fate-restricted+precursor+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).</li>
<li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).</li>
<li>Grade, S., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+replacement+therapy%3A+previous+achievements+and+challenges+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 29(2017).</li>
<li>Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+for+brain+repair-from+rescue+to+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming.</a> Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).</li>
<li>Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+reprogramming%3A+Fast+forward+from+new+concepts+toward+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches.</a> Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).</li>
<li>Di Tullio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCAAT%2Fenhancer+binding+protein+alpha+%28C%2FEBP%28alpha%29%29-induced+transdifferentiation+of+pre-B+cells+into+macrophages+involves+no+overt+retrodifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).</li>
<li>Fishman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+divisions+are+not+essential+for+the+direct+conversion+of+fibroblasts+into+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells.</a> Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biology. 8 (5), 1000373(2010).</li>
<li>Treutlein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+direct+reprogramming+from+fibroblast+to+neuron+using+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq.</a> Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242 (4877), 405-411 (1988).</li>
<li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1%2F2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li>
<li>Berninger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+neurons+derived+from+in+vitro+reprogrammed+postnatal+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia.</a> Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).</li>
<li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+conversion+of+terminally+differentiated+hepatocytes+to+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li>
<li>Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+cytoarchitectonic+distribution+of+neurons%2C+glia%2C+and+DNa+in+rat+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex.</a> The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).</li>
<li>Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+heterogeneity+across+the+brain+and+spinal+cord+occurs+developmentally%2C+in+adulthood+and+in+response+to+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination.</a> PLoS One. 12 (7), 0180697(2017).</li>
<li>Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%3A+toward+an+understanding+of+the+development+and+evolution+of+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li>
<li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+region-specific+astrocyte+subtypes+at+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution.</a> Nature Communication. 11 (1), 1220(2020).</li>
<li>Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+astrocyte+transcriptome+from+multiple+regions+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain.</a> Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).</li>
<li>Ohlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diversity+of+diencephalic+astrocytes+reveals+adult+astrogenesis+regulated+by+Smad4%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4.</a> The EMBO Journal. 40 (21), 107532(2021).</li>
<li>Herrero-Navarro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+and+neurons+share+region-specific+transcriptional+signatures+that+confer+regional+identity+to+neuronal+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming.</a> Science Advances. 7 (15), (2021).</li>
<li>Kempf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+neurons+reprogrammed+from+spinal+cord+astrocytes+by+the+proneural+factors+Ascl1+and+Neurogenin2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2.</a> Cell Reports. 36 (3), 109409(2021).</li>
<li>Mattugini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+Different+Neuronal+Subtypes+from+Astrocytes+in+the+Injured+Mouse+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex.</a> Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).</li>
<li>Heins, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+generate+neurons%3A+the+role+of+the+transcription+factor+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6.</a> Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).</li>
<li>Masserdotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mechanisms+of+proneural+factors+and+REST+in+regulating+neuronal+reprogramming+of+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).</li>
<li>Rao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+Ascl1-mediated+astrocyte-to-neuron+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).</li>
<li>Gascon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+successful+negotiation+of+a+metabolic+checkpoint+in+direct+neuronal+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).</li>
<li>Russo, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+induction+of+neuron-enriched+mitochondrial+proteins+boosts+direct+glia-to-neuron+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonstochastic+reprogramming+from+a+privileged+somatic+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state.</a> Cell. 156 (4), 649-662 (2014).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-restrict+astrocytes+exhibit+heterogeneous+susceptibility+to+neuronal+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).</li>
<li>Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+generation+of+glia+is+a+major+astrocyte+source+in+postnatal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex.</a> Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).</li>
<li>Price, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ink4a%2FArf+locus+is+a+barrier+to+direct+neuronal+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).</li>
<li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunoaffinity-based+method+for+isolating+ultrapure+adult+astrocytes+based+on+ATP1B2+targeting+by+the+ACSA-2+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).</li>
</ol>

著者は利益相反がないと宣言しています。

マウスアストロサイトの初代培養物は、直接ニューロンのリプログラミングを研究するための注目すべきin vitroモデルシステムである。実際、出生後の段階で単離されるにもかかわらず、細胞は典型的なアストロサイトマーカー29を発現し、パターニング遺伝子28、29の発現を保持し、増殖する能力を維持し、同等の年齢におけるインビボアストロサイトと同様に38である。MACS媒介性単離後、細胞は最初にフラスコに接着し、次いで増殖し始め、高度に濃縮されたアストロサイト培養物29を生じる。重要なことに、培養アストロサイトは多能性細胞状態に脱分化せず、不死化することもない。さらに、それらはレポータータンパク質(例えば、DsRedまたはGFP)の発現に続いて自発的にニューロンを生成するのではなく、アストロサイト同一性を維持する。また、それらは無期限に増殖するのではなく...

哺乳類の中枢神経系(CNS)は非常に複雑であり、膨大な数の異なるニューロンサブタイプ1、2、3、4、5、6を含む何百もの異なる細胞型からなる。他の器官または組織7、8、9とは異なり、哺乳動物CNSは非常に限られた再生能力を有する。外傷性脳損傷または神経変性に続くニューロン喪失は不可逆的であり、しばしば運動的および認知的欠損をもたらす10。脳機能を救うことを目指して、失われたニューロンを置き換えるためのさまざまな戦略が、激しい調査を受けている11。その中で、体細胞を機能的ニューロンに直接リプログラミングすることは、有望な治療的アプローチとして浮上している12。直接リプログラミング、または分化転換は、中間増殖性または多能性状態を経ることなく、1つの分化した細胞型を新しい同一性に変換するプロセスである13、14、15、16。線維芽細胞を筋細胞に変換するのに十分な因子としてのMyoD1の同定によって先駆的に開発された17,18、この方法は、いくつかの細胞型を機能的ニューロンに再プログラムするために首尾よく適用されてきた19、20、21。
アストロサイトは、CNS22、23において最も豊富なマクログリアであり、いくつかの理由から、直接ニューロンリプログラミングのために特に有望な細胞型である。第一に、それらはCNS全体に広く均等に分布しており、新しいニューロンのための豊富なロコ源を提供する。第2に、アストロサイトとニューロンは、胚発生中に共通の祖先、放射状グリア細胞24を共有するように、発達的に密接に関連している。2つの細胞型の共通の胚起源は、異なる胚葉からの細胞のリプログラミングと比較してニューロン変換を促進するようである19、21。さらに、その放射状グリア起源を介してアストロサイトによって受け継がれるパターニング情報は、成体アストロサイト25、26、27においても維持され、かつ、局所的に適切なニューロンサブタイプ28、29、30の生成に寄与するようである。したがって、アストロサイトのニューロンへの変換を調査および理解することは、細胞ベースの置換戦略のためのこの技術の可能性を最大限に引き出すための重要な部分です。
インビトロ培養アストロサイトのニューロンへの変換は、直接ニューロンリプログラミングの分野において、i)アストロサイトからニューロンを生成するのに十分な転写因子の同定15、19、31、ii)同じ細胞コンテキストにおける異なるリプログラミング因子によって引き起こされる分子機構の解明を含むいくつかのブレークスルーをもたらした32iii)異なるニューロンサブタイプの誘導に対するアストロサイトの発達起源の影響を強調する28、29、33。さらに、アストロサイトのインビトロ直接変換は、活性酸素種(ROS)産生の増加34およびアストロサイトとニューロン35のミトコンドリアプロテオームの違いなど、直接ニューロンリプログラミング34、35を制限するいくつかの主要なハードルを解明した。したがって、これらの観察は、細胞同一性の維持、細胞の運命の変化を防ぐ障害、およびリプログラミングにおける代謝の役割に関連する生物学12におけるいくつかの基本的な問題を調査するための直接ニューロンリプログラミングのモデルとしてのアストロサイトの初代培養の使用を強く支持する。
ここでは、マウス脊髄29からアストロサイトを単離することによって実証されるように、出生後(P)年齢のマウスから非常に高い純度でアストロサイトを単離するための詳細なプロトコルを提示する。また、ウイルス形質導入またはDNAプラスミドトランスフェクション を介して アストロサイトをニューロンに再プログラムするためのプロトコルも提供しています。リプログラミングされた細胞は、形質導入後7日間(7DPT)で分析して、リプログラミング効率やニューロン形態などのさまざまな側面を評価するか、または数週間培養中に維持して経時的な成熟を評価することができます。重要なことに、このプロトコルは脊髄アストロサイトに特異的ではなく、皮質灰白質、中脳、小脳を含む様々な他の脳領域からアストロサイトを単離するために容易に適用することができる。

<table><tbody><tr><td>0.05% トリプシン/EDTA</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>4', 6-ジアミジノ-2-フェニンドール, ジラクテート (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウス IgG1 アレクサ 647</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A21240</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウス IgG1 ビオチン</td><td>サザンバイオテック</td><td>Cat# 1070-08;RRID: AB_2794413</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス IgG2b Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギ Alexa 546</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences</td><td>Cat# 18606-20</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technologies</td><td>13256029</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# A9418</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0260</td><td></td></tr><tr><td>C-Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5499</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Dako</td><td>Cat# Z0334;RRID: AB_100013482</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025050</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Life Technologies</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 (トランスフェクション試薬)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 11668019</td><td></td></tr><tr><td>MACSスマートストレーナー70&micro;m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS セパレータ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗 ACSA-2 MicroBeat キット&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-678</td><td></td></tr><tr><td>マウス IgG1 抗シナプトフィジン 1</td><td>シナプティックシステム</td><td>Cat# 101 011 RRID:AB_887824)</td><td></td></tr><tr><td>マウス IgG2b 抗 Tuj-1 (&beta;III-tub)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8660</td><td></td></tr><tr><td>MS カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>NT3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>octoMACS セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM &ndash;GlutaMAX (血清還元培地)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>Cat# 51985-026</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1149</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-RFP</td><td>Rockland</td><td>Cat# 600-401-379;RRID:AB_2209751</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗Sox9</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>猫#AB5535;RRID:AB_2239761</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン アレクサ 405</td><td>サーモフィッシャー</td><td>Cat# S32351</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# T9284</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスアストロサイトの単離と直接ニューロンリプログラミング

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

直接ニューロンリプログラミングは、多能性中間体を介さずに異なるスターター細胞集団から機能的ニューロンを生成する強力なアプローチです。この技術は、例えば、神経変性疾患に罹患している患者の線維芽細胞をニューロンに変換することを可能にするため、疾患モデリングの分野で大きな可能性を秘めているだけでなく、細胞ベースの補充療法の有望な代替手段でもある。この文脈において、主要な科学的ブレークスルーは、アストロサイトなどの中枢神経系内の分化した非神経細胞が、 インビトロで機能的ニューロンに変換できることの実証であった。それ以来、アストロサイトのニューロンへの インビトロ 直接リプログラミングは、強制的な同一性変換の根底にある分子メカニズムと、効率的なリプログラミングを妨げるハードルに関する実質的な洞察を提供してきました。しかし、異なるラボで行われた in vitro実験の結果は、アストロサイトの単離、培養、および再プログラムに使用される方法の違いにより、比較が困難です。ここでは、出生後のマウスの中枢神経系の異なる領域から、磁気細胞選別 を介して 高純度のアストロサイトを確実に単離・培養するための詳細なプロトコールについて述べる。さらに、培養したアストロサイトをウイルス形質導入またはDNAトランスフェクション を介して ニューロンに再プログラムするプロトコルも提供しています。この合理化され標準化されたプロトコルは、細胞同一性の維持、新しいニューロン同一性の確立、ならびに特定のニューロンサブタイプの生成およびそれらの機能的特性の根底にある分子メカニズムを調査するために使用することができる。

アストロサイトの初代培養物は、典型的には、MACソーティングおよびプレーティング後7〜10日の間に80%〜90%のコンフルエンシーに達する(図1B)。一般に、単一のT25培養フラスコは約1〜1.5 x106 細胞を生成し、これはウェルあたり5〜5.5 x104 細胞の密度で細胞を播種する場合、20〜30カバースリップに十分である。めっきの翌日、細胞は通常、カバースリップ表面の50%〜60%を覆う(図1C)。この段階では、培養物はほぼ独占的にアストロサイトで構成されていますが、神経芽細胞などの他の細胞型は事実上存在しません(図1D)29。
初期化因子は、レトロウイルスまたはレンチウイルスの形質導入またはDNAプラスミドのトランスフェクションのいずれかを介してアストロサイトに送達することができる。通常...

ここでは、出生後マウスの中枢神経系のさまざまな領域に由来するアストロサイトの高度に濃縮された培養物を生成し、転写因子の強制発現によって機能的ニューロンに直接変換するための詳細なプロトコルについて説明します。

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...

アストロサイトは、直接的なニューロンプログラミングの対象となる興味深い自生集団です。このプロトコルは、異なる領域または中枢神経系から高純度の培養アストロサイトを単離するための信頼できる技術を提供します。このプロトコルは、異なるスタートアップ集団のアストロサイトの純度の違いなどの交絡因子なしに、アストロサイトが機能ニューロンに再プログラムされる能力を調査するように設計および最適化されています。手順のデモンストレーションは、研究室のポスドクであるボブ・ハースバッハと、私たちの研究室の技術支援であるタチアナ・サイモンによって行われます。まず、安楽死させたマウスの胴体を35ミリメートルのペトリ皿に入れ、氷の上に置きます。ハサミで皮膚を開き、小さなハサミで椎骨を取り除きます。次に、脊髄を抽出し、氷上の解剖バッファーに入れます。倍率2倍の定位解剖顕微鏡で、鉗子を用いて単離した脊髄から髄膜を除去し、解剖して洗浄した脊髄組織をCチューブに移した。神経組織解離キットから50マイクロリットルの酵素Pと、事前に調製した酵素ミックス30マイクロリットルを各Cチューブに加えます。Cチューブを反転させ、加熱された解離した上に置き、すべての組織がチューブの蓋に集められるようにします。800マイクロリットルのアストロサイト培養培地を添加してカラムをセパレータから取り外し、付属のプランジャーで細胞をカラムから押し出すことにより、細胞を逃がします。予め調製した培養フラスコ中の平板細胞に、1ミリリットル当たり10ナノグラムのEGFおよびbFGFを添加した4.2ミリリットルのアストロサイト培養培地を添加する。他の脳領域から単離された星状細胞のために培養フラスコをコーティングする必要はありませんが、脊髄から単離された星状細胞のためのより良い基質を提供します。摂氏37度、二酸化炭素5%で細胞を培養します。安全レベル1の生物学的安全キャビネットの下でアストロサイトの着座を行い、テキスト原稿に記載されているように、Poly-D-リジンコーティングされたガラスカバースリップで24ウェルプレートを準備します。プレーティングのために、P2マウスから6つの脊髄を単離すると、約100万個の細胞が得られます。培養したアストロサイトを含むT-12.5培養フラスコから培地を吸引し、1x PBSで1回洗浄します。0.5ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAを加えてアストロサイトを培養フラスコから剥離し、摂氏37度で5分間インキュベートします。フラスコの側面を軽くたたいて培養フラスコ表面から細胞を放出し、倍率10倍の明視野顕微鏡で剥離を確認します。2.5ミリリットルの星状細胞培養液でトリプシン化を停止し、15ミリリットルのチューブに細胞懸濁液を採取します。摂氏4度で5分間300RCFで遠心分離します。上清を吸引し、1ミリリットルのアストロサイト培養液に細胞を再送する。血球計算盤または自動細胞計数システムを使用して細胞濃度を計算します。細胞数に基づいて、EGFおよびbFGFを添加した新鮮な星状細胞培地で細胞懸濁液を1因子当たり1ミリリットル当たり10ナノグラムで希釈する。500マイクロリットルの細胞懸濁液を、予め調製した24ウェルプレートの各ウェルに加え、37°Cおよび5%二酸化炭素で細胞を培養する。49ミリリットルの塩基性培養培地に1ミリリットルのB27サプリメントを加えて、神経分化培地を調製します。24〜48時間後、細胞が形質導入されたか形質導入されたかに応じて、アストロサイト培地を1ウェルあたり1ミリリットルのニューロン分化培地と交換します。9%二酸化炭素で摂氏37度で細胞を培養します。再プログラミング効率を高めるには、アストロサイト培地を分化培地に置き換えるときに、ニューロン分化培地にフォルスコリンとドルソモルフィンをそれぞれ最終濃度30マイクロモルと1マイクロモルまで補充します。細胞をフォルスコリンとドルソモルフィンで処理することを選択した場合は、最初の治療の2日後に2回目の投与のドルソモルフィンを提供します。この2番目の処理を培地に直接加えます。アストロサイトの初代培養は、磁気支援細胞ソーティングおよびプレーティング後7〜10日で80〜90%のコンフルエンシーに達しました。メッキの翌日、セルは通常、カバースリップ表面の50〜60%を覆っていました。この段階では、培養物は主に星状細胞で構成されていましたが、神経芽細胞などの他の細胞型は事実上存在しませんでした。形質導入またはトランスフェクションの7日後に、誘導された神経細胞は星状細胞と明確に区別できました。ニューロン細胞ソーマは、再プログラムされていないアストロサイトよりも小さく、長い突起があり、ニューロンマーカー、ベータ3チューブリン、アストロサイトマーカーGFAPに対して陰性でした。形質導入またはトランスフェクション後21日目に、多くの誘導ニューロンは活動電位を発火させることができ、成熟ニューロンマーカーNeuNおよび汎シナプスタンパク質シナプトフィジンに対して陽性であった。関心領域を適切に分析することが不可欠です。周囲の組織からの汚染を避けます。髄膜と背根神経節を孤立した脊髄から取り除くように注意する必要があります。この方法は、大脳皮質、背側中脳、小脳など、中枢神経系のさまざまな領域から星状細胞を分離するために使用できます。将来的には、この技術により、局所アストロサイトとその機能ニューロンへの再プログラムの可能性に関する知識を広げることができます。

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JoVE Journal

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神経科学

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出典: Pereira, M. et al., In Vivo Direct Reprogramming of Resident Gial Cells into Interneurons by Intentrebral Injection of Viral Vectors.J. Vis.

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成体マウス脊髄からの純粋なアストロサイトおよびミクログリアの単離(Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord for the In Vitro Assays and Transcriptomic Studies)

学ぶマウスアストロサイトの単離と直接ニューロンリプログラミング法。高純度培養と転写因子発現による機能的神経細胞への変換プロトコルを解説し、神経可塑性研究と神経変性疾患治療への応用可能性を示します。

マウスアストロサイトの単離と直接ニューロンリプログラミング

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